LAB 3 ELETTROFORESI

A) SDS-PAGE monodimensionale su gel di Poliacrilammide con T in gradiente su gel discontinuo precast utilizzando
una cella elettroforetica verticale. Il gel di poliacrilammide precast in gradiente è stato acquistato dalla ditta BioRad e
si procede come di seguito riportato:

a. Assemblaggio della cella elettroforetica - Il docente e il tutor rimuovono il pettine dal gel di poliacrilammide e lo
inseriscono nella camera elettroforetica, ponendo una lastrina di plastica al posto del secondo gel in modo da
delimitare nella cella uno spazio interno in cui versano la soluzione tampone per la cella 25 mM Tris, 0.192 M
Glicina 0.1% SDS pH 8.3 sino al limite superiore del gel, sia nello spazio esterno alle lastrine in modo che l'estremità
inferiore del gel risulti immersa nella soluzione tampone:

b. Pretrattamento dei campioni: i campioni da caricare nell’SDS-PAGE devono essere opportunamente preparati e
precisamente devono essere denaturati con la formazione dei complessi SDS-proteine. Per ottenere questo risultato
ciascun campione deve essere addizionato (1:1) con la soluzione denaturante: 0.125 M TrisHCl, 4% SDS, 20%
glicerolo, 0.02% blue di bromofenolo pH 6.8, dopo aggiunta dell'agente riducente ditiotreitolo (DTT) o β-
mercaptoetanolo in modo da realizzare una conc finale = 150 mM per permettere la riduzione dei ponti disolfuro
eventualmente presenti nelle proteine, permettendo la denaturazione completa delle proteine e la formazione dei
complessi SDS-proteine. In ciascuna provetta Eppendorf trasferire 10µl di campione + 10µl della soluzione
denaturante e inserire le diverse provette Eppendorf inserite in un’apposita scarabattola che viene posta nel
bagnetto riscaldante a 100°C per 5 min.

c. Caricamento del campione nel gel: con la pipetta grigia (che può misurare volumi da 1 a 10 µL) il docente preleva
un opportuno volume di campione (5-10 µl) e procede al suo caricamento in uno specifico pozzetto per l'analisi
elettroforetica. Per caricare i campioni su un gel di poliacrilammide su sistema verticale occorre adagiare la punta del
puntale della pipetta tra le due lastrine di plastica dopo aver individuato il pozzetto da utilizzare (nel gel che abbiamo
utilizzato la porzione della lastrina di plastica antistante ciascun pozzetto era numerata (1-10). Premere
delicatamente ma a fondo il pistone della pipetta per depositare tutto il campione nel pozzetto. La presenza del
glicerolo nel campione ne aumenta la densità rispetto alla soluzione tampone presente all’interno del pozzetto e
facilita l’operazione di caricamento.

d. Corsa elettroforetica: dopo che tutti i campioni sono stati caricati, il tutor chiude la camera elettroforetica con il
coperchio contenente i cavi elettrici collegati all'alimentatore, e applica il campo elettrico (150V costanti). Da questo
momento si può notare lo spostamento del tracciante (colorato in blue) lungo il gel. Le proteine sono incolori e non è
possibile visualizzare il loro movimento. La corsa deve proseguire fino alla fuoriuscita del tracciante blue di
bromofenolo dal gel. A questo punto la docente e il tutor interrompono l'applicazione del campo elettrico,
spegnendo l'alimentatore. Solo dopo essersi accertati di aver interrotto l'applicazione del campo si può procedere
all'apertura del coperchio della camera elettroforetica ed estrarre le due lastrine contenenti il gel.

Separando le due lastrine il gel viene liberato e posizionato in una vaschetta.

e. Colorazione e decolorazione: prima di immergere il gel nella soluzione colorante di Coomassie Brillant Blue
colloidale BioSafe (privo di solventi organici) è necessario lavare il gel con acqua distillata e bisogna effettuare 3
cambi di acqua ogni 5 min. Dopo aver eliminato l'ultimo lavaggio in acqua, vengono addizionati 30 ml del colorante
Coomassie Brillant Blue Colloidale (BioSafe), il contenitore viene chiuso e la fase di colorazione prosegue per 60 min.
Successivamente il gel deve essere decolorato in acqua sino a decolorazione completa.

