TRASCRIZIONE

TESTO: LEWINs GENES X, CAPITOLO 19 LEWIN IL GENE VIII, CAPITOLO 9

processo mediante il quale linformazione contenuta nel DNA (geni) viene trasferita allRNA

CLASSI DI RNA
UNIVERSALI
mRNA: codifica le proteine

tRNA: trasporto di aminoacidi per traduzione

rRNA: costituenti del Ribosoma

SPECIFICI DI EUCARIOTI

snRNA: (piccoli RNA nucleari): assistono durante lo splicing (spliceosoma)

altri snRNA modificano gli rRNA small RNA: microRNA, piwiRNA, siRNA RNA non codificante a funzione regolatoria (Nobel medicina 2006)

la TRASCRIZIONE operata dalla RNA polimerasi

stessa funzione dai batteri alluomo: caratteristiche e logica comune tipicamente proteine multisubunit alcune RNA pol. fagiche (T7 e SP6) e mitocondriali sono a singola subunit
batteri: singola RNA pol; RNA instabile (mRNA degradato rapidamente, rRNA, tRNA processati eucarioti: 3 RNA polimerasi Pol I, Pol II e Pol III; RNA viene modificato al 5' e al 3', complessato a proteine, sottoposto a taglio (rRNA, tRNA e SPLICING), esportato dal nucleo

DNA

RNA filamento CODIFICANTE: -orientamento 5-3 -stessa sequenza nel TRASCRITTO di RNA (U al posto di T) filamento STAMPO o TEMPLATE -costituisce lo STAMPO (viene usato per appaiare le basi) - complementare al trascritto

Ripasso della chimica degli acidi nucleici la trascrizione e unidirezionale: da 5-->3 , per aggiunta di nucleosidi 5 trifosfati al 3OH della catena crescente con formazione di legame fosfodiesterico

osservando la struttura di un GENE:

nucleotide +1 del DNA (del gene): corrisponde al primo ribonucleotide presente nel trascritto (start point) porzione a monte (upstream): contiene, quasi sempre, il promotore
porzione a valle (downstream): si trova la regione codificante (in eucarioti introni ed esoni) ed il terminatore unit trascrizionale: tratto di DNA compreso tra punto di inizio e terminatore per la RNA polimerasi (pu comprendere pi geni)

TRASCRIZIONE

riconoscimento legame complesso binario chiuso melting del DNA complesso binario aperto (isomerizzazione) polimerizzazione primi nt complesso ternario

inizio

allungamento
50 nt/s, 1 errore/104 nt incorporati

terminazione

processo diviso in pi tappe

RNA polimerasi
-utilizza ribonucleosidi 5-trifosfato (ATP, GTP, UTP e CTP) richiede Mg++
-inizia da singolo nt (non ha bisogno di innesco) -(NMP)n+ NTP (NMP)n+1+ PPi; PPi 2Pi

-ogni nucleotide selezionato in base alle regole della complementariet A:U e G:C e alla geometria della coppia di basi
-usa come stampo il filamento template del DNA

RNA polimerasi batterica

la macchina molecolare
enzima dotato di struttura quaternaria (multisubunit)

a2bbws

460 kDa

155 kDa 151 kDa 18/70 kDa 37 kDa 10 kDa w

RNA polimerasi batterica

struttura cristallografica (core enzima)

il nucleo o core enzima:

in grado, in linea di principio, di iniziare la Tx da qualsiasi punto della molecola di DNA lenzima (basico) ha affinit generale per qualunque sequenza casuale di DNA (acido), ove si lega con bassa stabilit (emivita minuti)

in vivo nella cellula batterica:

la polimerasi inizia la tx solo da particolari sequenze localizzate a monte dello start point dette PROMOTORI.

come si spiega questo paradosso?

 laggiunta del fattore di inizio, detto SIGMA, che converte il core enzima nella forma, OLOENZIMA, in grado di iniziare SOLO DAI PROMOTORI.

