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Bisogna

ora eseguire la precipitazione del DNA dalla soluzione: essa avviene per mezzo dell'etanolo
ghiacciato. Il DNA è insolubile in etanolo ghiacciato, perciò aggiungendolo alla soluzione il DNA
precipita so3o forma di filamenH gelaHnosi bianchi.
La soluzione verrà poi centrifugata e il precipitato di DNA, risospeso in acqua disHllata sterile o in
una opportuna soluzione tampone, sarà pronto per le successive determinazioni.

PCR (Polymerase Chain Reac4on)

Si tra3a di una tecnica innovaHva che consiste nell’amplificazione specifica di segmenH di DNA
mediante reazioni a catena della DNA polimerasi (Fig. 6).
Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA a doppio filamento e due corte sequenze
oligonucleoHdiche (primer), di cui una complementare ad un tra3o di filamento a una estremità
del DNA da amplificare (forward primer) e l’altra complementare ad un altro tra3o posto all’altra
estremità (reverse primer), in
presenza di una DNA polimerasi
termostabile e di una miscela di
desossinucleoHdi trifosfaH in
appropriate condizioni di reazione,
è possibile copiare numerosissime
volte il tra3o compreso tra i due
primers, semplicemente facendo
variare ciclicamente la temperatura
di reazione.
Infa5, raggiunta la temperatura di
denaturazione (circa 95°C), la
doppia elica si apre (fase di
d e n a t u r a z i o n e ) , r e n d e n d o Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR.
disponibile lo stampo per una
eventuale sintesi delle catene
complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della
loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo
prima che si rinaturi e, in presenza di una DNA polimerasi con un opHmum di temperatura elevato
(circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a parHre dai primer (fase di sintesi del DNA o extension),
procedendo lungo i filamenH singoli.
Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne o3engono due. Ripetendo il
ciclo "denaturazione – annealing – extension" numerose volte (in genere da 20 a 30), si o5ene una
massiccia amplificazione specifica di un dato tra3o di DNA che può quindi essere analizzato e
studiato in de3aglio. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenH:
♦ è molto rapido (da 60 a 90 minuH),
♦ la manualità è semplicissima,
♦ è automaHzzato,
♦ i risultaH sono visualizzabili con facilità mediante ele3roforesi del DNA
ImportanH ambiH di uHlizzo della PCR sono la diagnosi prenatale di mala5e geneHche e le indagini
di medicina legale (sia civile che penale).
Termociclatori
Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero processo in modo
automaHco all’interno di strumenH de5 termociclatori (thermal cyclers), in grado di variare
ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Il costo di un thermal cycler si
aggira sui 10.000 euro.
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Fig. 7 Termociclatore

Un esempio di profilo di amplificazione standard impostato mediante un termociclatore (Fig. 7) è il


seguente:
1. denaturazione del DNA: 30 sec a 94°C
2. appaiamento (annealing) dei primers: 30 sec a 50°-60°C 30-35 cicli
3. sintesi (extension) di DNA: 30 sec- 5 minuH a 72°C


Taq polimerasi
Il successo della PCR è stato possibile grazie anche all’uso di una DNA polimerasi termostabile
estra3a da baUeri termofili (che vivono ad elevate temperature). Una DNA polimerasi uHlizzata
nelle reazioni della PCR è la Taq polimerasi, estra3a dal ba3erio Thermus aqua>cus. L’isolamento
di DNA polimerasi termostabili ha sollevato gli operatori dall’ingrato compito di aggiungere enzima
fresco ad ogni ciclo di reazione!

Scelta dei primer


Per ogni PCR, è necessario usare due primer (forward e reverse)
La scelta della coppia di primer è criHca per una buona riuscita della PCR, ovvero per o3enere
l’amplificazione di un tra3o di DNA in modo specifico.
I primer devono essere “disegnaH” a livello di sequenze uniche nel genoma (presenH una sola
volta), in modo che possano appaiarsi al DNA solo nella zona di interesse e non in altre zone.

EleUroforesi su gel di agarosio

E’ una tecnica che consente di separare in base alle loro


dimensioni (peso molecolare) molecole dotate di carica,
facendole migrare su un gel in presenza di un campo ele3rico. Il
gel può essere immaginato come una rete tridimensionale
a3raverso le cui maglie migrano le molecole so3o l’azione di un
campo ele3rico. Il campo ele3rico è generato da un apparecchio,
de3o alimentatore ( Fig 8).
Per separare molecole di DNA si usano gel di agarosio. Le
molecole di DNA sono cariche negaHvamente per la presenza di Fig. 8. Cella elettroforetica e alimentatore.
gruppi fosfato e migrano dal polo negaHvo verso il polo posiHvo.
Per un certo intervallo di pesi molecolari, la velocità di migrazione è
funzione del loro peso molecolare: tanto più grande è la molecola di DNA, tanto minore è la
velocità di migrazione, tanto più piccola è la molecola di DNA, tanto più velocemente migra. Le

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molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di
migrazione.
Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate mediante
ele3roforesi, viene “caricato” sul gel anche il cosidde3o marcatore di peso molecolare, ossia una
miscela di frammenH di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei
frammenH a peso molecolare noto con quella dei frammenH di DNA in esame, è possibile
calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza.
Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di
nucleoHdi (basi) che lo cosHtuiscono, di solito esso viene espresso in paia di basi (bp).
La separazione ele3roforeHca dura circa 1 ora. Al termine, i vari frammenH di DNA, essendo
incolori, possono essere visualizzaH, immergendo il gel in un colorante. Il DNA delle diverse classi
di peso molecolare è visibile so3o forma di bande disHnte: sono le cosidde3e bande di DNA.
Per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel, all’agarosio si aggiunge l’EuroSafe,
una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di eme3ere fluorescenza se esposta a luce UV.
Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultraviole3a (Fig. 9).

Fig. 9. Osservazione del gel alla luce ultravioletta.

5. Iden4ficazione di un OGM

Impostazione del problema

Il mais (Zea mais, de3o anche granoturco) OGM colHvato, è stato trasformato per fare sì che sia
resistente agli inse5 nocivi, tollerante agli erbicidi, o con entrambe le modificazioni.

5.1 Resistenza agli inseH


La resistenza è o3enuta facendo produrre alla pianta una proteina tossica per gli inse5 prodo3a
dal Bacillus thuringiensis, un ba3erio del terreno uHlizzato anche in agricoltura biologica come
inse5cida naturale. Questo microrganismo possiede un gene (Bt) che codifica per la proteina Cry,
che è in grado di legarsi sele5vamente a specifici rece3ori localizzaH nell'epitelio intesHnale delle
larve di alcune specie d’inse5. Il legame della proteina con i rece3ori provoca la distruzione
dell'epitelio intesHnale e di conseguenza la morte di quesH inse5.
Esistono diversi Hpi di proteine Cry prodo3e da differenH so3ospecie di Bacillus thuringiensis che
esibiscono un’elevata specificità di azione nei confronH di diversi Hpi d’inse5. I mammiferi, non
avendo i rece3ori per le proteine Cry, sono resistenH alla sua azione tossica.
Per conferire ad una specie vegetale il cara3ere di resistenza nei confronH di un parHcolare Hpo di
inse3o è sufficiente introdurre nel suo genoma il gene che codifica per la tossina Cry specifica per
quell'inse3o. In tal modo la pianta sarà in grado di produrre la proteina Cry che esplica la sua
azione bioinse5cida quando l'inse3o dannoso a3acca la pianta, cibandosi dei suoi tessuH.
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