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F. GELLI, A. M. CICERO1, P. MELOTTI2, A. RONCARATI2, L. PREGNOLATO, F. SAVORELLI1, D.

PALAZZI, G. CASAZZA3

Agenzia Regionale per la Prevenzione e lAmbiente dellEmilia Romagna - sez. di Ferrara,


Corso Giovecca, 169 44100 Ferrara, Italia
1 - I.C.R.A.M. ROMA
2 - C.U.R.D.A.M.- Universit di Camerino
3 - A.P.A.T. ROMA

RIPRODUZIONE CONTROLLATA DEL LATTERINO (ATHERINA BOYERI RISSO,


1810) MEDIANTE CONDIZIONAMENTO ECOFISIOLOGICO

CONTROLLED REPRODUCTION OF SAND SMELT (ATHERINA BOYERI RISSO,


1810) BY MEANS OF ECOPHYSIOLOGICAL INDUCTION

Running head: Riproduzione controllata del latterino (Atherina boyeri)

Abstract

An experimental protocol for the induction of reproduction in the sand smelt (Atherina boyeri Risso, 1810;
Teleostei: Atherinidae) under controlled conditions was carried out in order to obtain larvae and juveniles of this
species throughout the year. The influence of water temperature and photoperiod on reproduction was
investigated. Results showed that the long photoperiod (16 h L: 8 h D) plays the most important role on female
gonadic maturation compared to temperature parameter. The embryogenesis and larval morphology were also
studied.

Key-words: Atherina boyeri, reproduction, spawning, test organisms

Introduzione
Il latterino (Atherina boyeri Risso, 1810) un piccolo pesce autoctono appartenente
allordine degli Ateriniformi (Tortonese, 1985) ed alla famiglia degli Atherinidae. Questa
specie ha un elevato grado di variabilit e, per questo motivo, ha ricevuto una serie di nomi
che oggi si ritengono sinonimi di boyeri. Recenti studi di tipo elettroforetico hanno
confermato, anche a livello di genere, la presenza di sole tre specie di Atherina diffuse nel
bacino del Mediterraneo: A. boyeri, A. presbiter e A. hepsetus (Creech, 1991).
La specie caratterizzata da corpo slanciato, leggermente compresso in senso laterale,
ricoperto di squame cicloidi; la livrea presenta colore grigio-verde, con strisce argentee e
punteggiatura al di sotto delle strie laterali; il capo ottuso presenta bocca supera, con
mandibola prominente. La prima pinna dorsale ha inizio sotto la parte terminale delle
pettorali; la distanza tra le due dorsali risulta pressoch uguale al diametro oculare che, a
sua volta, uguale o maggiore della regione preorbitale. La specie molto comune lungo
tutti i litorali italiani, nelle acque estuariali e nelle lagune salmastre dellalto Adriatico;
tuttavia, si osservano alcune popolazioni che si sono adattate allambiente dulciacquicolo
come quelle presenti nelle acque del Lago Trasimeno (Mantilacci et al., 1990) e dei laghi
vulcanici dellItalia centrale (Gandolfi et al., 1991).
Negli adulti non si evidenzia dimorfismo sessuale; i maschi raggiungono la maturit
sessuale a 1-2 anni di vita mentre le femmine al raggiungimento di una lunghezza di 34
40 mm (Creech, 1992). Lepoca di riproduzione inizia nel periodo primaverile-estivo, sia in
acque dolci che salmastre e marine, e si prolunga sino allautunno. Per quanto riguarda la
frequenza di deposizione, per ogni anno si registrato un unico chiaro picco stagionale. Le

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uova deposte risultano ricoperte di filamenti attraverso i quali aderiscono al substrato. La
durata della vita del latterino di 2-3 anni.
Il presente lavoro si posto lobiettivo di elaborare un protocollo per linduzione della
deposizione controllata di A. boyeri allo scopo di rendere disponibili gli stadi larvali ed i
giovanili di questa specie in periodi dellanno diversi da quelli corrispondenti alla
riproduzione naturale, e destinarli ad un utilizzo nei test ecotossicologici. Linteresse degli
autori nei confronti di questo pesce legato al fatto che A. boyeri potrebbe essere un valido
candidato per lo svolgimento di saggi di tossicit in ambiente marino; gli organismi
nazionali ufficialmente preposti (A.P.A.T., I.C.R.A.M.) propongono, infatti, di monitorare
nuove specie da impiegarsi come organismi test nei programmi di tutela ambientale delle
zone lagunari e costiere (D. L.vo 11 maggio 1999, n. 152).

