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Ingegneria animale:

principi di base

Sara Della Torre


Adriana Maggi Lab
08.11.11
Manipolazione genetica tradizionale
Manipolazione genetica moderna – DNA RICOMBINANTE
Cosa mancava per passare dalla
manipolazione genetica tradizionale a
quella moderna?
1967:
Scoperta della DNA ligasi

1968:
Scoperta degli enzimi di
restrizione

1972:
Avanzamenti nelle
tecniche di trasferimento
del DNA e nell’uso di
plasmidi
DNA
hybridization,
1961

Double helix PCR


Watson and Crick, 1953 Kary Mullis, 1983
http://www.karymullis.com
Animale Transgenico:
animale nel cui genoma è stato inserito
uno o più frammenti di DNA esogeno

Transgene:
frammento di DNA esogeno integrato
stabilmente nel patrimonio genetico di
cellule animali o vegetali
Organismi utilizzati come modelli transgenici:

• Arabadopsis (plant) • Ratto


• C. elegans • Maiale
• Fruit flies • Pecora
• Xenopus (rana) • Capra
• Zebrafish • Mucca
• Topo
Tipi di transgene

• Piccole molecole di DNA ricombinante – geni o cDNA


legati a sequenze di DNA che permettono la corretta
espressione da parte della cellula ospite

• Construtti Reporter – promoter del gene desiderato


legato ad una cassetta di espressione la cui presenza può
essere facilmente rilevata; es.: GFP, lacZ, luciferasi

• Grandi molecole di DNA – yeast artificial chromosomes


(YACs) o bacterial artificial chromosomes (BACs)
Metodi di
Ingegneria animale
Metodi principali di ingegneria animale

Transgenesi standard

Gene targeting

Transgenesi condizionale

Clonazione
Transgenesi standard

Microiniezione di DNA lineare nella cellula uovo fecondata

• SCOPO: Guadagno di funzione


• CARATTERISTICA: inserzione random, casuale
Introduzione di una sequenza
di DNA purificata in uno dei
due pronuclei della cellula uovo
fecondata
Transgenesi standard
Work flow

• Preparazione degli oociti fecondati


1

• Preparazione dei costrutti


2

• Preparazione delle femmine “pesudogravide”


3 • Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

• Screening della progenie


4
Transgenesi standard
Work flow: STEP1

• Preparazione degli oociti fecondati


1

Cocktail ormonale per la


Raccolta degli oociti
superovulazione: Accoppiamento fecondati
• PMS (pregnant mares serum)
• HCG (human chorionic
gonadotropin) ♀



Transgenesi standard
Work flow: STEP2

• Preparazione dei costrutti


2

Costruzione del transgene Amplificazione del Purificazione del


transgene transgene
Transgenesi standard
Work flow: STEP3

• Preparazione delle femmine “pesudogravide”


3 • Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

Accoppiamento delle femmine


con maschio vasectomizzato

♂ vasectomizzato
Transgenesi standard
Work flow: STEP3

• Preparazione delle femmine “pesudogravide”


3 • Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”
Transgenesi standard
Work flow: STEP3

• Preparazione delle femmine “pesudogravide”


3 • Microiniezione e trasferimento nelle femmine “pseudogravide”

Trasferimento delle uova fecondate


microiniettate con il gene di interesse
nell’utero di femmina pseudogravida

100-200X
♀ pseudogravida
Transgenesi standard
Work flow: STEP4

• Screening della progenie


4

Estrazione DNA dalle code


della progenie

Analisi tramite PCR Analisi tramite Southern-blot

M C 1 2 3 4 5
C 1 2 3 4 5
Transgenesi standard
Efficienza
Transgenesi standard
Applicazioni: animali come bioreattori
Transgenesi standard
Vantaggi e svantaggi

• Metodo più utilizzato per produrre topi transgenici.

