BIOCHIMICA STRUTTURALE CON ELEMENTI DI ENZIMOLOGIA

Insegnamento di Biomolecole e Propedeutica al Laboratorio

PROGRAMMA

Requisiti minimi richiesti per poter seguire in maniera proficua il corso

Chimica generale: Caratteristiche generali dei diversi elementi della tavola periodica, i
legami chimici e le interazioni fra molecole. Concetto di mole e molarità. Le reazioni di
ossido-riduzione e acido-base. Il calcolo del pH e le soluzioni tampone. Principi di
termodinamica. Chimica organica. Struttura e caratteristiche chimico-fisiche delle principali
molecole organiche: alcani, alcheni, alcoli, tioli, aldeidi, chetoni, acidi organici, ammine,
ammidi. Siti reattivi (elettrofili/nucleofili) e principali classi di reazioni organiche.
Caratteristiche dei doppi legami e dei doppi legami coniugati, delocalizzazione elettronica e
risonanza. Caratteristiche delle molecole aromatiche contenenti l’anello benzenico.
Citologia: Struttura ed organizzazione della generale della cellula eucariotica: il nucleo, gli
organuli ed il citoscheletro.

Parte 1_La chimica dei viventi

Premessa. Questa parte introduttiva si propone di aiutare a comprendere che la
chimica della vita non può che fondarsi sui principi base della chimica e della fisica,
seppur attraverso la manifestazione di alcune peculiarità conseguenti alla
inscindibile connessione esistente fra “organismo vivente” e ambiente. Allo
studente è richiesto di riconsiderare le nozioni precedentemente apprese nei corsi
di chimica generale e chimica organica e di applicare tali conoscenze al contesto
biologico.
Contenuti. Che cosa si intende per biochimica e come si colloca lo studio della
disciplina “Biochimica” nel contesto delle altre discipline. Definizioni oggettive di
“organismo vivente”. Rappresentatività dei diversi elementi nelle molecole
biologiche e loro funzione. Le interazioni fra molecole biologiche: ponti salini,
interazioni elettrostatiche, i legami idrogeno, interazioni di Van der Waals,
interazioni idrofobiche. I gruppi funzionali importanti in biochimica. Le energie di
legame. Approfondimento sul ruolo dei solventi polari e non polari in biochimica. I
composti anfipatici. Le interazioni deboli alla base della funzione delle
macromolecole. Pressione osmotica ed osmolarità.
Parte 2_ Le macromolecole biologiche
Premessa. Questa parte del corso è dedicata a trasmettere le conoscenze base
necessarie per comprendere il rapporto esistente fra struttura e funzione delle
macromolecole biologiche. Ciascuna classe di macromolecole biologiche sarà
presentata ponendo in evidenza le sue peculiarità chimico-fisiche e la sua funzione
 biologica, in relazione anche alle altre classi di macromolecole. Saranno forniti gli
strumenti necessari affinché lo studente possa essere in grado di riconoscere le
diverse molecole in base alla loro struttura e di comprenderne la funzione.
- Carboidrati
Premessa. Questa parte del corso prevede di fornire le basi della glicobiologia. Le
diverse classi di carboidrati vengono presentati ponendo l’attenzione sulla relazione
inscindibile esistente fra struttura e funzione. I carboidrati sono le molecole
fondamentali per la produzione di energia metabolica nella quasi totalità degli
organismi viventi e sono i principali componenti della biosfera terrestre. Lo studente
potrà apprendere come strutture apparentemente simili possiedano proprietà
biologiche fondamentalmente diverse che condizionano il loro utilizzo nei diversi
organismi per espletare funzioni energetiche, strutturali o di segnalazione.
Contenuti. Monosacaccaridi. La stereoisomeria e la chiralità. Definizione di
enantiomeri, diastereoisomeri ed epimeri nei monosaccaridi. Formula di struttura
dei principali aldosi e chetosi. Emiacetali ed emichetali, mutarotazione e anomeri.
Disaccaridi, legame glicosidico. Formula di struttura dei principali disaccardi.