sigma destabilizza i legami aspecifici del core enzima e conferisce specificit per i promotori loloenzima ha una affinit per i promotori 1000 volte superiore a quella del core
(emivita 30-60 ore)

in una cellula di E.coli circa 7000 molecole di RNA polimerasi

1/3 delle RNA polimerasi sono sotto forma di oloenzima in parte legati a siti aspecifici in parte ai promotori

1/2 dei core enzima sono impegnati nella trascrizione

sigma in eccesso rispetto ai core enzima

come studiare le sequenze di DNA coinvolte nel legame con la polimerasi

DNA footprinting allineamento sequenze a monte start point (sequenza consenso)

DNA footprinting
DNA + DNAsi DNA + proteina + DNAsi

* * * * *

* * * * * * * tagli in tutte le tagli solo dove possibili posizioni non legata la proteina

* * * * * * * *

impronta

come sono i promotori?

lallineamento delle sequenze geniche a monte dello start point hanno permesso di evidenziare delle corte regioni conservate (circa 6 bp)

SEQUENZA CONSENSO
sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per ciascuna posizione indicato il nucleotide/aa che si trova con maggior frequenza (pi spesso) quando vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali

SEQUENZA CONSENSO
sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per ciascuna posizione indicato il nucleotide/aa che si trova con maggior frequenza (pi spesso) quando vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali
T77A100 T77A61A84T100 Pur

SEQUENZA CONSENSO
sequenza nucleotidica o proteica IDEALE in cui per ciascuna posizione indicato il nucleotide/aa che si trova con maggior frequenza (pi spesso) quando vengono confrontate (allineate) molte sequenze reali
T82T84 G78A65C54A45 A TT A 80 95 T77 45A61 60A84 50T100 96 Pur 77 100

struttura di un promotore batterico ideale/forza del promotore

Mutare a -35 o a -10 ha la stesse consequenze?

Risposta: NO, perch a) Esistono sia mutazioni favorenti (UP) che inibenti (DOWN b) Sperimentalmente, si e' visto che le mutazioni in -35 influenzano l'attacco iniziale della RNA polimerasi (formazione complesso chiuso). Mentre le mutazioni a -10 non hanno alcuna conseguenza per la formazione complesso chiuso ma rallentano la conversione a complesso aperto

cosa sono i promotori?

IL PROMOTORE E LA SEQUENZA DI DNA GENOMICO RICHIESTA PER IL CORRETTO AGGANCIO DELLA RNA POLIMERASI E PER IL COMPIMENTO DELLA REAZIONE DI INIZIO

CARATTERISTICHE GENERALI DELLE SEQUENZE REGOLATORIE IN PROCARIOTI ED EUCARIOTI

MANCANZA di una ESTESA conservazione di sequenza PRESENZA di BREVI TRATTI CONSERVATI CRITICI PER LA FUNZIONE (sequenza -35, sequenza -10 e lo spacing tra esse nei batteri)

promotore procariotico esteso

elemento UP (aumento della trascrizione): -non presente in tutti i promotori -aumenta lefficienza di trascrizione di circa 30 volte - importante la posizione (-40 -60 dal sito di inizio)

rRNA

TRASCRIZIONE

INIZIO

come avviene il contatto tra RNA polimerasi oloenzima e DNA

mediato dal fattore sigma

ALLINEAMENTO DI SEQUENZA TRA DIVERSI FATTORI SIGMA

RIVELA REGIONI CODIFICANTI MOTIVI PROTEICI CONSERVATI

la struttura di sigma nel contesto delloloenzima

motivi helix turn helix

motivi helix turn helix (elica giro elica)

interazioni DNA proteine solco maggiore e solco minore dellelica del DNA
il DNA ha una scanalatura principale e una secondaria. Le proteine che interagiscono con esso devono riconoscere sequenze specifiche. il "bordo" di ciascuna coppia di basi esposto in superficie, con un suo preciso pattern di accettori/donatori di ponti H e di zone idrofobiche riconoscibile da proteine. particolarmente vero per scanalatura principale, che non a caso il sito di legame generalmente pi usato dalle proteine che interagiscono con il DNA come i fattori di trascrizione.