Materiali e metodi
Per le prove sono stati impiegati 300 riproduttori di latterino, equamente ripartiti in sei
acquari, della capacit unitaria di 120 l, mantenendo la temperatura e la salinit delle acque
su valori costanti di 15 1 C e 22 1 ppt rispettivamente e condizioni di fotoperiodo
breve pari a 10 ore di luce (L) e 14 ore di buio (B). Dopo un periodo di ambientamento (10
giorni), durante il quale si provveduto alla somministrazioni di alimenti naturali freschi
(naupli e metanaupli di Artemia salina) ed al graduale svezzamento con mangime (prot.
54%, lip. 18 % s.s.), si proceduto allanalisi delle gonadi femminili rilevandone lo stato di
maturit ed il diametro degli ovociti.
I sei acquari, suddivisi a due a due, sono stati assegnati a tre tesi (A, B, C) in cui i
pesci sono stati sottoposti ad un differente programma di condizionamento ecofisiologico
basato sulla variazione temporale della durata di luce e della temperatura delle acque. La
tesi A ha previsto il mantenimento del fotoperiodo iniziale (10 h L: 14 h B) ed il graduale
innalzamento della temperatura da 15 a 20 C nellarco di due settimane. Nella tesi B si
proceduto allincremento della durata del giorno che, nellarco di 2 settimane, arrivata a
16 ore di luce mentre la temperatura non ha subito modificazioni (15 1 C). Nella tesi C
ha avuto luogo un graduale e contemporaneo innalzamento delle due variabili che, nel
corso di due settimane, sono state portate rispettivamente a 20 C e 16 h L: 8 h B.
Durante il giorno, i pesci erano esposti ad una intensit luminosa di 1000 lux sul pelo
dacqua. La salinit stata mantenuta a 22 1 in tutte le tesi. Nel corso della prova, i
pesci hanno proseguito il programma alimentare adottato nella fase di ambientamento alla
razione giornaliera del 2% p.v..
Dopo 15 e 21 giorni dallavvio del condizionamento sono state eseguite opportune
verifiche sullo stadio di sviluppo follicolare mediante biopsia ovarica. I soggetti maturi
provenienti da ciascuna tesi sono stati sottoposti a spremitura e le uova deposte sono state
fecondate in un cristallizzatore contenente acqua salata. Le uova sono state trasferite in
appositi apparati di incubazione avendo cura di mantenere distinti i lotti provenienti dalle
diverse tesi. Tali apparati erano costituiti da vasche tronco-coniche, della capacit unitaria
di 15 l, in cui era immersa una rete di nylon (50 m) che fungeva da supporto per le uova
stesse. Durante questa fase, stato eseguito un controllo quotidiano delle uova asportando
quelle infeconde. Su ogni gruppo di uova sono stati rilevati la percentuale di fecondazione,
il diametro, la durata dellincubazione, il tasso di schiusa e la lunghezza delle larve. Sul
lotto di uova che ha evidenziato i migliori risultati in termini di qualit (tasso di
fertilizzazione e schiusa) sono state condotte osservazioni sui vari stadi di sviluppo
embrionale al microscopio binoculare a cui stata collegata una camera digitale Olympus
mediante la quale stato possibile effettuare unampia sequenza fotografica.