• L’inserzione del transgene è casuale; non si sa dove si è


localizzato il transgene;
• Non si può regolare il numero di copie introdotte nel
pronucleo, né quante si uniranno in concatameri per
l’integrazione;
• Bassa efficienza
Gene Targeting

Ricombinazione omologa in embrionic stem (ES) cells

• SCOPO: perdita o modifica di funzione


• CARATTERISTICA: inserzione mirata
Gene Targeting
Meccanismo: ricombinazione omologa

AGGTGCCTGACT TTCAGCCGATCCA

X
AGGTGCCTGACT Gene inattivo
X
TTCAGCCGATCCA

AGGTGCCTGACT Gene inattivo TTCAGCCGATCCA


Gene Targeting
Gene Targeting
Meccanismo di selezione positiva e negativa
Gene
Targeting
Gene Targeting
Work flow

• Preparazione delle cellule ES pluripotenti


1 • Trasfezione

• Selezione delle cellule ES


2

• Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti


3

• Screening della progenie


4
Gene Targeting
Work flow: STEP1

• Preparazione delle cellule ES pluripotenti


1 • Trasfezione

Preparazione delle ES Preparazione del transgene


pluripotenti dalla blastocisti

Gene non attivo Sequenze di


Tk - thymidine ricombinazione
kinase Omologa
Neor – resistenza
alla Neomicina

Elettroporazione
Gene Targeting
Work flow: STEP2

• Selezione delle cellule ES


2

Trattamento con neomicina e


ganciclovir
No integrazione

X
Gene non attivo Sequenze di Integrazione sito-specifica (1/1000)
Tk - thymidine ricombinazione
kinase Omologa
Neor – resistenza Integrazione random
alla Neomicina
X
Gene Targeting
Work flow: STEP3

• Iniezione delle cellule ES trasfettate in una nuova blastocisti


3

ES inserite in una
blastocisti di topo agouti
Gene Targeting
Work flow: STEP4

• Screening della progenie


4

Topo “chimera”
Gene
Targeting
Gene Targeting
Applicazioni

Mutagenesi MIRATA può avere come risultato:

• KNOCK-OUT: INATTIVAZIONE dell’espressione di un gene

• KNOCK-IN: INSERZIONE di un gene difettivo/selvatico (modelli di


patologie con mutazioni puntiformi; geni reporter)
Gene Targeting
Nobel Prize 2007

Mario R. Capecchi

Oliver Smithies
Martin J. Evans

PREMIO NOBEL per la MEDICINA 2007


Motivazione: for their work on "principles for introducing specific gene modifications
in mice by the use of embryonic stem cells and gene targeting.”
Gene Targeting
Vantaggi e svantaggi

• RICOMBINAZIONE OMOLOGA
• L’inserzione del transgene è mirata
• Si conosce la localizzazione genica
dell’inserimento del transgene;

• Problemi: espressione tempo e spazio


specifica?
Limite KO costitutivi:
possibile mortalità degli omozigoti
durante lo sviluppo.

KO condizionali:
l’induzione della mutazione
tempo e tessuto specifica
Transgenesi condizionale
Il sistema Cre-loxP

Eliminare un gene in un tessuto, in un organo o in una fase


particolare di sviluppo

• SCOPO: ottenere informazioni più precise sulla funzione del


gene; garantire il normale sviluppo del topo knockout
• CARATTERISTICA: inserzione mirata e specifica
KO condizionali
Il sistema Cre-loxP

Sistema di RICOMBINAZIONE del fago P1

CRE (cyclization recombination), ricombinasi specifica

LoxP (locus of X-over P1), locus di crossover


(2 seq palindrome di 13bp + regione centrale di 8nt)

Cre
KO condizionali
Il sistema Cre-loxP
Il sistema Cre-loxP
Ricombinazione omologa tra sequenze loxP
Il sistema Cre-loxP
Esempio di delezione tessuto specifica

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


Il sistema Cre-loxP
Screening tramite PCR
Il sistema Cre-loxP
Il topo LERKO: esempio di delezione tessuto specifica

Della Torre et al, Cell Metabolism 2011


Il sistema Cre-loxP
Ricombinazione omologa tra sequenze loxP

Controllo dell’espressione genica:

• nello SPAZIO: utilizzo di un PROMOTORE TESSUTO SPECIFICO

• nel TEMPO: utilizzo di un PROMOTORE


 dipendente dallo STADIO di SVILUPPO
 INDUCIBILE
Il sistema Cre-loxP
Espressione genica programmabile