interazioni DNA - proteina codice di riconoscimento sul DNA

dalla scanalatura principale ciascuna delle 4 configurazione proietta uno schema unico

dalla scanalatura secondaria il quadro pi monotono

interazioni DNA - proteina codice di riconoscimento sul DNA

dalla scanalatura principale ciascuna delle 4 configurazione proietta uno schema unico

dalla scanalatura secondaria il quadro pi monotono

una proteina si lega al DNA perch RICONOSCE UNA SEQUENZA: la SUPERFICIE DELLA PROTEINA E COMPLEMENTARE ALLE CARATTERISTICHE DI SUPERFICIE DELLA DOPPIA ELICA NB: ci sono tanti contatti, ognuno debole per se, ma, sommati assicurano una interazione specifica e stabile

regione 2.4 di sigma interagisce con regione -10

regione 4.2 di sigma interagisce con regione -35

sigma solo (separato dal core) incapace di legare il DNA, questa sua propriet inibita (autoinibita-frenata)

il fattore sigma (in rosa) nella struttura tridimensionale della RNA polimerasi di T.aquaticus

strutturalmente SIGMA si estende oltre il sito attivo, quasi come un'"antenna" che "cattura" il DNA e lo sistema "in fondo" al core enzyme nella tasca catalitica

complesso binario chiuso

complesso binario aperto

SIGMA

CORE

come funziona sigma?

RNA polimerasi incontra un dilemma nel conciliare inizio e allungamento. inizio richiede un legame FORTE e SPECIFICO esclusivamente ai PROMOTORI; allungamento un legame STABILE A TUTTE le SEQUENZE incontrate dallenzima durante la Tx. SOLUZIONE: SIGMA che garantisce il riconoscimento promotoriale serve SOLO allINIZIO; dopo aver passato la fase di inizio abortiva, si stacca e viene riciclato lavidit per il DNA/RNA nascente (indipendentemente dalla sequenza) da parte della core Pol sufficiente a mantenere il legame durante lallungamento
Sigma accelera questo passaggio

complesso terziario inizi abortivi:

la polimerasi ferma sul promotore sigma legato ostruisce il canale di uscita dellRNA il DNA viene tirato dentro la polimerasi, vengono polimerizzati alcuni nt (2 -9) e poi rilasciati DNA e RNA (nuovo ciclo) solo quando sigma viene rilasciato la polimerasi lascia il promotore

la sintesi di RNA avviene nella bolla di trascrizione

la RNA pol (sigma) che crea la bolla di Tx quando si lega ad un promotore. il duplex di DNA e parzialmente (14 nt) e transitoriamente denaturato

la bolla sempre racchiusa nella RNA polimerasi

lRNA polimerasi cambia dimensione durante le fasi di inizio e protegge porzioni pi o meno ampie della regione intorno allo start point

TRASCRIZIONE

ALLUNGAMENTO

complesso di elengazione:

macchina enzimatica complessa: svolge (DNA da tx) riavvolge (DNA gi tx) stampa RNA funziona da correttore di bozze stacca librido DNA/RNA

Le subunita' beta sono il cuore catalitico della RNA pol procariotica

alcuni farmaci, per es. Rifampicina, si attaccano a b in una posizione che impedisce l'allungamento perch impedisce la fuoriuscita dellRNA.

correzione RNA neosintetizzato

(errore: 1 ogni 10 000) quando viene incorporato un nucleotide sbagliato, viene sentito il mismatch e lRNA polimerasi corregge lerrore mediante:

editing pirofosfolitico reazione inversa della formazione legame fosfodiestereo il pirofosfato viene rilegato al nucleotide appena incorporato

editing idrolitico RNA-pol torna indietro di 1 o pi nucleotidi e taglia lRNA prodotto rimuovendo la sequenza errata stimolato da fattori proteici (Gre)

una RNA polimerasi bloccata pu riprendere la trascrizione

quando il DNA danneggiato quando mancano i nucleotidi lenzima (la bolla tx) fa retromarcia e rimane bloccata fino alla risoluzione del problema assistita da alcuni fattori proteici (GreA e GreB) taglia la regione 3 dellRNA il filamento stampo si trova quindi in posizione corretta e lallungamento pu riprendere

