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INTRODUÇÃO

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma técnica rotineira de laboratório usada para
fazer muitas cópias (milhões ou bilhões) de uma região específica do DNA. Essa região do DNA
pode ser qualquer objeto de interesse do pesquisador. Por exemplo, pode haver um gene cuja função
o pesquisador queira compreender ou um marcador genético usado pelos cientistas forenses para
correlacionar o DNA da cena do crime com os suspeitos.
Tipicamente, o objetivo da PCR é fabricar quantidade suficiente da região de interesse do
DNA, de modo que essa possa ser analisada e utilizada de alguma outra maneira. Por exemplo, DNA
amplificado por PCR pode ser enviado para sequenciamento, visualizado por eletroforese em gel, ou
clonado em plasmídeo para futuros experimentos.
A PCR é usada em muitas áreas da biologia e medicina, incluindo pesquisa em biologia
molecular, diagnósticos médicos e mesmo alguns ramos da ecologia.
Assim como a replicação de DNA em um organismo, a PCR requer uma enzima DNA
polimerase que faça novas fitas de DNA usando as existentes como moldes. A DNA polimerase
tipicamente usada na PCR é chamada de Taq polimerase, em homenagem à bactéria resistente ao
calor da qual ela foi isolada (Thermus aquaticus).
T. aquaticus vive em fontes termais e de água quente. Sua DNA polimerase é bastante estável
ao calor e é mais ativa à 70°C (temperatura em que as DNA polimerases humanas ou de E. coli seriam
disfuncionais). Essa estabilidade ao calor torna a Taq polimerase ideal para PCRs. Como veremos, a
alta temperatura é usada repetidamente na PCR para desnaturar o DNA molde, isto é, separar suas
fitas.
Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase consegue fabricar DNA somente quando
lhe é dado um primer, uma sequência curta de nucleotídeos que fornece um ponto de partida para a
síntese de DNA. Em uma reação de PCR, o pesquisador determina a região do DNA que será copiada,
ou amplificada, pelos primers que ela ou ele escolher.
Os primers de PCR são pedaços curtos de DNA de fita simples, geralmente por volta de
202020 aminoácidos de comprimento. Dois primers são usados para cada reação de PCR, e eles são
projetados de modo que englobem a região de interesse (região que deve ser copiada). Isto é, são
dadas sequências que os farão se ligar a fitas opostas do DNA molde, bem nas extremidades da região
a ser copiada. Os primers se ligam ao molde por pareamento de bases complementares.
Ambos os primers, quando ligados, apontam "para dentro" – isso é, na direção 5' para 3' rumo
à região a ser copiada. Como outras DNA polimerases, a Taq polimerase só consegue sintetizar DNA
na direção 5' para 3'. Quando os primers são estendidos, a região que está entre eles será, assim,
copiada.

OBJETIVO

Aprender a amplificar o DNA pelo método da reação em cadeia da polimerase (PCR).

MATÉRIAIS E REAGENTES

 Água destilada;
 Tampão 10x;
 MgCl2 (50mM);
 dNTP’s (2,5 Mm/uL);
 Primers R (5 pmols/uL);
 Primers F (5 pmols/uL);
 Taq DNA 5u/uL;
 Pipeta e suas respectivas ponteiras;
 Tubos pequenos com os reagentes;
 Grade para os tubos pequenos.
MÉTODO

Os principais ingredientes de uma reação PCR são a Taq polimerase, primers, DNA molde e
nucleotídeos (blocos que compõem o DNA). Os ingredientes são reunidos em um tubo, juntamente
com cofatores de que a enzima precisa, e passam por repetidos ciclos de aquecimento e resfriamento
que permitem que o DNA seja sintetizado.
As etapas básicas são:

 Desnaturação (96°C): Aquece fortemente a reação para separar, ou desnaturar, as fitas


de DNA. Isso proporciona um molde de fita simples para a próxima etapa.
 Anelamento (555555 - 656565°C): Resfria a reação para que os primers possam se
ligar às suas sequências complementares no DNA molde de fita simples.
 Extensão (72°C): Eleva a temperatura da reação para que a Taq polimerase estenda os
primers, sintetizando novas fitas de DNA.

