I diversi ruoli

dell’ Ubiquitina e del

Proteosoma 26S
nella vita e nello sviluppo
delle piante
• La regolazione dei processi di proteolisi ha un ruolo essenziale nello
sviluppo di tutti gli organismi

• Una proteina può essere degradata perché non funziona più

correttamente, oppure perché il suo folding è scorretto

• Altre proteine sono degradate per fornire azoto e carbonio sotto

forma di aminoacidi

• Alcune proteine vanno incontro a proteolisi in seguito a specifici stimoli

ambientali e/o di sviluppo per controllare la concentrazione di
fondamentali regolatori cellulari

• Nelle piante questo processo è tanto più cruciale a causa dell’alto grado
di plasticità di sviluppo necessaria per la loro vita sessile

• Il rapido switch da uno stadio di sviluppo ad un altro richiede

l’eliminazione di network regolativi preesistenti e l’assemblaggio di nuovi
network, processo che spesso dipende dalla proteolisi
 Due pathways principali:
Attraverso il lisosoma (non specifico, principalmente
per proteine extracellulari)

Attraverso il pathway del proteasoma/ubiquitina (molto

regolato e specifico)
 Ubiquitina
• Originariamente isolata da Goldstein nel 1975 (da timo), poi identificata
in tutti gli organismi eucarioti ed in tutti i tessuti

• E’ una proteina di 76 aminoacidi altamente conservata

• Identificata anche legata covalentemente agli istoni nel 1977 da

Goldknopf & Busch

• Identificata come parte di un sistema proteolitico energia-dipendente

da Hershko nel 1970-1980

• E’ stato dimostrato che substrati ubiquitinati sono instabili da Hershko

& Varshavsky nel 1982 e anni successivi

• La modificazione delle proteine con l’ubiquitina è responsabile anche di

processi quali l’endocitosi, la riparazione del DNA, l’attività trascrizionale
• L’ubiquitinazione di una proteina target (T) comporta una serie di attività
enzimatiche a cascata, che portano alla formazione di un legame isopeptidico fra
il residuo G76 di Ub ed il gruppo NH2 di un residuo di L nella proteina T, formando
un legame tioestere con G76. Questo processo inizia con un enzima Ub-activating
(E1), responsabile del legame tioestere.
• Questo processo non sembra avere un ruolo regolativo e gli organismi eucariotici
hanno solo poche isoforme E1.
• L’Ub è poi trasferita ad un enzima Ub-conjugating (E2) di nuovo mediante un
legame tioestere.
• E2 porta l’ Ub attivata all’Ub ligasi (E3), che permette il trasferimento dell’Ub
da E2 al residuo di Lys nella proteina T.
• E3 è generalmente considerato il più importante dei 3 enzimi nel controllo della
specificità del T, perché è responsabile di recrutare il T e di posizionarlo per il
trasferimento di Ub da E2.
• Ulteriori cicli di coniugazione aggiungono residui di Ub al T, ed il tipo di catena
di Ub formata è determinante per il destino del T.
• Dopo degradazione del T, i residui di Ub sono riciclati mediante azione di enzimi
di de-ubiquitinazione (Dub).
Il Pathway dell’ Ubiquitina/Proteosoma
Il Ciclo dell’ Ubiquitina/Proteosoma
 La natura gerarchica del processo mediato da Ubiquitina

E1

E2

E3

substrati

26S proteasome
 Alcune proteine regolative degradate dal
sistema Ubiquitina/Proteosoma

Tipo Regolazione Ruolo della degradazione Esempi

I positiva limite della durata Cicline (fasi G1,S,M),
TFs

II negativa inizio del processo Inibitori Cdk

III positiva attivazione x stabilizzazione p53

o negativa tumor suppressor

Dalla conferenza del Premio Nobel Avram Herscko’s

 Perché il malfunzionamento
Malattia delFunzione
sistema ubiquitina-
normale
proteosoma può causare malattie?
Livello steady Substrato Substrato Livello steady
state ridotto Proteico state normale
Proteico

Aumento Degradazione
Degradazione normale

Proteosoma/
Ubiquitina

mutazione
Diminuzione Degradazione
Degradazione normale

Livello steady Substrato Livello steady

Substrato
state aumentato Proteico state normale
Proteico
Funzione normale
Malattia
 Degradazione delle proteine mediata da Ubiquitina
Saccharomices
Perché studiarla nelle piante? Arabidopsis