Omopolisaccaridi di riserva e strutturali: amido, glicogeno, cellulosa. Monosaccaridi
modificati: amminozuccheri, acidi uronici, polioli: struttura e funzione.
Eteropolisaccaridi: struttura di glicosamminoglicani, chitina, agar, emicellulose,
gomme. Glicosamminoglicani: struttura di eparansolfato, Ialuronano, condroitin
solfato, cheratan solfato, dermatansolfato l’aggrecano; cenni sulla struttura della
matrice extracellulare.I glicoconiugati: glipicani, sindecani, proteoglicani,
l’aggrecano; glicoproteine: mucine e leptine.
Lipidi
Premessa. I lipidi sono le macromolecole fondamentali per la costituzione delle
membrane biologiche e quindi per definire i “confini” necessari per l’espletazione
dei processi biologici nei viventi. I lipidi svolgono inoltre un fondamentale ruolo
energetico e di segnalazione. Saranno presentate le diverse classi di lipidi
focalizzando l’attenzione dello studente sul rapporto struttura-funzione,
particolarmente evidente in questa classe di macromolecole.
Contenuti. Classificazione generale, caratteristiche generali e funzione. Acidi
grassi saturi ed insaturi: caratteristiche chimico-fisiche e loro influenza sulla loro
funzione biologica. Nomenclatura e struttura dei principali acidi organici di interesse
biologico. I gliceridi neutri: triacilgliceroli, struttura e funzione. Cere: struttura e
funzione. Glicerofosfolipidi: struttura e funzione. I plasmalogeni, struttura e
funzione. Sfingolipidi: classificazione, struttura e funzione. Glicolipidi:
classificazione, struttura e funzione. Principi di organizzazione delle membrane
biologiche: organizzazione dei lipidi in ambiente acquoso: le molecole antipatiche,
formazione di vescicole, micelle, doppi strati, i. Struttura del colesterolo e suoi
derivati: colesterolo esterificato, acidi colici, cenni sugli ormoni sessuali e
corticosurrenalici.
- Acidi nucleici
 Premessa. In questa parte del corso saranno fornite le conoscenze chimico-fisiche
necessarie per comprendere il ruolo di queste molecole nella trasmissione
dell’informazione genetica da un organismo ad un altro e nella trasmissione
dell’informazione dal “gene” alla “proteina”.
Contenuti. Le basi azotate, i nucleosidi, i nucleotidi. Basi azotate modificate e
meno comuni. Il legame fosfodiestere, struttura primaria e secondaria degli acidi
nucleici. Caratteristiche chimico-fisiche del DNA in funzione della composizione in
basi. La denaturazione del DNA e duplicazione dell’informazione. Il DNA
superavvolto, le topoisomerasi. Organizzazione superiore del DNA, la cromatina:
cenni sulla struttura e funzione. La struttura secondaria e terziaria dell’RNA.
Classificazione dei diversi tipi di RNA. Caratterizzazione del gene come unità
funzionale per la trasmissione dell’informazione, cenni su mRNA, e significato dei
processi di trascrizione e traduzione.
- Dagli amminoacidi alle proteine
Premessa. Gli aminoacidi sono i costituenti delle proteine. La conoscenza delle
loro caratteristiche chimico-fisiche è necessaria per comprendere i meccanismi che
sono alla base dell’acquisizione delle strutture secondarie e terziarie delle proteine
e che ne determinano la funzione.
Contenuti. Amminoacidi: Struttura, stereoisomeria e chiralità. Classificazione in
base alla catena laterale. Amminoacidi essenziali e non essenziali, amminoacidi
non proteici ed amminoacidi modificati. Modificazioni reversibili degli amminoacidi
coinvolte nella regolazione delle proteine. Proprietà anfoioniche degli aa. Punto
isoelettrico. Le proteine. Legame peptidico: proprietà chimico fisiche. Cenni sulle
molecole derivate degli amminoacidi ad attività biologica. Le proteine sono
molecole informazionali: direzionalità della sequenza aminoacidica; cenni sulla
conversione del codice genetico in sequenza aminoacidica (traduzione di mRNA).
