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Saggi per la determinazione della

concentrazione delle proteine

Nicola Franceschini
Facoltà di Biotecnologie
aa 2009-2010
Determinazione Quantitativa delle Proteine

• Nessun metodo soddisfa pienamente la


necessità di determinare la concentrazione delle
proteine in soluzione di uno specifico campione

• La scelta di un metodo dipende dalla natura


della proteina, la natura degli altri componenti
presenti nel campione, la velocità, l’accuratezza
e la sensibilità del metodo
Metodi più comuni per la
Determinazione delle Proteine
• Analisi gravimetrica
• Test Biureto
• Saggio Folin-Ciocalteau (Lowry)
• Saggio dell’acido Bicinconinico (BCA)
• Saggio del Dye-Binding (Bradford)
• Assorbimento nell’Ultravioletto
• Saggio Kieldhal
Metodo gravimetrico
• Si basa sulla pesata di una determinata
quantità di proteina allo stato liofilizzato in
un opportuno volume di acqua o tampone
• Tra le più precise delle tecniche richiede
grandi quantità di proteina
Test Biureto

Catena peptidica Complesso Biureto (color porpora)

• Gornall, AG, CS Bardawill, and MM David. J. Biol. Chem. 177: 751. 1949.
• Layne, E. Spectrophotometric and Turbidimetric Methods for Measuring Proteins. Methods in Enzymology 10: 447-455. 1957.
• Robinson, HW and CG Hogden. J. Biol. Chem. 135: 707. 1940.
• Slater, RJ (ed.). Experiments in Molecular Biology. Clifton, New Jersey: Humana Press, 1986. P. 269.
• Weichselbaum, TE. Am. J. Clin. Pathol. Suppl. 10: 40. 1946.
Test Biureto
• Riproducibile
• Poche sostanze interferenti
(ammonio solfato è uno di questi)

• Minori deviazioni che con il Lowry o i metodi


ultravioletti

• Richiede grandi quantità di proteine (1-20mg)


• Bassa sensibilità
Test Biureto
1. Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima delle misure.

2. Diluire il campione con tampone a una concentrazione di 1-20


mg/ml . Aggiungere 1 ml a ogni provetta. Preparare I campioni in
duplicato.

3. Preparare una provetta per il bianco con 1 ml di tampone.

4. Preparare degli standard partendo da una soluzione 10 mg/ml di


albumina sierica bovina. Gli standards devono coprire l’intervallo
da 1 a 10 mg di proteine.

5. Aggiungere 9 ml di reagente Biureto a ogni provetta, agitare e


lasciare 20 min.

6. Leggere a 550 nm.


Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)

•Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951.
•Oostra, GM, NS Mathewson, and GN Catravas. Anal. Biochem. 89: 31. 1978.
•Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
•Hartree, EF. Anal Biochem 48: 422-427 (1972).
Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)
• Ampio intervallo di sensibilità
• Può essere effettuato a temperatura ambiente
• 10-20 volte più sensibile che le misure UV
• Può essere realizzato su piastre multiwell

• Molte sostanze interferiscono con il saggio


(acidi forti, solfato di ammonio)
• Necessita di molto tempo per la realizzazione
• Il saggio è sensibile alla luce
• L’intensità del cromoforo varia con il tipo di
proteina
Saggio Folin-Ciocalteu (Lowry)
1. Aggiungere in provetta campioni contenenti fino a 100 µg di
proteina.

2. Portare le provette a un volume di 1 mL totale con acqua.

3. Preparare la miscela di saggio e diluire il reagente Folin-Ciocalteu .

4. A ogni provetta aggiungere 5 mL di miscela di saggio e agitare


con vortex.

5. Incubare le provette a temperatura ambiente per 10 min.

6. Aggiungere 0.5 mL di Folin-Ciocalteu, agitare immediatamente.


7. Incubare a temperatura ambiente per 30 min.

8. Agitare le provette, azzerare lo spettrofotometro con il bianco e


misurare l’assorbanza a 500-750 nm.
Saggio acido Bicinconinico (BCA )

• P.K. Smith et al. (1985) Anal. Biochem. 150: 76.


• K. J. Wiechelman et al. (1988) Anal. Biochem. 175: 231
Saggio acido Bicinconinico (BCA)

• Molto sensibile e rapido se si usano alte


temperature
• Compatibile con molti detergenti
• Il reagente è stabile
• Piccole variazioni tra proteine diverse
• Ampio e lineare intervallo di lavoro

• La reazione non va a completamento se


condotta a temperatura ambiente
Saggio acido Bicinconinico (BCA)
1. Preparare la quantità necessaria di 1 volume di solfato di rame a 50
volumi di una soluzione di acido bicinconinico.

2. Prepare un set di provette contenenti il campione e albumina sierica


bovina nel range da 0 a 100 microgrammi. Ogni provetta deve
contenere un volume totale di 0.1 mL.

3. Aggiungere 2.0 mL del reagente in ogni provetta e agitare.

4. Incubare le provette a 60oC per 15 min.

5. Raffreddare le provette a temperatura ambiente e misurare


l’assorbanza a 562 nm.
Saggio Dye-Binding (Bradford)
• CBBG risponde soprattutto alle arginine
(otto volte che gli altri residui)
• Per proteine ricche di arginina è opportuno usare
• Uno specifico standard
• CBBG si lega a questi residui nella forma anionica
Assorbimento a 595 nm (blue)
• Il colorante libero in soluzione è nella forma
• cationica (blu)
Assorbimento massimo a 470 nm (rosso).