5% del proteoma di
Arabidopsis thaliana (1300
geni) è coinvolto nel
pathway ubiquitina/
proteasoma 26S,
rendendolo così uno dei
meccanismi di regolazione
più elaborato nelle piante.
 Organizzazione e struttura di diverse E3
in associazione con l’intermedio Ub-E2

HECT Ring/U-box SCF APC

HECT: singoli polipeptidi caratterizzati dal dominio HECT, contenente il dominio

per il complesso Ub-E2. In lievito ed Arabidopsis ci sono solo 5 e 7 E3 di questo
tipo, mentre in uomo ce ne sono >50

APC: è il complesso più sofisticato tra le E3. In piante sembra esista solo un
numero limitato di isoforme APC
 La famiglia delle ubiquitin ligasi cullin-RING (CRLs)

Albero filogenetico delle CULLINs di Arabidopsis insieme a quelle di altri

eucarioti. Tutte le E3 ligasi contenenti CULLINs richiedono una subunità di tipo
RING-H2 che interagisce con E2. Inoltre ogni E3 porta un adattatore che
recruta il substrato in modo specifico al complesso core.
Ring/U-box: il motivo Ring-E3 è formato
da un ottetto di C e H che legano un
atomo di Zn in un motivo H2 o HC. In
Arabidopsis ci sono > 400 Ring E3
potenziali. All’N-ter ci sono motivi di
riconoscimento del target (WW,WD40).
Il gruppo più piccolo delle E3 U-box (37
in Arabidopsis) hanno una struttura Ring
finger-like, detta U-box. Il motivo
ring/U-box non partecipa direttamente
alla reazione con Ub ma serve da
piattaforma con il Ring finger che
interagisce con Ub-E2 in modo da
attivare il trasferimento di Ub alla Lys
del substrato
SCF (Skp, Cullin, F-box): complessi di
4 polipeptidi con attività di Ub ligasi.
Una delle subunità, Rbx, contiene un ring
finger di tipo H2 che lega E2-Ub. SCF
funziona da ponte che mette in contatto
l’intermedio Ub-E2 con i target e
promuove il transfer senza formare un
intermedio E3-Ub. La specificità al
complesso è conferita dall’F-box, che
lega Skp. L’organizzazione
combinatoriale di SCF fornisce un
meccanismo per riconoscere molti
substrati solo cambiando la subunità F-
box. S.cerevisiae ne ha 14, C.elegans
337 e A.thaliana almeno 694. Molti
targets dei complessi SCF devono
essere fosforilati prima del
riconoscimento da parte dell’ F-box.
Struttura della ubiquitina ligasi SCF
 Ruolo dell’Ubiquitina e del Proteosoma 26S
nelle piante

• Molti processi vegetali sono regolati mediante ubiquitinazione e

degradazione proteica
• Il sistema Ub/26S è attivo sia nel nucleo che nel citoplasma
• Molti dei mutanti di sviluppo finora studiati, presentano mutazioni in
geni codificanti per F-box o per proteine con motivi Ring finger
• In Arabidopsis ci sono:
2 geni E1
46 geni E2 ed E2-like
più di 1200 geni E3
• Di questi ultimi, nel genoma di Arabidopsis sono stati identificati circa
700 geni codificanti putative F-box. Queste proteine possono essere
classificate in 19 gruppi sulla base della struttura dell’ F-box
• Il Proteosoma 26S è un complesso proteico di circa 700kDa isolato sia
da nucleo che da citoplasma sia di piante che di animali
• In assenza di ATP, il complesso si dissocia in due subunità:
• Il complesso 20S proteasi core (CP) costituito da un cilindro
formato da 4 anelli di 7 subunità  e , contenente il dominio
catalitico ATP-indipendente
• Il complesso regolativo 19S (RP), che può essere ulteriormente
diviso in “lid” e “base”. E’ legato al complesso 20s ad una o ad
entrambe le estremità. RP conferisce sia ATP-dipendenza che
specificità di substrato
• Il subcomplesso “base” consiste di 6 subunità ATPasi e 3 non ATPasi
• Il subcomplesso “lid” consiste di 8 subunità non ATPasi
• DUBs: sono enzimi che deubiquitinano, rimuovendo in modo specifico le
Ubs legate covalentemente ai targets. In Arabidopsis sono presenti 32
DUBs, organizzate in sottofamiglie. Alcune sono coinvolte anche
nell’eliminazione di proteine danneggiate.
b. Il Target poliUb è riconosciuto
dalla RP 19S. La proteina è poi
“defoldata” attraverso la
particella core “base”, e poi
degradata da 5 diverse proteasi
all’interno della particella 20S
c. Il COP9 signalosome (CSN) è un
complesso multiproteico
altamente conservato,
inizialmente identificato come
repressore della luce, importante
in molti processi di sviluppo delle
piante. Consiste di 8 subunità e
mostra notevole somiglianza con il
complesso del “lid” 19S
Controllo dei Pathways dei Fitormoni
in Arabidopsis mediante SCF E3
 Controllo dei Pathways dei Fitormoni
in Arabidopsis mediante SCF E3

