Volume 50 Numero 68 4 Settembre 2014 Pagine 9613–9784

ChemComm
Comunicazioni chimiche
www.rsc.org/chemcomm

ISSN 1359-7345

COMUNICAZIONE
T. Komatsu et al.
Un Escherichia coli trappola in microtubi di albumina di siero umano
 ChemComm
COMUNICAZIONE
Un Escherichia coli trappola in microtubi di
albumina di siero umano†
Questo articolo è distribuito con licenza Creative Commons Attribution 3.0 Unported.
Cita questo: chimica Comune,2014,
50, 9640
S. Yuge, M. Akiyama e T. Komatsu*
Articolo ad accesso aperto. Pubblicato il 10 giugno 2014. Scaricato il 05/11/2015 17:22:13.
Ricevuto il 14 maggio 2014,
Accettato il 10 giugno 2014
DOI: 10.1039/c4cc03632h
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Descriviamo la sintesi del modello di microtubi di albumina sierica umana (MT) ed
evidenziamo la loro Escherichia coli (E. coli) capacità di intrappolamento con
efficienza estremamente elevata. IlE. coli è stato caricato nello spazio poroso
unidimensionale all'interno del tubulo. MT simili
compreso un Fe3oh4 livello anche catturato E. coli e sono stati manipolati
dall'esposizione a un campo magnetico.
Strutture cave, cilindriche, su scala nanometrica che comprendono biomateriali,
cioè bionanotubi, hanno attirato una notevole attenzione a causa delle loro
potenziali applicazioni come dispositivi di intrappolamento molecolare,
contenitori per la somministrazione di farmaci e reattori enzimatici.1–13
Assemblaggio alternativo strato per strato (LbL) di proteine,4,6,7,9,10
DNA,5,8,11 e anticorpi12,13 nelle membrane nanoporose consente la
creazione di nanotubi intelligenti (NT) strutturalmente definiti con
reattività biochimiche versatili. L'interno dello spazio poroso
unidimensionale (1D) del tubulo può essere adattato mediante
deposizione di un materiale desiderato. Pertanto, molti ricercatori
hanno esplorato il caricamento di entità di dimensioni nanometriche
nel canale, come farmaci,9,12 sfere bioattive,9 colloidi inorganici,11
e virus infettivi.13 Un altro argomento impegnativo in questo campo
sarebbe l'intrappolamento di un organismo vivente. Escherichia coli
(E.coli), un batterio gram-negativo a forma di bastoncino, è il più piccolo
organismo del mondo su scala micrometrica (0,4-0,7 mlarghezza m, 2–4 m
lunghezza di m). Molti ceppi sono innocui, ma alcuni sierotipi possono
causare gravi avvelenamenti nell'uomo, come quello enteroemorragico
E. coli. O157.14 Se uno fosse in grado di generare un unico E. coli
trappola in microtubi proteici (MT), allora avrebbe un importante
contributo non solo alla chimica della bioseparazione, ma anche a
diversi aspetti della salute umana. Questa comunicazione è la prima a
descrivere la sintesi e la struttura dei MT a base di albumina sierica
umana (HSA) e ad evidenziare la loro eccellente
E. coli capacità di intrappolamento.
Dipartimento di Chimica Applicata, Facoltà di Scienze e Ingegneria, Università di
Chuo, 1-13-27 Kasuga, Bunkyo-ku, Tokyo 112-8551, Giappone. E-mail:
komatsu@kc.chuo-u.ac.jp
† Informazioni supplementari elettroniche (ESI) disponibili: sezione sperimentale, l'immagine
SEM di E. coli, l'immagine CLSM di CTC-E. coli, e la relazione tra tempo di miscelazione e vitalità
cellulare di E. coli. Vedi DOI: 10.1039/c4cc03632h
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Le MT sono state fabbricate mediante sintesi del modello utilizzando elettro-
montaggio statico LbL.9 In breve, poli con carica positivaL-arginina (PLA) e
HSA caricata negativamente sono stati depositati alternativamente (nove
cicli) sulla parete dei pori di una membrana in policarbonato tracciata (PC)
(1,2 mdimensione dei pori m). Successivo scioglimento del framework PC in
N,N-dimetilformammide e liofilizzazione del
nucleo liberato ceduto (PLA/HSA)9 MT come polvere bianca. Le
misurazioni SEM hanno rivelato la formazione di cilindri cavi uniformi
con 1.0 0.02 mm di diametro esterno e 148 5 nm di spessore della parete
(Fig. 1a e b). Le lunghezze dei tubi (circa. 25 mm) coincideva bene con il
Profondità dei pori della membrana PC. Al contrario, 12 strati (PLA/HSA)6 Le
MT erano rugose e fragili, il che implica che l'iniezione a sei cicli
non è suciente per generare MT rigidi. Abbiamo concluso che è necessaria
una deposizione di almeno nove cicli per costruire un robusto 1mcilindro di
larghezza m dalla nostra sintesi del modello. Sulla base del principio
generale della crescita della membrana LbL, abbiamo ipotizzato un modello
di cilindro a nove strati. Lo spessore medio di un doppio strato PLA/HSA nel
MT è stimato in 16,4 nm. Se si postula che le dimensioni di HSA siano 8 nm
dai dati della struttura monocristallina15
e analisi di diffusione di raggi X a piccolo angolo,16 quindi lo spessore
dello strato di PLA è calcolato per essere 8,4 nm, che è tra i valori
riportati per i tipici strati di polielettrolita preparati nello stampo
poroso mediante un processo a umido.17-19
L'ottenuto (PLA/HSA)9I MT sono stati dispersi in acqua deionizzata,
ottenendo una soluzione leggermente torbida. Per valutare la morfologia e
stabilità dei MT in acqua, la dispersione acquosa è stata liofilizzata sotto
vuoto. Le immagini al SEM hanno dimostrato che le pareti tubolari si sono
notevolmente gonfiate e che il loro spessore è diventato 250 7 nm in acqua
(Fig. 1c). È interessante notare che il diametro esterno è rimasto inalterato
(1,0 0,04mm). Di conseguenza, la dimensione dei pori interni è diminuita
per circa. 500 nanometri. Lo spessore medio di un singolo doppio strato di
PLA/HSA è stato misurato in 28 nm in acqua. Partendo dal presupposto che
la dimensione dell'HSA non è cambiata (r8nm),15,16 lo spessore dello strato
di PLA potrebbe essere di 20 nm. Questo valore è apparentemente
maggiore di quello della forma secca, ma è simile ai valori degli strati di
polielettrolita nei NT preparati in condizioni di pressione.9,20 Abbiamo
determinato il rapporto di rigonfiamento del PLA
strato (unPLA: un rapporto tra l'area della sezione nello stato rigonfio
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Fig. 1 Immagini SEM di (PLA/HSA)9 MT preparati utilizzando un modello di PC

