Sei sulla pagina 1di 9

GENETICA BATTERICA

*Il genoma batterico è costituito dall’insieme di geni situati sia sul cromosoma che negli eventuali
elementi genetici extracromosomici (plasmidi, batteriofagi).
*Il genoma E. coli: singola molecola di DNA circolare a doppio filamento con circa 5x106 (5kbp)
coppie di basi.
*Aploidi vs diploide.
*Struttura DNA del cromosoma batterico mantenuta da poliamine (spermina e spermidina, che si
complessano con il DNA e consentono la struttura tridimensionale) invece che proteine (istoni).
*Genoma contiene vari operoni (geni deputati a decodificare per certe proteine che lavorano su uno
stesso obiettivo, sono codificate in maniera omogenea) costituiti da geni.
*I geni sono sequenze nucleotidiche aventi una specifica funzione biologica: geni per proteine
strutturali (cistroni), per RNA ribosomiale, siti di riconoscimento e legame per altre molecole
(promotori ed operatori).
*Promotori ed operatori sono sequenze nucleotidiche che controllano l’espressione di un gene
determinando quali sequenze verranno trascritte in mRNA.
*Operoni sono gruppi di uno o più geni strutturali espressi a partire da un determinato promotore
fino ad un terminatore trascrizionale. Controllo coordinato di enzimi via metabolica.
Policistronici. Operatore lac di E.coli geni per metabolizzare lattosio, geni per spegnerli in presenza
di glucosio e attivarlo in presenza di galattosio.
*Genotipo si riferisce allo specifico gruppo di geni presenti in una cellula o virus.
*Fenotipo si riferisce all’insieme delle caratteristiche che sono osservabili da un investigatore. Non
tutti i geni sono espressi allo stesso tempo: influenza ambiente.
*la sequenza nucleotidica dei geni va mantenuta nel tempo affinché la vita sia possibile.
1. Cambi nella sequenza nucleotidica di un gene (stabile ed ereditabile) sono dette mutazioni
>>con o senza variazioni nel fenotipo.
2. Cambi nel corredo genetico di un microrganismo possono avvenire anche grazie a fenomeni di
ricombinazione genica.

Mutazioni del genoma:


™ Transizione : purina > purina, pirimidina > pirimidina.
™ Transversione: purina >pirimidina, pirimidina >purina.
™ Mutazione puntiforme colpisce una singola base
Sostituzione per microinserzione/delezione
Possono provocare fenomeni diversi. Se si ha una sostituzione possiamo avere due
situazioni:>>che passi in maniera silente;
>>che si risenti della sostituzione.
Una mutazione pur avvenendo in una tripletta può non causare modificazione nella codificazione
dell’amminoacido.
Oppure può essere importante e causare delle modificazioni.

™ Mutazioni più basi *delezione > si tira via un blocco di base


*inserzione > aggiungo un pezzo di DNA nel cromosoma

1
*traslocazione > spostamento di pezzi di DNA da varie parti
del cromosoma
*inversione > pezzo di DNA si gira

il batterio ha un unico cromosoma: in certe situazioni il batterio è in grado di prendere


dall’ambiente esterno pezzi di DNA estraneo e poi operare una ricombinazione con il loro
DNA.
Questa è una situazione in cui il batterio si espone a dei rischi poiché il pezzo di DNA non è
detto apporti delle migliorie.

La DNA polimerasi ha una certa frequenza di errore. Possono essere ridotte da sistemi di controllo
per4 cui le basi sbagliate vengono sostituite e rimpiazzate con quelle giuste. Le possibilità che un
nucleotide venga accoppiato a basi sbagliate sono 108 .

Tipi di mutazioni:
A. Spontanee >> errori nella replicazione del DNA, da danni causati da radiazioni gamma o calore;
B. Indotte da agenti chimici: - analoghi basi nucleotidiche (AT>5BU>GC). Il 5-bromo-uracile
viene introdotto dalla DNA polimerasi durante la sintesi.
mutageni frameshift (bromuro di etidio – è un fluorescente che si lega al DNA. Permette di
individuare frammenti di DNA -, derivati dell’acridina) intercalano doppia
elica>>inserzione/delezione
- reagiscono con DNA (agenti alchilanti, acido nitroso) aggiungono gruppi etilici o metilici
negli anelli delle basi di DNA>>basi rimosse/appaiamento anomalo

C. Indotte da agenti fisici:


calore (deaminazione nucleotidi)
luce ultravioletta (dimeri pirimidinici)
radiazioni ionizzanti (raggi X>>rompono anelli delle basi o interrompono filamenti di DNA)
Parte dei loro effetti provoca la morte del batterio.

