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LEZIONE 5 18/10/07

Il concetto di potenziale di membrana ha avuto le sue origini intellettuali con Galvani, alla fine del 1700.
Quando Galvani iniziò a fare esperimenti con i muscoli di rana, si rese conto che esistevano degli impulsi
elettrici nei tessuti viventi, che lui identificò come “elettricità animale”. Quasta osservazione di Galvani non
fu subito presa in considerazione, poiché mancava la tecnologia adeguata che ne potesse consentire la
verifica. Dopo circa 60 anni si iniziarono a mettere a punto dei sistemi sperimentali che confermarono
quanto detto da Galvani: inserendo degli elettrodi in un tessuto vivente si otteneva proprio una differenza di
potenziale tra l’esterno della fibra e il suo interno.
Ripetendo l’esperimento con gli elettrodi su cellule diverse, si è visto che in realtà questa differenza di
potenziale esiste con valori diversi:
-
fibra muscolare  -90 mV
-
globulo rosso  - 10 mV
-
assone gigante del calamaro  -70 mV
-
uovo da riccio di mare  -40 mV
-
neurone di gatto  -80 mv
Quando si iniziò a studiare l’elettricità delle cellule (soprattutto delle cellule eccitabili, che in un organismo
sono le cellule muscolari e le cellule nervose), il soggetto scelto per gli esperimenti fu l’assone gigante del
calamaro (Loligo forbesi), che sperimentalmente ha una struttura particolarmente adatta perché ha una
dimensione molto maggiore rispetto all’assone di un qualunque altro neurone di qualsiasi altra specie
vivente. Ha infatti un diametro di 80 micron, contro i 2 micron dell’assone di un neurone umano. Nel
calamaro ci sono dei gangli da cui si dipartono questi assoni, che appunto non sono altro che dei
prolungamenti da cui si dipartono questi assoni. Facendo l’analisi dei diversi ioni, si sono potute calcolare le
concentrazioni ioniche esatte nell’ambito del liquido extracellulare a livello dell’assone gigante; ci troviamo
ad avere:
-
150 mmol di K+ all’interno e 4 mmol di K+ all’esterno
-
15 mmol di Na+ all’interno e 150 mmol di Na+ all’esterno
-
9 mmol di Cl- all’interno e 125 mmol di Cl- all’esterno.

Dunque, se esistono dei potenziali, questi si possono registrare: nasce così l’elettrofisologia.
Ci sono diverse metodiche con cui è possibile studiare il potenziale delle cellule. La prima di queste
metodiche viene definita CURRENT CLUMP e consiste nel misurare la corrente che passa attraverso un
sistema, utilizzando gli elettrodi, un misuratore di corrente, e stimolando una cellula per vedere cosa succede
dopo la stimolazione. Negli anni ’50, questo sistema è stato affiancato da un sistema computerizzato, che ha
indirizzato la current clump verso un secondo tipo di metodica detta VOLTAGE CLUMP, che è usata
tutt’oggi per comprendere come funzionano dei meccanismi elettrici legati alle strutture viventi.
Negli anni ’70 è stata messa in atto una terza metodica detta PATCH CLUMP (blocco della pezza), che
studia in maniera più attenta il potenziale di una membrana. Sulla membrana di una cellula si inserisce una
micropipetta: si fa aderire la punta della micropipetta alla membrana cellulare, in modo da creare un
ambiente unico con l’interno della micropipetta, che è riempito con una soluzione salina; in questo modo si
crea una doppia possibilità di studio: si può studiare la configurazione esterna del tratto di membrana che si
trova al di sotto della micropipetta, oppure si può esercitare una pressione maggiore, tale da rompere la
membrana e studiare il suo contenuto.
Oggi questa tecnica del patch clump, unita a quella del voltage clump, si usa per studiare ogni singolo
canale, e la corrente che lo attraversa, cioè la conduttanza attraverso il canale. La possibilità di stimolare una
cellula e registrare i risultati di questa stimolazione, è data proprio dal fatto che la cellula è un volume
conduttore e all’interno contiene liquidi, soluzioni saline; le membrane a questo punto rappresentano proprio
un condensatore. Un condensatore non fa altro che tenere separate le cariche interne, che risultano negative,
ed esterne, che risultano positive. I canali ionici allora, non sono altro che delle strutture che consentono di
mettere in comunicazione l’interno con l’esterno, consentendo il passaggio di ioni.
Canali simili sono ritrovati dai batteri fino all’uomo: sono una di quelle strutture che in milioni e milioni di
anni hanno mantenuto sempre la stessa funzione.

Il valore di -70 mV è il potenziale di membrana dell’assone gigante di calamaro, cioè del soggetto studiato.
Riassumendo: il K+ esce per gradiente ionico e rientra per gradiente elettrico, il Na+ tende ad entrare sia per
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gradiente ionico che per gradiente elettrico, gli anioni proteici non fuoriescono, il Cl- entra solo
parzialmente, e la pompa Na+/K+ utilizza la propria energia per buttare fuori il Na+ che è entrato e riportare
all’interno il K+ che è uscito. Per capire come da tutte queste considerazioni si arriva ad un valore di -70 mV
dobbiamo considerare il potenziale di equilibrio di ogni singolo ione. Il potenziale di equilibrio di uno ione
ci dà infatti il valore di equilibrio tra il potenziale elettrico e il potenziale chimico. La formula in grado di
darci il valore del potenziale di equilibrio di uno ione è L’EQUAZIONE DI NERNST.