B) Isoelettrofocalizzazione (IEF): la docente mostra il sandwich creato con una lastrina di vetro che ha un sottile
spaziatore di plastica sui tre lati (tranne che sul lato superiore), su cui si pone un foglio di plastica e poi all’esterno
una seconda lastrina di vetro classica, in modo che ci sia una sottile intercapedine tra lastrina di vetro con spaziatore
e il foglio di plastica delimitato all’esterno dalla seconda lastrina di vetro. Per questo laboratorio non abbiamo
preparato un gel di poliacrilammide per l’IEF, ma se avessimo voluto farlo, dopo aver chiuso il sandwich con diverse
pinze metalliche a tenuta l’operatore avrebbe trasferito con una pipetta la soluzione contenente i monomeri di
acrilamide e bis-acrilamide, gli anfoliti nell’intervallo di pH prescelto, l’iniziatore radicalico persolfato d’ammonio e il
catalizzatore TEMED, nell’intercapedine tra la lastrina con lo spaziatore, il foglio di plastica e la seconda lastrina di
vetro, in modo da permettere la polimerizzazione del gel di spessore ridotto tra la lastrina con lo spaziatore e il foglio
di plastica,

In questo sistema elettroforetico orizzontale per l’IEF il gel che sta sul supporto di cellophane va posizionato
orizzontalmente sulla piastra di ceramica della camera elettroforetica orizzontale che viene collegata ad un bagnetto
refrigerante ad acqua per dissipare il calore che si genera per l’applicazione di alti voltaggi durante l’IEF.

b) Preelettroforesi: Collegare gli elettrodi, chiudere il coperchio e collegare i cavetti all’alimentatore. Applicare
una differenza di potenziale di 400 V e osservare se tutto procede senza intoppi. Annotare l’intensità di corrente
rilevata dall’alimentatore all’inizio della fase di preelettroforesi e nei momenti successivi, tenendo conto che ci si
aspetta una diminuzione dell’intensità di corrente mano mano che la fase di prelettroforesi procede. La
preelettroforesi è ritenuta conclusa quando l’intensità di corrente raggiunge un valore basso e costante (plateau).
Interrompere l’applicazione del campo elettrico

c) Caricamento dei campioni: conclusa la fase di prelettroforesi, è necessario aprire il coperchio della cella
elettroforetica, sollevare il vassoio degli elettrodi e procedere al caricamento dei campioni mediante deposizione
direttamente sul gel dei campioni (piccoli volumi tipicamente 10 – 15 l) mediante una pipetta automatica allineando i
campioni grazie ai quadretti di carta millimetrata. Attenzione: ricordate che non è necessario che tutti i campioni
siano allineati, anzi il risultato della IEF è indipendente dalla posizione di ciascun campione nl gel.

d) Interruzione della corsa: Nell’IEF non si usa il tracciante. Per decidere quando il campo elettrico applicato
deve essere interrotto possiamo osservare la diminuzione dell’intensità di corrente durante l’IEF e interrompere la
corsa quando l’intensità di corrente ha raggiunto il suo valore minimo (fase di plateau).

e) Colorazione e decolorazione.

C) Elettroforesi bidimensionale: Esaminare con attenzione la strumentazione disponibile per poter combinare l’IEF
su strip di poliacrilammide contenente un gradiente di pH immobilizzato con l’SDS-PAGE utilizzando un gel con un
pozzetto unico delle dimensioni della strip su cui è stata fatta l’IEF (7 cm, 11 cm, 18 cm, 24 cm) e un singolo pozzetto
per la miscela di proteine a PM noto che fornirà un riferimento per la migrazione delle proteine nella seconda
dimensione. Al termine dell’IEF la strip viene equilibrata con una soluzione di equilibrazione contenente SDS, urea
8M, agente riducente, seguita da una seconda equilibrazione con una soluzione di equilibrazione contenente SDS,
urea 8M, in presenza dell’agente alchilante Iodoacetamide e in assenza dell’agente riducente, e quindi viene inserita
con attenzione nel pozzetto e viene addizionata una soluzione di agarosio solubilizzata a 100°C che a temperatura
ambiente gelifica riempendo tutti i piccoli spazi tra la strip e il gel di poliacrilammide in modo che il passaggio della
corrente non abbia interruzioni tra il gel dell’IEF (strip) e il gel dell’SDS-PAGE permettendo la regolare migrazione
delle proteine tra le due dimensioni.