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ora eseguire la precipitazione del DNA dalla soluzione: essa avviene per mezzo dell'etanolo
ghiacciato. Il DNA è insolubile in etanolo ghiacciato, perciò aggiungendolo alla soluzione il DNA
precipita so3o forma di filamenH gelaHnosi bianchi.
La soluzione verrà poi centrifugata e il precipitato di DNA, risospeso in acqua disHllata sterile o in
una opportuna soluzione tampone, sarà pronto per le successive determinazioni.
Si tra3a di una tecnica innovaHva che consiste nell’amplificazione specifica di segmenH di DNA
mediante reazioni a catena della DNA polimerasi (Fig. 6).
Il principio è molto semplice. Data una sequenza di DNA a doppio filamento e due corte sequenze
oligonucleoHdiche (primer), di cui una complementare ad un tra3o di filamento a una estremità
del DNA da amplificare (forward primer) e l’altra complementare ad un altro tra3o posto all’altra
estremità (reverse primer), in
presenza di una DNA polimerasi
termostabile e di una miscela di
desossinucleoHdi trifosfaH in
appropriate condizioni di reazione,
è possibile copiare numerosissime
volte il tra3o compreso tra i due
primers, semplicemente facendo
variare ciclicamente la temperatura
di reazione.
Infa5, raggiunta la temperatura di
denaturazione (circa 95°C), la
doppia elica si apre (fase di
d e n a t u r a z i o n e ) , r e n d e n d o Fig. 6. Schema del processo di amplificazione di un frammento di DNA tramite PCR.
disponibile lo stampo per una
eventuale sintesi delle catene
complementari. Quando la temperatura si abbassa, in virtù delle loro minori dimensioni e della
loro concentrazione, i primer si legheranno (fase di appaiamento o annealing) al DNA stampo
prima che si rinaturi e, in presenza di una DNA polimerasi con un opHmum di temperatura elevato
(circa 72°C), inizierà la sintesi di DNA a parHre dai primer (fase di sintesi del DNA o extension),
procedendo lungo i filamenH singoli.
Al termine del primo ciclo di PCR da una doppia elica di DNA se ne o3engono due. Ripetendo il
ciclo "denaturazione – annealing – extension" numerose volte (in genere da 20 a 30), si o5ene una
massiccia amplificazione specifica di un dato tra3o di DNA che può quindi essere analizzato e
studiato in de3aglio. Il metodo di analisi del DNA mediante PCR presenta vantaggi molto evidenH:
♦ è molto rapido (da 60 a 90 minuH),
♦ la manualità è semplicissima,
♦ è automaHzzato,
♦ i risultaH sono visualizzabili con facilità mediante ele3roforesi del DNA
ImportanH ambiH di uHlizzo della PCR sono la diagnosi prenatale di mala5e geneHche e le indagini
di medicina legale (sia civile che penale).
Termociclatori
Il successo della PCR è dovuto in gran parte alla possibilità di far avvenire l’intero processo in modo
automaHco all’interno di strumenH de5 termociclatori (thermal cyclers), in grado di variare
ciclicamente la temperatura tra le varie fasi di ogni ciclo di PCR. Il costo di un thermal cycler si
aggira sui 10.000 euro.
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Fig. 7 Termociclatore
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molecole di DNA di diversa lunghezza vengono pertanto separate in base alla diversa velocità di
migrazione.
Per poter determinare la lunghezza delle molecole di DNA in esame separate mediante
ele3roforesi, viene “caricato” sul gel anche il cosidde3o marcatore di peso molecolare, ossia una
miscela di frammenH di DNA di cui è noto il peso molecolare. Confrontando la posizione dei
frammenH a peso molecolare noto con quella dei frammenH di DNA in esame, è possibile
calcolarne il peso molecolare, ossia la lunghezza.
Dato che il peso molecolare di un frammento di DNA è proporzionale al numero di coppie di
nucleoHdi (basi) che lo cosHtuiscono, di solito esso viene espresso in paia di basi (bp).
La separazione ele3roforeHca dura circa 1 ora. Al termine, i vari frammenH di DNA, essendo
incolori, possono essere visualizzaH, immergendo il gel in un colorante. Il DNA delle diverse classi
di peso molecolare è visibile so3o forma di bande disHnte: sono le cosidde3e bande di DNA.
Per poter visualizzare il DNA, durante la preparazione del gel, all’agarosio si aggiunge l’EuroSafe,
una sostanza che ha la proprietà di legarsi al DNA e di eme3ere fluorescenza se esposta a luce UV.
Alla fine della corsa, le bande si visualizzano esponendo il gel alla luce ultraviole3a (Fig. 9).
5. Iden4ficazione di un OGM
Il mais (Zea mais, de3o anche granoturco) OGM colHvato, è stato trasformato per fare sì che sia
resistente agli inse5 nocivi, tollerante agli erbicidi, o con entrambe le modificazioni.