L’equazione di Nernst per il K+ è

R = costante dei gas
T = temperatura assoluta
z = valenza dello ione
Ek= RT/zF ln [K est]/[K int ] F = costante di Faraday
K+est = concentrazioni di K+ all’esterno
K+int = concentrazioni di K+ all’interno

Se sostituiamo ai simboli i valori riguardanti il K+, troviamo che il potenziale di equilibrio per il K+ è di -90
mV. Ek+ = -90 mV

Questo valore è diverso dal valore di -70 mV trovato sperimentalmente.

Infatti, se la membrana consentisse solo il passaggio del K+, il potenziale di membrana sarebbe stato proprio
di -90 mV; poiché la membrana è permeabile anche ad altri ioni, il valore diventa di -70 mV, che è vicino al
valore dello ione maggiormente diffusibile (K+), ma che risente anche del passaggio degli altri ioni, e cioè di
una piccola quantità di Na+, che ha un potenziale di equilibrio di +70 mV; dunque, il potenziale di membrana
non corrisponde al potenziale di equilibrio del K+ perché è deviato dal ENa+, che lo porta da -90 mV a -70
mV. Il potenziale di equilibrio del Cl- è di -65 mV, quindi è poco influente.
Naturalmente, il valore del potenziale di membrana di -70 mV, non è la media dei valori di EK+, ENa+, ECl-,
perché questi ioni in realtà entrano attraverso dei canali diversi, e il loro numero non è mai uguale tra tutti
gli ioni (ad esempio per ogni 20-25 canali K+ c’è solo 1 canale Na+), ed è proprio per questo motivo che
l’assone del calamaro gigante ha un potenziale di membrana di -70 mV, mentre il globulo rosso ha un
potenziale di membrana di -10 mV.

Quando consideriamo insieme le concentrazioni, i gradienti, i canali, la permeabilità e la conduttanza, esce

fuori l’EQUAZIONE DI GOLDMANN.

Em = 61 log PK+[K+]E+PNa+[Na+]E+PCl-
[Cl-]i
PK+[K+]i+Pna+[Na+]i+PCl-
[Cl-]E

Il numero 61 viene fuori dal calcolo RT/F

P è la permeabilità (quindi in questo caso PK+ è la permeabilità al K+)
E è la concentrazione esterna ( in questo caso del K+)
I è la concentrazione interna (in questo caso del K+).
Questo significa che matematicamente esiste un modo per rappresentare il potenziale di membrana, che
tiene conto della pemeabilità, delle concentrazioni, dei gradienti, dei potenziali di equilibrio e delle
conduttanze.
Così come la membrana si può immaginare elettricamente
come un condensatore, allo stesso modo possiamo
considerare i canali come delle RESISTENZE; possiamo
allora costruire un CIRCUITO ELETTRICO:
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Eb è la batteria, cioè il gradiente ionico che spinge attraverso un canale. Se chiudiamo il circuito,
naturalmente ci sarà una differenza di potenziale tra i due lati della membrana.
Questo circuito contiene un condensatore con le sue
cariche, una batteria con una resistenza per ognuna delle
specie ioniche considerate.
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La pompa Na+/K+ è fondamentale, e viene definita PERISTALTICA (cioè una pompa di tipo P) una di quelle
strutture che hanno un intermedio che passa dalla forma E1 alla forma E2. questa pompa trasferisce 3 ioni
Na+ dall’interno, contro 2 ioni K+ che vengono presi dall’esterno, mantenendo così un equilibrio dinamico,
cioè una differenza di potenziale costante, mantenuta a un valore di -70 mV.
La pompa Na+/K+ è costituita da due subunità α e β e presenta una serie di eliche transmembrana.
La pompa Na+/K+ funziona mediante un cambiamento conformazionale che trasferisce automaticamente ioni
nelle due direzioni.
La funzione della pompa Na+/K+ la possiamo schematizzare nel modo seguente:
-
carica 3 ioni Na+
-
si passa da ATP ad ADP (l’energia fa passare la pompa allo stadio intermedio)
-
mentre è aperta lega 2 ioni K+
-
cambia di conformazione
-
rilascia il K+ all’interno.

Questa molecola ha una sua funzionalità sia all’interno che all’esterno, ed esistono delle molecole chimiche
che bloccano la sua funzionalità. Ad esempio, l’ouabaina è un ganglioside che si lega al lato esterno della
pompa.
Non è mai stata riscontrata in nessun organismo una mutazione a carico della pompa Na+/K+; questo perché
possedere una pompa Na+/K+ poco o non funzionale non è compatibile con la vita.