I livelli di struttura delle proteine: struttura primaria, strutture secondarie (alfa elica
ed i beta-foglietti), struttura terziaria. Ruolo delle Interazioni deboli e delle catene
laterali nella definizione delle strutture di ordine superiore. Legami a ponte disolfuro.
Significato del grafico di Ramachandran. Strutture supersecondarie e motivi
strutturali. I domini strutturali: definizione e relazione con i domini funzionali. La
denaturazione proteica. Struttura terziaria. Il folding delle proteine; esperimento di
Anfinsen, l’ipotesi dell’imbuto termodinamico. Il carattere gerarchico del folding.
Principi termodinamici alla base del folding. Attività enzimatiche a supporto del
folding: peptide prolil cis-trans isomerasi e disolfuro isomerasi. Il folding spontaneo
e assistito. Gli chaperon molecolari, sistema HSP70/40; la chaperonina/HSP60.
Errori di folding: beta-amyloid precursor proteins (APPs), i prioni. Struttura
quaternaria. Interazioni chimico-fisiche alla base delle strutture quaternarie.
Elementi di stabilizzazione della struttura quaternaria. Modelli di struttura
quaternaria: proteine fibrose e proteine globulari. Esempi di proteine fibrose:
struttura delle alfa-cheratine e del collagene. Ruolo della vitamina C nella sintesi
del collagene. Amminoacidi modificati del collagene.
- Introduzione ai metodi di studio della struttura delle proteine
 Premessa. In questa parte del corso verranno introdotti i principali metodi
d’indagine basati sul riconoscimento biologico delle proteine per consentire di
cominciare a conoscere quali strumenti sono disponibili per il loro studio e per la
loro analisi anche in ambito diagnostico
Contenuti. Test immunoezimatici: immunoblot/Western Blot, Enzyme Linked
Immuno Sorbent Assay (ELISA).
Parte 3: Gli enzimi e cinetica enzimatica.
Premessa. La catalisi è un evento essenziale affinchè la maggior parte delle
reazioni biochimiche possa procedere a velocità tali da supportare la vita stessa.
La cellula inoltre, fa uso dei catalizzatori per dirigere le molecole in determinate vie
utili piuttosto che verso reazioni collaterali improduttive.
Contenuti. La termodinamica delle trasformazioni chimiche viste con un approccio
biochimico. La costante di equilibrio; principio di Le Chatelier, lavoro e energia a
temperatura o volume costante, entalpia, entropia, le leggi della termodinamica, il
“controverso” concetto di entropia, l’energia libera di Gibbs e la spontaneità o meno
dei processi biochimici. Energia di attivazione suo impatto sulla velocità di reazione.
Velocità di reazione. Costante di velocità. Equazione di Arrhenius. Gli enzimi:
meccanismi generali d’azione. Coenzimi: co-subtrati e gruppi prostetici. Le vitamine
come precursori di coenzimi. Classificazione degli enzimi. Principali meccanismi di
catalisi: adattamento indotto, riduzione entropica, acido base, covalente. Cinetica
enzimatica. Effetto della concentrazione dell’enzima e della concentrazione del
substrato. Effetto della temperatura e del pH. Ipotesi e cinetica dello stato
stazionario. Equazione di Michaelis-Menten. Rappresentazione secondo
Lineweaver-Burk. Parametri cinetici fondamentali: numero di turnover, costante di
specificità, significato e metodo di calcolo. Reazioni a due substrati: meccanismo
sequenziale e a ping pong e loro rappresentazione grafica. Inibizione competitiva,
mista e incompetitiva: aspetti cinetici. Meccanismi di generali di regolazione degli
enzimi. Attivazione/inibizione per associazione/dissociazione di subunità.
Modificazioni covalenti. Allosteria: effetti di cooperativita’ omotropi, eterotropi,
positivi e negativi. Regolazione mediante proteolisi: enzimi digestivi, enzimi della
cascata coagulativa, le caspasi, gli enzimi lisosomi ali; ubiquitinazione e
proteosoma. I meccanismi proteolitici: serin-proteasi, cistein-proteasi, aspartil-
proteasi, metalloproteasi
Parte 4_ Approfondimento sul rapporto struttura-localizzazione-funzione delle
macromolecole biologiche
Premessa. In questa parte del corso cominceremo a comprendere come
funzionano i complessi macromolecolari nel contesto della fisiologia della cellula e
dell’organismo e si cercherà di comprendere la relazione esistente fra processi
biochimici ed effetti biologici, la fine regolazione alla quale questo processi sono
sottoposti e le conseguenze di eventuali alterazioni in questi processi.