• Bradford, MM. A rapid and sensitive for the quantitation of microgram


quantitites of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248-254. 1976.
• Stoscheck, CM. Quantitation of Protein. Methods in Enzymology 182: 50-69 (1990).
Saggio Dye-Binding (Bradford)
• Veloce ed economico
• Altamente specifico per le proteine
• Molto sensibile [1-20 µg (micro saggio)
20-200 µg (macro saggio)]
• Compatibile con diverse sostanze
• Il colorante complessato si forma in
circa 15 min ed è stabile per circa 1
ora
• Curva standard non-lineare su un
ampio intervallo di concentrazioni
• Risposta variabile per proteine
diverse, quindi la scelta di uno
standard è molto importante
Saggio proteine BioRad
• Dopo 10 minuti, l’assorbanza può essere letta a 595 nm.
L’assorbanza è stabile per un’ora.
Saggio Dye-Binding (Bradford)
• Gli spettri di assorbimento anionico e cationico del colorante si
sovrappongono.
• Questo determina una curva standard non lineare, in realtà è lineare
su piccoli intervalli di concentrazione.
• Se il campione contiene più di 20 microgrammi, viene fuori una
curva di secondo ordine che fitta meglio che la curva lineare.
Saggio Dye-Binding (Bradford)
1. Accendere lo spettrofotometro 15 min. prima dell’uso

2. Diluire i campioni con tampone a una concentrazione di 1-20


microgrammi/ul

3. Preparare gli standards contenenti 1-20 microgrammi proteina


(albumina o gamma globuline) in un volume di 1000 µl

4. Preparare I campioni sconosciuti da misurare da 1 a 20


microgrammi di proteina per provetta .

5. Aggiungere 200 ul di reagente Bradford e complementare a 1000 ul


con acqua. Mescolare con forza e incubare 10 minuti a
temperatura ambiente .

6. Misurare l’assorbimento a 595.


Assorbimento ultravioletto 280 nm
• Può rappresentare un’ottima tecnica quando non si ha
alcuna idea della concentrazione di un campione che
deve essere assolutamente recuperato.
• Si usa in genere prima di passare a metodi più precisi e
sensibili
• La detrminazione si basa sull’assorbimento specifico
degli aminoacidi aromatici tirosina e triptofano
• La misura è soggetta a interferenza da altri componenti
cellulari e in particolare acidi nucleici
• Il metodo non è molto sensibile e presuppone l’uso di
cuvette di quarzo
• Il vantaggio reale è che il campione non viene distrutto e
la misura è molto rapida.
Ultraviolet Absorbance (pro e contro)
• Vantaggi
• Veloce
• Recupero campione
• Utile per fare screening di concentrazione

• Svantaggio
• Sensibile alla presenza contaminati come Sali e altre
molecole biologiche
• Essendo varia la composizione in aminoacidi elle
proteine è difficile la scelta di uno standard
• L’assorbanza è fortemente influenzata da pH e forza
ionica della soluzione.
Assorbimento Ultravioletto
Procedura

1. Azzerare lo spettrofotometro con acqua o tampone

2. Misurare l’assorbimento a 280 nm in cuvette di quarzo

3. Cambiare lunghezza d’onda a 260 nm, far lo zero con acqua o


tampone

4. Misurare l’assorbimento a 260 nm in cuvette di quarzo

5. Usare la seguente equazione per calcolare la concentrazione


proteica

[Proteina] (mg/mL) = 1.55*A280 – 0.76*A260


Metodo Kieldhal
• (1) Digestione
• + H2SO4 concentrato
• + catalizzatore
• azoto convertito in ione ammonio.
• (2) Neutralizzare con NaOH per ottenere NH3
• (3) distillare NH3 e intrappolare in acido borico.
• (4) Titolare con acido cloridrico.
• Calcolo:
• Grammi azoto/ grammo di campione =
• *(ml di campione - ml di bianco) × N acido × 0.014g/meq
peso del campione

• * ml di acido cloridrico richiesti per titolare il campione.


Metodo Kjeldhal
• svantaggi: non tutto l’azoto viene dalle proteine.
• Purine
• Pirimidine DNA, RNA, ecc.
• Urea
• Molti tessuti vegetali contengono > 50% N
non proteico
• % N × 6.25 = % Proteina
Note
• Usare vetreria pulita
• Usare cuvette pulite (in questo caso si usano provette in
policarbonato usa e getta)
• I saggi proteici sono influenzati fortemente dalla
composizione del campione (es. Detergenti, Sali ecc.)
• Accertarsi del funzionamento dello spettrofotometro e
accenderlo 20 minuti prima di iniziare le misure
Note
• Le curve standard vanno eseguite con le proteine
adeguate
• I valori calcolati per il campione devono stare sempre
all’interno di quelli ella curva standard
• Controllare la linearita’ della risposta delle proteine
facendo delle curve di diluizione
• Eseguire sempre un bianco con acqua o tampone usato
per la misura
• Mettere la concentrazione proteica sull’asse y per avere
una stima diretta della concentrazione proteica