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principi di base
1968:
Scoperta degli enzimi di
restrizione
1972:
Avanzamenti nelle
tecniche di trasferimento
del DNA e nell’uso di
plasmidi
DNA
hybridization,
1961
Transgene:
frammento di DNA esogeno integrato
stabilmente nel patrimonio genetico di
cellule animali o vegetali
Organismi utilizzati come modelli transgenici:
Transgenesi standard
Gene targeting
Transgenesi condizionale
Clonazione
Transgenesi standard
♂ vasectomizzato
Transgenesi standard
Work flow: STEP3
100-200X
♀ pseudogravida
Transgenesi standard
Work flow: STEP4
M C 1 2 3 4 5
C 1 2 3 4 5
Transgenesi standard
Efficienza
Transgenesi standard
Applicazioni: animali come bioreattori
Transgenesi standard
Vantaggi e svantaggi
AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA
X
AGGTGCCTGACT Gene inattivo
X
TTCAGCCGATCCA
Elettroporazione
Gene Targeting
Work flow: STEP2
X
Gene non attivo Sequenze di Integrazione sito-specifica (1/1000)
Tk - thymidine ricombinazione
kinase Omologa
Neor – resistenza Integrazione random
alla Neomicina
X
Gene Targeting
Work flow: STEP3
ES inserite in una
blastocisti di topo agouti
Gene Targeting
Work flow: STEP4
Topo “chimera”
Gene
Targeting
Gene Targeting
Applicazioni
Mario R. Capecchi
Oliver Smithies
Martin J. Evans
• RICOMBINAZIONE OMOLOGA
• L’inserzione del transgene è mirata
• Si conosce la localizzazione genica
dell’inserimento del transgene;
KO condizionali:
l’induzione della mutazione
tempo e tessuto specifica
Transgenesi condizionale
Il sistema Cre-loxP
Cre
KO condizionali
Il sistema Cre-loxP
Il sistema Cre-loxP
Ricombinazione omologa tra sequenze loxP
Il sistema Cre-loxP
Esempio di delezione tessuto specifica
DELEZIONE INSERZIONE
KO programmabile K-IN programmabile
Il sistema CreER-loxP
Delezione spazio/tempo specifica
TEMPO
SPAZIO
3 principal events:
CBS: cognate
binding site
Sistema a 3 elementi:
• Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina
tTA
Tetraycline controlled
transactivator
.
Il sistema TET-OFF
tTA: tetraycline
controlled
transactivator
MHC-tTA/tetO-Ro1 mice
were obtained by crossing a
transgenic mouse line that
expresses Ro1 receptor under
the control of a tetO gene and
another mouse line
expressing tTA gene under the
regulation of a heart-specific
MHC promoter.
Il sistema TET-OFF
VANTAGGI
• Ben note proprietà della Tc/DOX: farmacocinetica, buona
distribuzione tissutale, bassa tossicità, capacità di attraversare
membrane cellulari
• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5 ordini di
grandezza)
SVANTAGGI
• Attività residua del promoter minimale tetO-CMV
• Tossicità cellulare del transattivatore
• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti
• Basse cinetiche di induzione in vivo
Il sistema TET-ON
rtTA
Reverse tet-on
Tetraycline controlled
transactivator
.
Il sistema TET-ON
VANTAGGI
• Aumentata velocità di espressione del transgene: completa
attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di
attivazione del sistema tet-OFF (fino ad una settimana)
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Il sistema TET-ON/TET-OFF
http://www.zmg.uni-mainz.de/tetmouse/
Clonazione
SCNT
Cellule staminali ADULTE
Clonazione
Efficienza molto bassa & etica
Altre tecniche
Vettori retrovirali
Yac-transgenic mice
Vettori retrovirali
Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, Risposte immuni alle proteine virali,
grande capacità d'inserimento, infezione di nessuna integrazione nel genoma
cellule in divisione e non in divisione dell'ospite, espressione genica transitoria
Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio Limitate capacità per i transgeni, difficile
tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, generazione di alti titoli virali, presenza di
bassa immunogenicità e non patogenicità adenoviruds o herpevirus per la
moltiplicazione dei virus adeno-associati
Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta Possibile tossicità, rischio di
capacità d'inserzione, tropismo naturale per ricombinazione, nessuna integrazione
le cellule neuronali, seguita dalla produzione virale nel DNA dell'ospite
di alti titoli virali