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Risultati
Dalle prove condotte emerso che il fotoperiodo lungo esercita un ruolo determinante
nella maturazione delle gonadi indipendentemente dalla temperatura; infatti, sia le femmine
che i maschi delle tesi B e C hanno risposto positivamente al programma di
condizionamento (Tab. 1). Queste due tesi hanno fornito i migliori risultati anche in termini
di fecondit che, tuttavia, risultata significativamente inferiore a quella rilevata su
femmine della laguna di Bardawil (costa meridionale del Sinai) che, allinizio della
stagione di deposizione, hanno evidenziato un numero medio di 522 uova/femmina (Gon e
Ben-Tuvia, 1983).
Sulla durata dellincubazione e sul tasso di schiusa ha inciso maggiormente la
temperatura incrementata a 20 C nelle tesi A e C, a conferma di dati da noi ottenuti in test
svolti precedentemente (Melotti et al., 1999).
Sulla tesi C sono state effettuate osservazioni istologiche preliminari sulle gonadi di
latterini di diversa et e sui diversi stadi embrionali osservati in uova fecondate
artificialmente ed incubate alla temperatura di 20 1 C.
Il testicolo risultato costituito da tessuto follicolare mentre lovario era formato da
ununica struttura connettivale assiale centrale a cui erano adese, come in un lungo
grappolo, tutte le uova a diversi stadi di maturazione. Sono stati osservati 6 differenti livelli
di sviluppo di cellule uovo. In ovari immaturi sono stati riconosciuti i primi 4 stadi, mentre
in ovari in pi avanzato grado di maturazione stato possibile riscontrare ovociti in tutte le
fasi di maturazione. In particolare in tutti gli ovari esaminati, anche in quelli in fase di
maturazione avanzata, sono stati osservati diversi oogoni ancora immersi nel tessuto
connettivo centrale. Sulla base delle osservazioni condotte, si pu affermare che, a
deposizione avvenuta, sono queste cellule ad andare incontro a proliferazione allo scopo di
ripristinare la popolazione gametica di partenza. Nel corso della vitellogenesi stata
evidenziata una spessa stratificazione di cellule che circondavano luovo; questa teca
potrebbe essere responsabile della formazione dei lunghi filamenti che avvolgono la
capsula delluovo pronto per la deposizione.
Luovo di latterino, poco prima della fecondazione, presenta forma sferica, colore
giallo paglierino, lievemente opaco per la natura della capsula che molto spessa; il vitello
si presenta omogeneo con numerose gocce oleose incolori disposte a piccoli gruppi; la
capsula guarnita di filamenti lunghi e sottili, ugualmente distribuiti su tutta la superficie,
per mezzo dei quali l'uovo fissato ai corpi sommersi. Dopo 2 ore dalla fecondazione, lo
sviluppo procede rapidamente con la formazione di un blastodisco al polo animale e si
assiste al progressivo raggruppamento delle gocce lipidiche al polo vitellino. Gi dopo 24
ore il blastodisco inizia a differenziarsi in una struttura cilindrica allungata, distesa lungo
una scanalatura, ben distinta del vitello. Lo sviluppo degli occhi e del sacco uditorio si
evidenzia a partire dal 2 giorno parallelamente allo sviluppo dei melanofori nella parte
posteriore dell'embrione. A partire da questo momento si assiste allo sviluppo del sistema
vascolare sopra il sacco vitellino ed alla comparsa di 5-6 piccoli melanofori disposti sul
vitello. Al 5 giorno gli occhi iniziano a pigmentarsi e si notano i melanofori a livello
sopra-orbitale ed occipitale nella loro forma caratteristica. Dopo 8 giorni l'embrione ha
raggiunto dimensioni tali da creare nell'uovo una spirale superiore al singolo giro di
circonferenza; il battito cardiaco ben evidente ed il sacco vitellino appare dimezzato
rispetto al suo diametro originale; i suoi movimenti all'interno dell'uovo si fanno accelerati
e si osservano vigorosi scatti delle pinne pettorali. Si inoltre riscontrato un movimento
indipendente degli occhi. Alla schiusa, la larva ha riassorbito tutto il sacco vitellino e

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presenta l'intestino corto e sferico mentre l'ano posizionato ad un quarto della lunghezza
del corpo.
I rilievi biometrici delle larve a partire da due giorni dopo la schiusa hanno
evidenziato come a 7 giorni di vita (et ottimale per lavvio di test ecotossicologici) il peso
medio sia 160 mg e la lunghezza totale media pari a 8,8 mm. A 12 giorni le larve
raggiungono mediamente i 280 mg di peso e 11,4 mm di lunghezza. Per quanto riguarda la
formazione della vescica natatoria, sono state identificate due fasi di riempimento di
questorgano, assimilabili a quelle osservate sullorata da Chatain (1986). Nella prima fase
(larva di 3 giorni di et), stato possibile riconoscere uno stato primordiale ed uno espanso,
mentre nella seconda fase (larva di 6 giorni di et) comparsa nella vescica una seconda
bolla di gas, pi piccola della prima e situata dietro alla stessa, che rapidamente si fonde
sino ad assumere una forma allungata in senso antero-posteriore (Fig.1, 2).