DELEZIONE INSERZIONE
KO programmabile K-IN programmabile
Il sistema CreER-loxP
Delezione spazio/tempo specifica

TEMPO

SPAZIO

CreER(T): proteine di fusione tra Cre e ER (recettore degli estrogeni)


“The perfect conditional transgenic mouse
should include the following criteria:

1. induced overexpression of the transgene should be


tightly controlled such that no leaky background
expression precludes the accurate analysis.
2. the inducing compound should be nontoxic and highly
specific for the target gene.
3. induction kinetics should be fast and expression levels
sufficiently high to produce a rapid and detectable effect.
4. the induced switch should be reversible so that defined
developmental periods or critical stages in disease can be
appropriately monitored.”

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


Transgenesi condizionale
Controllo binario dell’espressione genica

3 principal events:

1) ligand-mediated activation of a transcriptional transactivator

2) DNA binding of the transactivator

3) transactivator-induced transcriptional activation

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


Transgenesi condizionale
Controllo binario dell’espressione genica

CBS: cognate
binding site

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


Transgenesi condizionale
Controllo binario dell’espressione genica

Effector mouse, Responder mouse,


expressing a ligand- which has the capacity
inducible transcriptional to specifically express
transactivator a chosen transgene
upon stimulation by
the transactivator.

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


Il sistema TET-ON/TET-OFF

Sistema a 3 elementi:

• TeT-Repressor: repressore della trascrizione

• Tc/Dox: tetraciclina/doxyciclina

• TRE: tetracycline response element


Il sistema TET-OFF

TetR: tet repressor


VP16: transactivation domain
of herpes simplex virus

tTA
Tetraycline controlled
transactivator
.

Il sistema TET-OFF

tTA: tetraycline
controlled
transactivator

Tet-off system (tTA) will


activate expression in the
absence of its ligand
doxycycline.

Upon addition of DOX,


transcription of the gene
of interest is extinguished.

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


Il sistema TET-OFF

MHC-tTA/tetO-Ro1 mice
were obtained by crossing a
transgenic mouse line that
expresses Ro1 receptor under
the control of a tetO gene and
another mouse line
expressing tTA gene under the
regulation of a heart-specific
MHC promoter.
Il sistema TET-OFF

VANTAGGI
• Ben note proprietà della Tc/DOX: farmacocinetica, buona
distribuzione tissutale, bassa tossicità, capacità di attraversare
membrane cellulari
• Grande induzione in alcuni tessuti (anche 5 ordini di
grandezza)
SVANTAGGI
• Attività residua del promoter minimale tetO-CMV
• Tossicità cellulare del transattivatore
• Bassa sensitività alla DOX in alcuni tessuti
• Basse cinetiche di induzione in vivo
Il sistema TET-ON

rTetR: reverse tet repressor


VP16: transactivation domain
of herpes simplex virus

rtTA
Reverse tet-on
Tetraycline controlled
transactivator
.

Il sistema TET-ON

rtTA: reverse tet-on


tetraycline
controlled
transactivator

Addition of DOX to the


Tet-on system (rtTA) results
in transcriptional induction
of the gene of interest.

Bockamp E et al., Physiol. Genomics 2002


.

Il sistema TET-ON vs TET-OFF

VANTAGGI
• Aumentata velocità di espressione del transgene: completa
attivazione in 1 ora, rispetto alle basse cinetiche di
attivazione del sistema tet-OFF (fino ad una settimana)
Il sistema TET-ON/TET-OFF
Il sistema TET-ON/TET-OFF

La Tc SPEGNE il GENE La Tc ACCENDE il GENE


Il sistema TET-ON/TET-OFF

http://www.zmg.uni-mainz.de/tetmouse/
Clonazione

Trasferimento del nucleo di una cellula somatica


in un oocita anucleato

• SCOPO: ottenimento di “gemelli” di un fenotipo di


interesse
• CARATTERISTICA: il materiale genetico viene
copiato in toto
Clonazione