- Le membrane biologiche: organizzazione delle membrane cellulari e
subcellulari.
 Premessa. Le membrane cellulari non costituiscono solamente la barriera che
delimita la cellula o spazi intracellulari dall’ambiente che li circonda, ma forniscono
la struttura che consente alla cellula di scambiare informazioni con l’ambiente, di
regolare i processi metabolici, di poter interagire con le altre cellule e di muoversi.
L’esatta composizione e interazione dei componenti lipidici, glicidici e proteici delle
membrane è determinante per lo svolgimento delle loro molteplici funzioni
Contenuti. Come si generano le membrane biologiche; il doppio strato lipidico visto
come fluido bidimensionale; composizione dei diversi tipi di membrane biologiche.
Effetti degli acidi grassi insaturi e del colesterolo nelle membrane; distribuzione
asimmetrica dei fosfolipidi nelle membrane biologiche; movimengo di lipidi
attraverso il doppio strato: floppasi, scramblasi, flippasi. Il modello a mosaico fluido:
interazione fisica e funzionale fra i diversi costituenti della membrana: lipidi,
glicolipidi, proteine, glicoproteine e lipoproteine. I “lipid rafts”/zattere lipidiche.
- Modificazioni co e post-traduzionali delle proteine e segnali per la
localizzazione
Premessa. Le modificazioni a carico di amminoacidi incorporati nelle proteine
svolgono molteplici funzioni, fra cui: l’acquisizione della struttura nativa, la corretta
localizzazione cellulare; l’acquisizione di nuove proprietà strutturali e funzionali e
per regolare la stabilità.
Contenuti. Caratteristiche e funzione di modificazioni co- e post-traduzionali:
fosforilazione, acetilazione, metilazione, ubiquitinazione, sumoilazione,
glicosilazione, sulfonazione, legame a lipidi, formazione di ponti disolfuro. La
proteolisi nella maturazione degli ormoni. GPI-linked proteins. Interazione con
gruppi prostetici. I processi di indirizzamento cellulare. Segnali d’ingresso e
ritenzione nel RE; sequenze di localizzazione lisosomale, nucleare e mitocondriale;
meccanismi di indirizzamento verso la membrana plasmatica e di secrezione.
- Rapporto struttura-funzione delle proteine
Premessa. Una volta compresa la complessità delle strutture proteiche,
cercheremo di comprendere in maggior dettaglio come queste strutture siano
collegate alle loro funzioni e come queste si siano evolute per svolgere tali funzioni.
Contenuti. Interazione proteina ligando: il grado di saturazione, costante di
dissociazione; Proteine di trasporto extracellulare, proteine che legano l’O2. Le
globine; struttura del gruppo EME. Mioglobina: struttura, interazione con il gruppo
EME, curva di saturazione. Emoglobina: struttura e funzione. Curva di saturazione.
Allosteria T/R. Interazione tra i siti di legame: cooperativita’. Calcolo del grado di
cooperativita’ tra siti di legame uguali appartenenti alla stessa proteina oligomera.
Equazione e coefficiente di Hill. Regolazione dell’affinità di Hb per il suo ligando da
parte di: O2, CO2, H+ e loro ruolo negli scambi gassosi a livello polmonare e
tissutale. Ruolo di 2,3 bisfosfoglicerato (BPG) nella regolazione della affinita’di Hb
per O2. Cenni di fisiologia respiratoria. Basi molecolari delle talassemie,
emoglobinopatie e meteglobinemie. Proteine con funzione di riconoscimento e
difesa: le immunoglobuline: classificazione generale, struttura e meccanismi di
 interazione con l’antigene. Cenni sul riarrangiamento genico che genera le regioni
variabili delle catene pesanti e leggere.