SCAMBIO GENICO NELLE CELLULE PROCARIOTICHE

Lo scambio di DNA tra cellule (ricombinazione) consente il riarrangiamento di geni con la


formazione di un cromosoma ricombinante e l’acquisizione di nuovi caratteri fenotipici.
Cellule eucariote: meiosi>>bidirezionale (crossing – over), lo scambio avviene tra due cromosomi
omologhi appaiati che si scambiano un pezzo di DNA.
Cellule procariotiche: ricombinazione>>unidirezionale, il donatore è un pezzo di DNA entrato nella
cellula.

Un pezzo di DNA esogeno penetra, con vari meccanismi, nella cellula accettrice e può essere
integrato nel suo genoma.
La probabilità di ricombinazione tra due geni è proporzionale alla loro distanza.
In alcuni casi il DNA che penetra nella cellula accettrice non necessita di essere integrato nel
cromosoma essendo resistente all’azione delle endonucleasi. Questo DNA circolare, in grado di
replicarsi in maniera autonoma e di trasferire le sue informazioni genetiche nella cellula ospite, è il
plasmide.
Le endonucleasi sono enzimi che ciascun batterio possiede. Hanno la caratteristica di tagliare il
DNA riconoscendo delle sequenze specifiche. Degradano il DNA che riconoscono non essere

2
proprio: è un sistema di difesa. Se non ci fosse, qualsiasi fenomeno di ricombinazione non sarebbe
bloccato.
Ogni batterio ha endonucleasi specifiche.

Come avviene il passaggio del DNA dalla cellula donatrice a quella accettrice?
1. Tra due batteri temporaneamente in contatto (coniugazione)
2. Trasferimento di DNA nudo (trasformazione) metodo utilizzato in laboratorio
3. Trasporto di DNA ad opera di batteriofagi (trasduzione)

Se l’omologia tra due batteri non è del 100% allora si ha la formazione di un fenotipo diverso.

Qual è il destino del DNA penetrato nella cellula accettrice?


1. Se esistono sequenze di omologia tra DNA esogeno/endogeno allora è possibile la
ricombinazione.
2. DNA esogeno può persistere al di fuori del cromosoma endogeno e replicarsi generando una
cellula parzialmente diploide.
3. DNA esogeno persiste ma non replica.
4. Nucleasi endogene degradano DNA esogeno.

PLASMIDI

Sono molecole di DNA a forma di elica.


Sono piccoli elementi genetici che si replicano indipendentemente dal cromosoma batterico
(repliconi).
La maggioranza sono molecole di DNA a doppio filamento, circolari (eccezione la Borrelia) e
lunghezza tra 1.5- 400 kb, possiedono una sequenza per l’inizio replicazione (Ori) e relativamente
pochi geni < 30 non vitali per il batterio.
Alcuni plasmidi, F di E. coli, possono integrarsi nel cromosoma ospite (episoma).

si possono inserire (in e out) nel cromosoma. Ovvero vi possono essere delle sequenze di
omologia in cui si possono inserire.

Possono trasferire informazioni genetiche addizionali che creano un vantaggio selettivo al batterio:
conferire antibiotico resistenza, produzione batteriocine o tossine, vie metaboliche alternative.
Il numero di copie è determinato dal plasmide (1 – 50 per cellula).
Possono essere eliminati attraverso il processo di curing, spontaneo o con trattamenti che ne
inibiscono la replicazione (acridina, UV, radiazioni ionizzanti , deficit di timina, crescita
temperatura non ottimale).
I plasmidi possono contenere geni che mediano il passaggio da una cellula all’altra (coniugazione) e
per questo vengono detti plasmidi coniugativi.
Plasmidi di fertilità F
Contengono geni responsabili per l’attacco/trasferimento di plasmidi ad altre cellule, in operone
tra (circa 21 geni).
Contengono sequenze di inserzione per l’integrazione nel cromosoma.
Fattori di resistenza
Contengono geni (1 – 8) per enzimi per distruggere/modificare antibiotici. Possono contenere
anche geni per coniugazione (facilità diffusione) o trasferiti con plasmidi F.
Plasmidi col
Contengono geni per batteriocine, a basso peso molecolare >>proteine per distruggere altri
batteri (pori di membrana, distruzione DNA – RNA).