I Cloni vengono ottenuti attraverso


Somatic Cell Nuclear Transfer
Clonazione
Clonazione
Clonazione
Possibili applicazioni: Trapianto con
cellule autologhe
Clonazione
Possibili applicazioni: trapianto con
cellule autologhe

SCNT
Cellule staminali ADULTE
Clonazione
Efficienza molto bassa & etica
Altre tecniche

Vettori retrovirali

Yac-transgenic mice
Vettori retrovirali

Integrazione di materiale genetico nella cellula ospite

• SCOPO: Guadagno di funzione


• CARATTERISTICA: - inserzione random, casuale
- vettore max 8Kb
- l’animale puo’ risultare
contaminato da retrovirus delle
cellule helper
Vettore virale Vantaggi Svantaggi

Retrovirus Capacità d'inserimento del gene, Difficoltà nel controllare l'infezione


integrazione stabile nel DNA dell'ospite, virale, mancata infezione delle cellule
elevati titoli di virus ricombinante, ampio non in divisione, integrazione a caso nel
tropismo d'infettività, relativa facilità di genoma dell'ospite
manipolazione del genoma virale

Lentivirus Infezione delle cellule in divisione o meno, Mutagenesi potenziale presenza di


espressione stabile del gene, elevata capacità sequenze proteiche regolatrici e
d'inserimento accessorie

Adenovirus Elevati titoli di virus, alta espressione genica, Risposte immuni alle proteine virali,
grande capacità d'inserimento, infezione di nessuna integrazione nel genoma
cellule in divisione e non in divisione dell'ospite, espressione genica transitoria

Virus adeno-associati Infettano le cellule in divisione o meno, ampio Limitate capacità per i transgeni, difficile
tropismo cellulare, potenziale d'integrazione, generazione di alti titoli virali, presenza di
bassa immunogenicità e non patogenicità adenoviruds o herpevirus per la
moltiplicazione dei virus adeno-associati

Herpesvirus Infettano un'ampia varietà di tipi cellulari, alta Possibile tossicità, rischio di
capacità d'inserzione, tropismo naturale per ricombinazione, nessuna integrazione
le cellule neuronali, seguita dalla produzione virale nel DNA dell'ospite
di alti titoli virali

Poxvirus Alta capacità d'inserzione, possibile inserzione Possibile effetto citopatico


di grandi framenti di DNA, alti livelli di di
espressione transgenica,, seguita da virus vivo
ricombinante
Virus di Epstein-Barr Infetta cellule in divisione o meno con Difficoltà di controllare le linee cellulari
prevalenza per i linfociti B, alta capacità
d'inserimento
Vettori retrovirali
Vettori retrovirali
Vantaggi e Svantaggi

• Alta efficienza di trasduzione

• Possibilità di generare nuovi virus patogeni per


ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite
• Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in
maniera casuale nel genoma)
• Molecole di DNA di dimensioni limitate (max 8 kb)
• Reazioni immunitarie
• Costi elevati
Yac-transgenic mice

YAC (Yeast Artificial Chromosome)


• SCOPO: trasferire GENI di grandi dimensioni 300-
1000Kb.
• CARATTERISTICA: cromosoma artificiale che
contiene sequenze (telomeri, centromeri, origini di
replicazione) necessarie per la replicazione e la
preservazione nelle cellule del lievito.
Yac-transgenic mice

COME SI TRASFERISCE uno YAC nel TOPO?

• Fusione di SFEROPLASTI (cellule Lievito senza parete) + cellule


ES (rischio di contaminazione con genoma Lievito)
• Purificazione di YAC (separato per elettroforesi) + microiniezione
nel pronucleo (se YAC non ha dimensioni grandi, altrimenti si
frammenta)
• Trasferimento di YAC nelle ES tramite LIPOSOMI
(vescicole lipidiche artificiali per fusione con membrana)
Yac-transgenic mice
Yac-transgenic mice
Esempi di applicazione

• YAC di 670Kb contenente il gene umano HPRT in cellule ES


di topo (funzione renale)

• YAC di 400Kb contenente il gene umano APP in cellule ES di


topo (codifica il precursore della proteina amiloide
Alzheimer)

• YAC contenente il gene umano catena leggera/pesante IgG


in topo (produzione di anticorpi)