Conclusioni
Le prove sperimentali effettuate su A. boyeri hanno confermato la sostanziale
possibilit di riprodurre la specie ed allevare larve e giovanili in condizioni controllate.
Fino ad oggi i tentativi di riproduzione effettuati sul latterino riguardavano la deposizione
spontanea in acquario o la fecondazione artificiale di soggetti pescati in natura durante il
periodo riproduttivo ed a maturazione gonadica raggiunta. La sperimentazione condotta ha
portato alla messa a punto di una tecnica idonea a riprodurre la specie in ambiente
controllato attraverso la manipolazione dei soli parametri ambientali (fotoperiodo e
temperatura). E stato, inoltre, possibile studiare lo sviluppo embrionale dell'uovo che ha
trovato molte similitudini con i dati e le osservazioni riportate in letteratura per specie
congeneri (Spart, 1942; Bamber et al., 1985).
I risultati acquisiti appaiono di fondamentale importanza poich da essi dipende la
disponibilit degli stadi larvali necessari per la messa a punto di una metodologia atta
allesecuzione di saggi di ittiotossicit in acque marine e salmastre. Sulla base del lavoro
svolto e delle informazioni acquisite nel biennio precedente (Gelli et al., 2001; Roncarati et
al., 2001) stato possibile evidenziare come il condizionamento ecofisiologico consenta di
sincronizzare lemissione delle uova e quindi lottenimento di stadi larvali e giovanili
durante lintero arco dellanno. Tra i requisiti che gli organismi devono presentare per
essere utilizzati come organismi test vi innanzitutto lampia disponibilit e reperibilit di
soggetti di taglia idonea su tutto larco dellanno. Il latterino, essendo una specie ittica
autoctona particolarmente importante per gli ambienti salmastri, appare pienamente
rispondente a questi criteri.

Summary
The research aimed at optimizing a protocol for the induction of spawning in
controlled conditions in Atherina boyeri Risso, 1810 in order to get availability the larval
stages and juveniles of this species throughout the year and use them in ecotoxicological
tests. For the trial, 300 specimen of sand smelt were introduced in 120 l-6 aquaria
(temperature: 151 C; salinity: 221 ppt; photoperiod: 10 h L/14 h D). After a period of
acclimation (10 days), the maturity stages of females gonads and oocytes diameter were
determined.
The aquaria were divided in 3 batches (A, B, C) in which fish were submitted to a
different echo-physiological conditioning program based on the variation of daily light and
water temperature: group A forecasted the initial photoperiod (10 h L: 14 h D) and a
gradual increase of temperature from 15 to 20 C throughout 2 weeks; group B presented

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an increase of light until 16 h L/ day in 2 weeks at constant temperature (151 C); group C
showed a gradual and contemporary increase of the two parameters until 20 C and 16 h
L:8 h D after 2 weeks. At day 15 and 21 the development of oocytes was verified by means
of gonadic biopsy. The animals who positively answered to the echo-physiological
conditioning program, coming from the different batches, were stripped and eggs lied were
fertilized in marine water. Eggs were incubated in tanks (15 l volume) with a nylon net (50
m) to support the eggs maintaining separated the three groups. In each batch fertilization
rate, eggs diameter, incubation time, hatching rate and larval length were recorded.
The long photoperiod showed an important role in the gonad maturation without
considering temperature; both the females and the males in B and C groups positively
answered to the echo-physiological conditioning program tested. About the incubation time
and hatching rate A and C groups with the temperature increased at 20C, had the best
results. At 7 days post-hatching, larvae showed 160 mg mean body weight and 8.8 mm
mean length. At 12 days they weighed 280 mg and measured 11.4 mm.
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Finanziamento
Ricerca eseguita con fondi dellAgenzia per la Protezione dellAmbiente e per i servizi Tecnici (A.P.A.T.) e
dellIstituto per la Ricerca scientifica e tecnologica Applicata al Mare (I.C.R.A.M.), nell'ambito del Programma di
Ricerca Attivit di studio e sperimentazione sui criteri e sulle metodologie per la verifica delle caratteristiche
trofiche delle acque marine costiere e livelli di contaminanti nei sedimenti.

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Tab. 1 Parametri rilevati nel corso della riproduzione di A. boyeri
Parameters recorded during the A. boyeri reproduction

A B C

Totale femmine trattate (n) 54 52 54


Totale maschi trattati (n) 46 48 46
Femmine con gonadi mature (%) 5 51 50
Maschi con gonadi mature (%) 35 75 74
Fecondit assoluta (n uova/femmina) 85 105 100
Tasso di fertilizzazione (%) 80 78 80
Diametro uova (mm) 1,300,2 1,200,4 1,450,3
Tasso di schiusa (%) 80 32 80
Durata dellincubazione (gg.) 10 18 10
Lunghezza larva alla schiusa (mm) 6,20,9 6,21,5 6,41,1
Avvio alimentazione esogena (gg.) 2 2 2

Fig. 1 Riempimento della vescica natatoria in larva Fig. 2 - Riempimento della vescica natatoria in larva
di latterino di 3 giorni di et: prima fase di latterino di 6 giorni di et: seconda fase
Swim bladder inflation in sand smelt larvae Swim bladder inflation in sand smelt larvae
(3 days old): first phase (6 days old): second phase