3
Plasmidi di virulenza (importanti per l’uomo e gli animali)
Contengono geni che rendono il batterio più patogeno (tossine, resistenza meccanismi difesa
ospite) E. coli>diarrea viaggiator (in condizioni tranquille sono apatogene, ma quando
assumono dei plasmidi con la capacità di sintetizzare delle tossine , provocano la sintomatologia
patologica importante.
Capacità dei microbatteri di aderire e di proliferare e di provocare malattia in un ospite.

Ceppi Hfr (high frequency ricombination)


Il plasmide cessa la replicazione autonoma, ma i geni coinvolti nella mobilizzazione/trasferimento
espressi>>coniugazione può iniziare con taglio ad OriT>>essendo il plasmide integrato, solo una
parte del plasmide viene trasferita seguita dal cromosoma batterico e poi dalla parte finale del
plasmide (raro) (100 minuti)>>nell’accoppiamento Hfr ed F- il ricevente rimane F-.
Plasmidi coniugativi R sono stati trovati in gram + (streptococchi, clostridi)>>la coniugazione in
questi batteri non dipende dalla presenza di pili ma dalla presenza di adesina (indotta da ferormoni
sessuali) sulla cellula donatrice.
Plasmidi metabolici
Contengono geni per degradare varie sostanze (composti aromatici pesticidi, zuccheri) o nel
Rizobium coinvolti nella fissazione dell’azoto.
trasposoni
Sono elementi genetici mobili non autonomi per la replicazione.
Possono muoversi da una posizione all’altra all’interno del genoma o tra diverse molecole di DNA.
Possono essere di inserzione/complessi/associati a fagi.

Meccanismi per il trasferimento di materiale genetico:


1. Trasformazione →materiale di DNA nudo viene accettato direttamente dalla cellula ricevente.
2. trasduzione→ il carrier che media il DNA tra le due cellule è un fago.
3. coniugazione→ trasferimento materiale genetico.

4
TRASFORMAZIONE

Processo con il quale i batteri acquisiscono frammenti di DNA nudo e lo incorporano nel proprio
genoma.
Batteri gram + e gram – possono acquistare stabilmente DNA esogeno.
DNA esogeno detto DNA transfettante (il DNA che sta arrivando dall’ambiente esterno e che deve
entrare nella cellula) può essere sotto forma lineare (frammento) o circolare (plasmide).
Cellule in grado di acquisire DNA esogeno dette competenti ( in grado di avere espressi una serie
di fattori che sono necessari per assumere il DNA; esprimono proteine per il legame/processamento
del DNA) naturalmente (Haemofilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Bacillus & Neisseria
species) alla fine fase crescita logaritmica o indotta chimicamente.
Tecniche per aumentare l’efficienza della trasformazione sono:
- chimiche: trattamento con CaCl2 , fattori nutritivi in medium;
- fisiche: shock termico, elettroporazione.

Trasformazione
→ con frammenti di DNA, deriva da cellula morta
→ con cellula plasmidica

MECCANISMO DI TRASFORMAZIONE GRAM +

DNA transfer by elettroporazione


Creazione di piccoli pori nella membrane cellulari esponendo le cellule ad un campo elettrico.
Quindi una molecola di DNA penetra nella cellula.
→ richiede cellule in sospensione
Trasformazione cellule eucariotiche

TRANSFEZIONE

- precipitare DNA con sali di Ca2+


- elettroporazione: le cellule vengono poste in una provetta, la quale è messa dentro un campo
elettrico. Grazie all’applicazione di una corrente elettrica, vengono fatti dei pori nella membrana
cellulare in modo che il DNA possa passare. Molte delle cellule trasformate vengono uccise
perché non tutte sono in grado di richiudere i pori.
- Gene Gun: viene fatta su organismi superiori (animali/uomo). Si tratta di una pistola ad aria
compressa che spara microproiettili di oro colloidale, su cui è stato posto del DNA plasmidico.
Sono sparati nella cute: il DNA transfettante verrà così trasportato all’interno dell’organismo.