poroso (Dp = 1.2 mm): (a, b) campioni essiccati e (c) campione liofilizzato dopo Fig. 2 (a) Aspetto delle piastre di agar LB spalmate con E. coli la dispersione è

rigonfiamento in acqua. (d) Immagine SEM di Fe3oh4(PLA/HSA)9 MT preparati quale stata incubata con (PLA/HSA)3 NT o (PLA/HSA)9 MT per 30 min

utilizzando un modello di PC poroso (Dp = 1.2 mm). (e) Illustrazione schematica di (dopo 16 h di coltura cellulare a 37 1C). (b) Relazione tra tempo di miscelazione e

E. coli intrappolato (PLA/HSA)9 MT. incidenza della colonia [noc(NT) o noc(MT)/noc(controllo) 100] (n = 3).

e quello allo stato essiccato) essere 2.1 (vedi ESI), che è quasi identico un HSA marcato con fluoresceina (f-HSA) è stato sfruttato come intermedio

ai dati riportati in letteratura per general componente strato, cedevole (PLA/HSA)7PLA/f-HSA/PLA/HSA MT (MT
polielettroliti (1,2–4,0).21,22 Morfologie del (PLA/HSA)9 fluorescenti). E. coli è stato anche colorato con 5-ciano-2,3-
I MT sono stati trattenuti per più di 24 ore in acqua a 25 1c. ditolil tetrazolio cloruro (CTC). Questo agente di etichettatura ha macchiato
Poi abbiamo misurato il E. coli capacità di cattura del (PLA/HSA)9 in modo specifico il bordo delE. coli asta (Fig. S2, ESI), che è abbastanza utile
MT. Le dimensioni diE. coli K12 (XL10-oro) che abbiamo usato erano 425 nm per distinguere il E. coli posizione nel tubo. Nelle immagini CLSM della
larghezza e circa 2-3 mm di lunghezza, come rivelato dalle misurazioni SEM (Fig. soluzione della miscela, la parete del tubo ha avuto una fluorescenza verde
S1, ESI). L'incidenza delle colonie della soluzione campione dopo la miscelazione (Em. 522 nm); la struttura cava era chiaramente visibile. CTC-E. coli ha
con i MT è stata valutata utilizzando un metodo standard di conteggio su piastra. anche mostrato una forte fluorescenza in rosso (Em. 630 nm). La
Primo,E. coli (1 108 CFU ml 1, 100 mL) è stato aggiunto al sovrapposizione di queste immagini con un'immagine DIC dimostra che
soluzione acquosa di (PLA/HSA)9 MT (circa. 150 mg ml 1, 900 mL).23 CTC-E. coli è stato caricato nello spazio poroso 1D della MT (Fig. 3).
La miscela risultante è stata incubata con leggera rotazione a 25 1C per Sorprendentemente, il bordo diE. coli apparso dal topo del
1–30 minuti. Quindi una parte della soluzione è stata stesa sulla piastra di
agar LB e coltivata a 371C per 16 ore. Le colonie che appaiono sulla piastra
[noc(MT)] erano nettamente inferiori a quelli di soggetti trattati in modo identico E. coli
senza i tubi [noc(controllo)]. Con nostra sorpresa,noc(MT) è diventato
completamente zero entro 30 minuti miscelandosi con i MT (Fig. 2a e b);
la resa di scomparsa (100 – incidenza delle colonie) ha raggiunto il 100%.
Incubazione con il sottile a 6 strati (PLA/HSA)3 nanotubi (NT) (circa. 200 nm
di diametro interno) non ha mostrato alcun cambiamento nella colonia
numero. Abbiamo ragionato che ilE. coli (425 nm di larghezza) è entrato nel
poro della MT (circa. 500 nm), anche se è troppo grande per entrare nel
canale stretto del NT (circa. 200nm).
Fig. 3 Immagini sovrapposte di DIC e CLSM di MT fluorescenti che incorporano
L'incorporazione di E. coli nella MT è stato dimostrato utilizzando la CTC-E. coli. (a) CTC-E. coli rimasto al terminale del tubo e (b) piccolo CTC-E. coli
microscopia confocale a scansione laser (CLSM). Per visualizzare il tubo, raggiunto la profondità del tubo. Ex. 488nm.