Unità strutturale contrattile: organizzazione morfologica e molecolare della fibra
muscolare, delle miofibrille e del sarcomero. Meccanismo biochimico della
contrazione: regolazione dell’attività del complesso acto-miosinico, ruolo di ATP e
degli ioni calcio. Proteine del citoscheletro. Meccanismo di polimerizzazione di
actina, proteine che legano l’actina e regolano la sua polimerizzazione. Microtubuli:
struttura, meccanismo di polimerizzazione e ruolo intracellulare. Motori molecolari:
chinesine e dineine. Struttura e meccanismo di avanzamento ATP-dipendente sul
microtubulo. I filamenti intermedi: caratteristiche funzionali e meccanismo di
polimerizzazione. Proteine della matrice extracellulare: laminine, fibronectina,
collageni, elastina.
- Trasporto di molecole attraverso le membrane: biochimica del traffico
vescicolare
Premessa. Il traffico vescicolare consente il rapido spostamento di molecole e
liquidi dall’interno della cellula verso l’ambiente extracellulare (esocitosi) e
viceversa, dal microambiente verso l’interno della cellula (endocitosi); nonché il
flusso di liquidi e molecole da un compartimento intracellulare ad un altro. Il traffico
vescicolare consente, inoltre, di rinnovare e modificare rapidamente la
composizione lipidica e proteica delle membrane. Il processo di endocitosi è,
inoltre, indissolubilmente legato alle vie di segnalazione innescate dal recettore
sulla membrana plasmatica e sostenute e variamente modulate durante l’endocitosi
del recettore stesso. Contenuti. Cenni sui meccanismi generali di endocitosi. Il
flusso delle vescicole di endocitosi: dalla membrana plasmatica al lisosoma.
Meccanismi di curvatura e scissione delle membrane: le proteine EHD e le proteine
contenenti i domini BAR; il ruolo della dinamina. Endocitosi mediata da recettori.
Endocitosi mediata da clatrina, struttura della clatrina e le proteine adattatrici.
Endocitosi non dipendente da clatrina: le caveole. Meccanismi biochimici della
fusione delle vescicole: le proteine SNARE. Meccanismi d’azione della tossina
botulinica.
- Trasporto di molecole attraverso le membrane: trasportatori e canali.
Premessa. Cellula e organelli per mantenersi integri, ma in comunicazione con
l’ambiente che li circonda, devono regolare il traffico di molecole e ioni che entrano
e che escono attraverso l’attività di canali o trasportatori, con l’eventuale consumo
di energia.
Contenuti. Meccanismi generali di trasporto attraverso le membrane. Trasporto non
mediato; trasportatori e canali, il trasporto facilitato, ed il trasporto attivo. Le pompe
ioniche: Na+/K+ e H+ ATP-ase. Sistemi di co-trasporto e antiporto. I trasportatori
ABC. Membrane eccitabili, potenziali d’azione e neurotrasmissione. Canali
voltaggio-dipendenti per il Na+, K+ e Ca2+. Canali ionici controllati da ligandi: il
recettore canale per acetilcolina; meccanismi di desensitizzazione dei canali.
Meccanismo biochimico della segnalazione sinaptica.
Parte 5_ Trasduzione di segnali regolatori dall’esterno all’interno della cellula
Premessa. In questa parte del corso verranno illustrate i principi base delle
principali vie di trasduzione attraverso le quali i segnali provenienti dall’ambiente
extracellulare vengono trasmessi all’interno della cellula, amplificati, modulati e
convertiti in risposte cellulari di tipo metabolico e di variazione di espressione
genica
Contenuti. Meccanismi generali di trasduzione dei segnali extracellulari. Principi
generali di interazione di molecole segnale (ligandi) con i loro specifici recettori.
Caratteristiche chimico-fisiche dei ligandi e dei loro rispettivi recettori.
Classificazione dei tipi di segnalazione: endocrina, paracrina, sinaptica, autocrina,
iuxtacrina. Modelli teorici per la caratterizzazione delle vie di segnalazione negli
organismi pluricellulari. Classificazione delle molecole che partecipano alle vie di
segnalazione: i secondi messaggeri e le proteine del segnale. Generalità sulla
organizzazione strutturale delle proteine del segnale: dominii (sequenze) ricorrenti
e loro funzioni. I fosfoinositidi nella trasduzione del segnale. Modelli di
associazione/integrazione di molecole di segnalazione con il bilayer lipidico.