5
TRASDUZIONE

È necessario che la cellula che deve ricevere il fago, sia in grado di riceverlo.

™ Si tratta di trasferimento genico che è mediato da virus batterici. Nelle particelle fagiche
vengono incorporati frammenti di DNA che sono trasferiti nelle cellule infettate nel cui genoma
si integrano.
™ Specializzata: se il fago trasferisce geni specifici (adiacenti al sito di integrazione) → fago con
ciclo lisogeno.
™ Generalizzata: per incorporazione accidentale di DNA della cellula ospite nel capside fagico →
fago con ciclo lisogeno o litico.

Più specificatamente:

per quanto riguarda la trasduzione generalizzata: qualsiasi segmento genetico (inerte) può essere
trasferito da una cellula donatrice ad una accettrice. Il fago si aggancia alla cellula batterica, che
deve avere il recettore specifico per quel fago.
Le probabilità che la particella virale contenga uno specifico gene sono 10-4 – 10-8 .
Se il fago entra nella cellula, dà origine al ciclo litico : appena entrato nella cellula, il batterio si
replica, blocca le attività metaboliche della cellula ospite, ne provoca la frammentazione del DNA.
Il batterio si presenta come un involucro vuoto, al cui interno vi possiamo trovare frammenti
derivanti dalla rottura del cromosoma batterico e le copie di genoma virale.

All’interno della particella fagica entra DNA virale.


Si forma così una particella trasducente in grado di legarsi al batterio.
Non avviene però un altro ciclo litico.
- degradato
- ricombinato

per quanto riguarda la trasduzione specializzata: il DNA di un fago temperato viene rimosso in
maniera incorretta portando con sé geni adiacenti della cellula ospite.

La differenza tra le due trasduzioni sta nel ciclo replicativo del virus. Il fago entra nella cellula:
- ciclo litico
- ciclo lisogeno: il fago ha sequenza di omologia con il cromosoma della cellula accettrice; si
integra in essa e rimane in uno stato dormiente nel batterio. Si tratta di una situazione che
favorisce il fago. Venendo replicato con il cromosoma della cellula ospite, si ha un numero
maggiore di cellule che conterranno informazioni che derivano dal fago.
Il passaggio dalla fase lisogena a quella litica è indicato dalla scissione del DNA.

6
In alcuni casi il distacco non avviene in maniera perfetta perché le endonucleasi che lo devono
rompere lo tagliano in maniera variabile.

CONIUGAZIONE

È un processo che richiede il contatto diretto tra le due cellule: cellula donatrice e cellula accettrice.

Molto spesso non si realizza poiché è un processo che richiede molto tempo. Se il ponte si spezza e
non c’è il completo passaggio del plasmide la coniugazione non si potrà ritenere sia avvenuta e la
cellula ♀ non si potrà chiamare F+.
Per cui la si dovrà considerare ancora F-.
È un processo per cui il DNA viene trasferito tramite contatto diretto tra due cellule batteriche
durante l’accoppiamento.
Si ha il trasferimento a senso unico di DNA da una cellula donatrice (♂) ad una ricevente (♀) per
mezzo di un pilo sessuale.
Si verifica generalmente in E. coli , ma anche in generi Bacteroidos, Streptococcus, Clostridium.
Il plasmide F indipendente con un frammento di cromosoma è detto F’.
Il plasmide F può integrarsi nel cromosoma (episoma): avviene il taglio e poi la ricombinazione del
cromosoma batterico; con la presenza di sequenze omologhe di inserzione.
Causano il trasferimento di larghe frequenze.

Hfr - hight frequency recombination- avviene nel momento in cui il plasmide è in grado di
esprimere i propri geni. Le cellule non solo trasferiscono il plasmide F, ma anche tutto il
cromosoma batterico da una cellula ad un’altra. La quantità di geni trasferita dalla cellula donatrice
a quella accettrice è enorme.

7
Il plasmide F ~ 100 kb
Fenomeno del Rolling circle: DNA plasmidico subisce un taglio.
Una singola catena passa attraverso la cellula F- .
F+ il DNA è risentitizzato.
La singola catena nella F- funge da stampo.

8
9