la polimerasi svolgendo il DNA introduce superavvolgimenti positivi nella regione a valle (da trascrivere) che se non corretti, intralcerebbero la Tx

il DNA che si riappaia a monte presenta dei superavvolgimenti negativi

due enzimi: girasi e topoisomerasi intervengono per ripristinare il normale stato di avvolgimento nel DNA

girasi = enzimi che tolgono i superavvolgimenti positivi topoisomerasi = enzimi che introducono superavvolgimenti positivi

topoisomerasi I taglia un filamento e fa passare filamento complementare, ligazione

girasi (topoisomerasi II) taglia entrambi i filamenti incrocia il DNA e ricuce usa ATP per energia

riassumendo..

3 fasi della tx inizio: 3 passaggi. A) formazione complesso chiuso legame della polimerasi ad una speciale sequenza di dsDNA, cioe al promotore. B) fase di complesso APERTO, in cui il duplex si separa per circa 14 basi= si libera il filamento stampo; i primi 2 nucleotidi vengono allineati nel sito attivo con il filamento stampo e polimerizzati; la polimerasi comincia polimerizzare in direzione 3, fino a fare un frammento di 10 basi; in questa fase la polimerasi va avanti ed indietro = inizi abortivi (rilasciando i piccoli frammenti trascritti e ripartendo dal +1) C) formazione di un complesso ternario (DNA RNA e Polimerasi) stabile. Fino a questo stadio la polimerasi non ha lasciato il promotore
Allungamento la polimerasi volge e svolge il DNA e sintetizza il trascritto (problema topologico, next slide). Ce un cambio conformazionale che ancora stabilmente la pol al DNA. Terminazione. Fine della Tx e rilascio del trascritto primario In batteri, esistono ben precise sequenze di terminazione (terminatore) In eucarioti non ce un vero e proprio terminatore. Vedremo pi avanti

espressione genica

la trascrizione copia selettivamente discrete porzioni di genoma, e ne fa anche migliaia di copie

ma non tutti i geni vengono utilizzati nello stesso momento e non tutti con la stessa intensit
controllo dellespressione genica

1) l'espressione genica energicamente costosa (fare RNA e proteine richiede molto dispendio energetico per la cellula) 2) lespressione contemporanea di tutti i geni causerebbe una tale cacofonia regolatoria e strutturale da risultare incompatibile con la vita (per es. differenziamento, sporulazione etc)
CONTROLLO DELL'ESPRESSIONE GENICA E' CENTRALE ALLA VITA (e quindi anche nella malattia)

la regolazione dettata dal contesto cellulare, da molteplici stimoli, dalle necessit

la regolazione qualitativa (questo gene SI e laltro NO)

ma anche profondamente quantitativa (accendo un gene e lo trascrivo 10-100 oppure milioni di volte... e come dove e quando mi fermo ???)

lespressione genica differenziale

cosa significa espressione genica differenziale? capacit di esprimere una parte del proprio repertorio genico nella giusta combinazione, in momenti diversi ed in siti diversi. lo sviluppo embrionale e la omeostasi (capacit di mantenere un equilibrio) dei tessuti degli organismi pluricellulari, o la capacit di rispondere alle variazioni ambientali e la capacit di differenziare (sporulazione) nei batteri sono straordinari esempi di differential gene expression

controllo dellespressione genica

controllo dellespressione genica

lespressione pu essere regolata a vari livelli pre trascrizionale (negli eucarioti) trascrizionale (il pi importante e diffuso) post-trascrizionale (soprattutto negli eucarioti)

traduzionale co e post-traduzionale (il pi veloce e dispendioso)

elementi trans attivi - elementi cis attivi

un regolatore elemento trans attivo (diffusibile): RNA pol, fattori di trascrizione, miRNA ecc. agisce su qualunque copia del suo bersaglio il sito di legame (bersaglio) sul DNA/RNA elemento cis attivo (promotore, operatore, enhancer ecc.) ha effetto solo sul DNA adiacente