Formazione di complessi di segnalazione. Caratteristiche del processo di legame
e dei meccanismi di spegnimento del segnale: specificità, sensibilità, affinità,
cooperatività, amplificazione, integrazione, desensibilizzazione, adattamento.
Meccanismi proposti per l’effetto soglia e per il meccanismo di feedback positivo.
specificità, convergenza e divergenza delle risposte biologiche.
Classificazione dei recettori. Rassegna delle principali famiglie di recettori di
membrana. Recettori di adesione cellula-cellula e cellula-matrice. Struttura e
funzione delle molecole di adesione (“Cell Adhesion Molecules”, CAM) IgSF CAM,
selectine e caderine. Funzione delle caderine nei complessi di giunzione cellula-
cellula e ruolo della beta catenina nella segnalazione. Le integrine: interazione con
la matrice extra cellulare nella formazione delle adesioni focali e degli
emidesmosomi. I recettori accoppiati a proteine G (GPCR): struttura e meccanismo
d’azione dei GPCR e delle proteine G eterotrimeriche: specificità
dell’accoppiamento recettore/proteina G e dell’accoppiamento proteina G/effettori;
meccanismo molecolare della desensitizzazione recettoriale. Le proteine G
eterotrimeriche: meccanismi d’azione delle subunità α e delle subunità βγ. Sistemi
effettori di proteine G eterotrimeriche produttori di secondi messaggeri intracellulari:
adenilato ciclasi, AMPciclico (cAMP), Proteina Chinasi A (PKA). Le fosfodiesterasi.
Meccanismo d’azione delle tossine batteriche di pertosse e colera. Il meccanismo
biochimico del sistema β-adrenergico come esempio di trasduzione dei GPCR e
del meccanismo di desensitizzazione del recettore. Sistemi effettori di proteine G:
le fosfolipasi C: meccanismo d’azione. Secondi messaggeri diacilglicerolo (DAG) e
Inositolo trisfosfato (IP3). Aumento IP3-dipendente di Ca2+ citosolico. Meccanismi
di segnalazione Ca2+-dipendenti. Meccanismi di controllo della concentrazione
basale di Ca2+. Calmodulina (CaM): struttura e meccanismo d’azione. Proteine
CaM-Ca2+-dipendenti: CaM-chinasi. Ruolo metabolico di DAG e Ca2+ nella
segnalazione cellulare. Le Proteina Chinasi C (PKC). Meccanismi biochimici della
segnalazione delle percezioni sensoriali: visione, olfatto, gusto. Recettori tirosina
chinasi (TKR): assetto strutturale e meccanismo generale di segnalazione. Ruolo
dell’interazione domini SH2/fosfotirosine nel reclutamento e attivazione dei
pathways di trasduzione del segnale. Segnalazione a valle dei recettori TKR: vie
delle small G-proteins (Ras e membri della superfamiglia Ras), di MAP-chinasi e di
fofatidilinositolo 3 chinasi (PI-3K). Ruolo di PKB/Akt nella segnalazione PI-3K-
dipendente. Meccanismo di segnalazione di insulina come esempio di
segnalazione dipendente da recettore tirosina chinasi. Meccanismi di alterazione
della via di EGFR nelle cellule tumorali. Proteine tirosina-chinasi solubili. La famiglia
di SRC, struttura e meccanismo di regolazione della proteina SRC. Recettori
associati a tirosina chinasi: classificazione generale dei recettori per citochine e
ormoni glicoproteici, la via di JAK/STAT. Segnalazione da interferone α e
eritropoietina. Serina e treonina chinasi recettoriali: la famiglia del recettore TGF-β.
Recettori con attività guanilato ciclasica; guanilato ciclasi solubili NO-dipendenti.
NO-sintetasi. Funzioni di cGMP. Azioni biologiche di NO mediate da cGMP.
Inibizione delle vie cGMP-dipendenti. Recettori intracellulari: meccanismi generali
di azione.