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Fig. 4 Relazione tra tempo di miscelazione e incidenza della colonia di E. coli
(n = 3).
nella maggior parte dei casi, formando così ''MT con tappo batterico'' (Fig.
1e e 3a). IlE. coli larghezza è solo leggermente inferiore alla dimensione dei
pori (circa. 500nm). Pertanto non può entrare in profondità all'interno del
tubulo. A volte, alcuniE. coli sono in grado di diffondersi nel canale e
raggiungere la profondità del tubo (Fig. 3b).
fa? E. coli ti piace molto il microspazio cavo 1D ad alta densità di
HSA? Per chiarire questo punto, abbiamo preparato MT comparabili
con diverse superfici interne utilizzando poli-L-acido glutammico sale
sodico (PLG) e poli(sodio 4-stirensolfonato) (PSS) (entrambi polimeri
caricati negativamente) invece dell'ultimo strato di HSA. SEM
misurazioni hanno rivelato che il (PLA/HSA)8PLA/PLG MT e (PLA/HSA)8I
MT PLA/PSS possiedono le stesse strutture (esterno/interno
diametri e lunghezza) come (PLA/HSA)9 MT. Com'era prevedibile, questi MT
senza la parete dei pori HSA non potevano catturareE. coli (figura 4). Noi
dedotto che la parete della superficie interna del tubo deve essere
costituita da HSA per intrappolare E. coli. L'HSA può legare reversibilmente
molte specie batteriche interagendo con le proteine di superficie espresse.
24 I batteri si muovono in risposta a uno stimolo chimico, cioè chemiotassi.
Per esempio,E. coli dirige i suoi movimenti secondo determinate sostanze
chimiche nell'ambiente.25 Abbiamo ragionato che più fattori
contribuire al E. coli cattura nel (PLA/HSA)9 MT.
Per chiarire il destino degli intrappolati E. coli, la vitalità cellulare era
misurato utilizzando il test WST. E 'degno di notaE. coli acco-
modificato nel (PLA/HSA)9 MT era metabolicamente inattivo. Dopo 1 h di
miscelazione, quasi tuttoE. coli capacità di proliferazione cellulare persa (Fig. S3,
ESI). Una possibile spiegazione è che E. coli la crescita potrebbe essere
bloccata bloccando la deviazione cellulare. Nello spazio ristretto della MT, i
batteri non possono riprodursi attraverso la riproduzione asessuata per
fissione binaria. Un altro meccanismo proposto è la degradazione della
parete dell'HSA da parte di OmpT, che è un'aspartil proteasi che si trova
sulla membrana esterna diE. coli.26 Questa proteasi sul E. coliLa superficie
dell'HSA entra in contatto con la parete interna dell'HSA e scinde il
polipeptide. Successivamente, lo strato di PLA cationico esposto potrebbe
causare citotossicità.
Inoltre, abbiamo introdotto una magnetite (Fe3oh4) strato di nanoparticelle
nel MT. Bioseparazione assistita da campo magnetico utilizzando
particelle sferiche incluso Fe3oh4 è stata un'area di particolare
interesse recente a causa delle sue diverse applicazioni mediche.27,28
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Fig. 5 (a) Fotografia della collezione di E. coli-caricato Fe3oh4(PLA/HSA)9
MT da un campo magnetico. (b) Aspetto delle piastre di agar LB spalmate con