Este ciclo se repete 252525 - 353535 vezes em uma reação típica de PCR, que geralmente
ocorre em 222 - 444 horas, dependendo do comprimento da região de DNA a ser copiada. Se a reação
for eficiente (funcionar bem), a região de interesse pode gerar de uma ou poucas cópias até bilhões.
Isso porque não é apenas o DNA original que é utilizado como molde a cada vez. Ao invés, o
novo DNA feito em uma rodada pode servir de molde na próxima rodada de síntese de DNA. Há
muitas cópias dos primers e muitas moléculas de Taq polimerase flutuando pela reação, então o
número de moléculas de DNA pode aproximadamente dobrar a cada rodada do ciclo. Esse padrão de
crescimento exponencial é mostrado na imagem abaixo.

PROCEDIMENTO

Primeiramente a turma fez o cálculo para encontrar os volumes de cada ingrediente para fazer
a primeira, a segunda e a terceira reação de PCR através da seguinte fórmula:
C1 x V1 = C2 x V2.
Depois montou-se uma tabela e pipetou-se os ingredientes nos tubos seguindo a ordem da
tabela.
Em seguida, os tubos foram levados para realizarem os ciclos: 95° por 3 minutos, depois 95°
por mais 1 minuto, seguido por 58° por 1 minuto e finalizando com 72° por 1 minuto.
Os resultados foram verificados em gel de eletroforese no dia seguinte a aula prática.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados de uma reação PCR são geralmente visualizados (tornam-se visíveis) através do
uso da eletroforese em gel. Eletroforese em gel é uma técnica na qual fragmentos de DNA são
puxados por uma corrente elétrica através de uma matriz de gel, e que separa os fragmentos de DNA
de acordo com o tamanho. Um padrão, ou escada de DNA, é tipicamente incluído para que o tamanho
dos fragmentos nas amostras da PCR possa ser determinado.
Fragmentos de DNA de mesmo comprimento formam uma "banda" no gel, que pode ser vista
a olho nu se o gel for pigmentado com um corante que se liga ao DNA. Por exemplo, uma reação de
PCR produzindo um fragmento de 400400400 pares de bases (pb) apareceria desta maneira no gel:

Uma banda de DNA contém muitas e muitas cópias da região de interesse do DNA, não apenas
uma ou algumas cópias. Como o DNA é microscópico, muitas cópias têm de estar presentes antes
que possamos vê-las a olho nu. Isso é uma grande parte do porquê de a PCR ser uma ferramenta
importante: ela produz cópias suficientes de uma sequência de DNA de modo que possamos ver ou
manipular aquela região de DNA.
A tabela das reações calculadas para as concentrações utilizadas dos componentes da PCR é
mostrada abaixo:

Componentes da PCR Mix 1° Reação 2° Reação


Água destilada 12,95 uL 51,8 uL
Tampão 10x 1x 2,5 uL 10 uL
MgCl2 (50mM) 2,5 Mm 1,25 uL 5 uL
dNTP’s (2,5 Mm/uL) 2,5 Mm 1 uL 4 uL
Primers R (5 pmols/uL) 0,2 pmols/uL 1 uL 4 uL
Primers F (5 pmols/uL) 0,2 pmols/uL 1 uL 4 uL
Taq DNA 5u/uL; 1,5 u 0,3 uL 1,2 uL

Os resultados vistos no gel de eletroforese foram salvos em um pen drive, porém o arquivo
foi corrompido e não foi possível anexar os resultados do gel no relatório. Entretanto, verificou-se
que que somente a primeira reação da turma 1 correu o gel de agarose, as demais reações não correram
no gel de agarose. Provavelmente, os resultados insatisfatórios foram ocasionados por falta de
experiência dos estudantes.