• JA: è il primo ormone di cui si è dimostrato il controllo da parte

di SCF-like. L’attività del proteosoma richiede COI1, che è parte
del complesso SCF , i cui partner proteici non sono anocara noti.

• Gibberelline (GA): sia in Arabidopsis che in riso sono presenti F-

box coinvolte nel signalling delle GA, in particolare nella
degradazione dei regolatori negativi della risposta alle GA, le
proteine DELLA

• Ethylene: nel signalling dell’etilene, il FT EIN3 si lega a EBF1/2

sia in lievito (two-hybrid), che in vitro in esperimenti di pull-down
L’auxina induce variazioni rapide
dell’espressione genica e due
famiglie proteiche sono
coinvolte in questa risposta:
ARF (auxin response factors) e
le proteine AUX/IAA. Le
AUX/IAA reprimono
l’espressione genica mediata da
auxina inibendo l’attività delle
ARFs, e un alto livello di auxina
accellera la loro degradazione.
TIR1 (Transport Inhibitor
Response1) contiene una F-box
ed è parte di un complesso SCF
che interagisce con le proteine
Aux/IAA
ARFs
Nel modello ABC di sviluppo
fiorale, AP3 e PI sono geni di
classe B codificanti FT che
funzionano come eterodimeri. La
quantità di questi TF è regolata
da UFO e LFY.
UFO codifica per una proteina
F-box che attiva/mantiene
l’attività trascrizionale di PI.
Sembra che UFO formi una Ub
ligasi E3 di tipo SCF. Infatti
UFO interagisce con omologhi di
SKP. Inoltre è stato dimostrato
che CSN interagisce con UFO in
vivo. E’ probabile che il target di
UFO sia un repressore di AP3.

?
Tra i geni importanti per il de- skotomorfogenesi fotomorfogenesi
eziolamento ci sono i geni
COP/DET/FUS, necessari per
la repressione della
fotomorfogenesi al buio. COP1
interagisce con HY5, HYH e
LAF, FT che promuovono la
foomorfogenesi. La
degradazione di HY5 al buio
coinvolge il proteosoma 26S e
COP1. L’attività di
ubiquitinazione di COP1 su HY5
e LAF1 è stata recentemente
dimostrata in vitro
 Variazioni sul Tema dell’Ubiquitinazione

I ruoli alternativi dell’ubiquitinazione sono stati finora

dimostrati solo in lievito e nei mammiferi, ma l’alta
conservazione di questi processi lascia supporre che siano
presenti anche nelle piante
L’Ub è sintetizzata come proteina di fusione di monomeri (poliUb), o con
piccole subunità ribosomali, che sono poi processate per taglio della gly
C-ter. Dopo la degradazione dei targets (S:substrates), l’Ub deve
essere liberata e disassemblata. Gli enzimi DUBs revertono anche
l’attività di E3, rimuovendo così l’Ub dai substrati.
Diverse funzioni per diverse interazioni dell’Ub. Schema delle diverse
lys dell’Ub e delle diverse funzioni. Le funzioni delle catene legate a
lys11 e lys29 sono ancora sconosciute. Le catene legate a lys48 mediano
la degradazione via proteosoma, mentre le catene su lys63 hanno
diverse funzioni.