E. coli dispersione incubata con Fe3oh4(PLA/HSA)9 MT per 30 min (dopo 16 h di
coltura cellulare a 37 1C).
Tuttavia, pochi rapporti descrivono l'uso di cilindri magnetici cavi per la
bioseparazione.12,17,29 Una MT basata su HSA con uno strato ferrimagnetico
diventerebbe una trappola amagneticamente reattiva per
E. coli. I tubi magnetici sono stati preparati utilizzando un LbL . simile
procedura di assemblaggio con Fe3oh4 nanoparticelle. Osservazioni SEM di
il Fe3oh4(PLA/HSA)9 I MT hanno rivelato la formazione di array altamente
ordinati dei MT con un diametro esterno di 1.0 0.03 0.0 mm e
la lunghezza massima di circa. 25 mm (Fig. 1d). Lo spessore della parete era
di 155 7 nm, leggermente più spesso di quello osservato in observed
il (PLA/HSA)9 MT.
Infine, il E. coli capacità di cattura di questi MT magnetici
è stato valutato. Come previsto, il Fe3oh4(PLA/HSA)9 I MT possono essere
raccolti mediante esposizione a un campo magnetico. Portando un
magnete al neodimio vicino alla cuvetta di quarzo compreso il
E. coli ssoluzione con il Fe3oh4(PLA/HSA)9 MT, i tubi marroni sono stati
attratti rapidamente dal magnete; la soluzione è diventata colore-
meno (Fig. 5a). Staccare il magnete dalla cuvetta ha liberato i MT nella fase
acquosa. Questa dispersione-raccolta indotta dal campo magnetico è stata
osservata essere reversibile. Poi una parte della tomaia
soluzione limpida in una cuvetta, in cui il E. coli caricato-Fe3oh4(PLA/
HSA)9 I MT sono stati raccolti in basso dal campo magnetico, sono stati
sparsi su una piastra di agar LB e coltivati a 37 1C per 16 ore.
Il numero di colonie che compaiono sulla piastra è diventato zero
dopo 30 min miscelazione con Fe3oh4(PLA/HSA)9 MT (Fig. 5b). La resa di
scomparsa ha raggiunto il 100%. Abbiamo concluso che il
E. coli entrato nel canale di Fe3oh4(PLA/HSA)9 MT in un simile
moda a quella di (PLA/HSA)9 MT.
In conclusione, i microtubi HSA della proteina del siero del sangue
intrappolato il E. coli perfettamente. L'efficienza della rimozione da parte di un singolo
trattamento con (PLA/HSA)9 MT era più di 7 ordini di log. Questo notevole
risultato servirà da innesco per produrre un nuovo e produttivo
campo dei sistemi di rimozione dei batteri. Ad esempio, eliminare-
zione di enteroemorragica E. coli O157, utilizzando (PLA/HSA)9 MTs,
dovrebbe essere di incredibile importanza medica. Inoltre,
E. coli-MT caricati contenenti un Fe3oh4 strato sono stati manipolati
magneticamente in soluzione. L'HSA ricombinante è attualmente prodotto
realizzato su scala industriale,30 che consente la produzione di queste
proteine MT per uso pratico.
Questo lavoro è stato sostenuto da un Grant-in-Aid per la ricerca
scientifica sull'area innovativa ''Coordination Programming'' (Area
2107, No. 21108013) da MEXT Japan, Grant-in-Aid for
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Ricerca esplorativa impegnativa (n. 26600030) da JSPS e una borsa di
ricerca congiunta dell'Istituto di scienza e ingegneria, Università di
Chuo.
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