Corso Integrato di Laboratorio 2007-2008 Esercitazione n.

1. Presentazione del Corso

2. Lettura delle schede tecniche dei reagenti

3. Nozioni di sicurezza

4. Presentazione del laboratorio

5. Preparazione delle soluzioni

Sodio Acetato 2M pH 7.0
SDS 10%
EDTA 0.5 M pH 8.0
TBE 10X (Tris 0.89M, ac. Borico 0.89M, EDTA 10 mM, pH 8.3)
TE pH 7.5 (TRIS 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM pH 8.0)
NaCl 5M

6. Esercitazione pratica di estrazione di DNA da tessuto

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Corso Integrato di Laboratorio 2007-2008 Esercitazione n.1

ESTRAZIONE DI DNA DA TESSUTO

- Tagliare una sottilissima fettina di tessuto con un bisturi pulito e metterla in una provetta da 2 mL.
- Aggiungere qualche goccia di soluzione di lisi e disgregare il tessuto con un pestello. Aggiungere il resto
della soluzione (max 800 µL).
- Agitare con il vortex ed incubare per 3 ore a 56 °C.
- Aggiungere 500 µL di fenolo e agitare per inversione.
- Centrifugare per 5 minuti a 12000 rpm (20 °C).
- Aspirare il surnatante e trasferirlo in una provetta pulita.
DNA in soluzione acquosa

Proteine

Fenolo/Cloroformio

- Aggiungere 250 µL di fenolo e 250 µL di cloroformio ed alcool isoamilico 24:1. Agitare.

- Centrifugare per 5 minuti a 12000 rpm (20 °C).
- Aspirare il surnatante e trasferirlo in una provetta pulita.
- Aggiungere 500 µL di cloroformio e agitare.
- Centrifugare per 5 minuti a 12000 rpm (20 °C).
- Aspirare il surnatante e trasferirlo in una provetta pulita.
- Aggiungere un pari volume di isopropanolo, oppure 2,5 volumi di etanolo assoluto. Agitare per inversione.
Il DNA floccula.
- Eliminare l'alcool (isopropilico o etanolo).
- Risospendere in 500 µL di NaAc 0,2 M pH 7.0 e incubare 10’ a 56 °C.
- Aggiungere 1 mL di etanolo assoluto e far flocculare il DNA invertendo la provetta.
- Eliminare l’etanolo assoluto.
- Lavare con 1 mL di etanolo 70% (5’).
- Eliminare l’etanolo, centrifugare per 30” a 12000 rpm per aspirare tutto l’etanolo.
- Lasciar asciugare all’aria.
- Aggiungere 500 uL di acqua bidistillata sterile o tampone TE pH 7.5.
- Incubare 10’ a 56 °C.

SOLUZIONI
Soluzione di Lisi:
Sodio Acetato 0,2M pH 7.0; SDS 0.5%; EDTA 5 mM; Proteinasi K 0.02%; 10 mM DTT.
Fenolo:
Fenolo saturato con tampone a pH 8.0.
Fenolo/Cloroformio/Alcool Isoamilico:
25/24/1
Etanolo Assoluto:
Etanolo 100%
Etanolo 70%:
100 mL Etanolo 100% + 30 mL ddH20
TE pH 7.5
TRIS 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM pH 8.0.

Note per la sicurezza:

Utilizzare guanti, camice ed occhiali protettivi e lavorare sotto cappa.

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