UNIVERSIT DEGLI STUDI DI VERONA

SCUOLA DI MEDICINA E CHIRURGIA

Corso di Laurea Magistrale a ciclo unico in Odontoiatria e
Protesi Dentaria Dipartimento di Scienze Chirurgiche
Odontostomatologiche e Materno-Infantili Sezione di
Odontoiatria e Chirurgia Maxillo FaccialeDirettore: Ch.mo
Prof. Pier Francesco Nocini

TESI DI LAUREA

Relatore:

Ch.mo Prof. ANTONIO DAGOSTINO

Correlatore:

Dott. ELISA MAZZONE

Laureanda:
ZUPPINI GIULIA
Matricola VR365708

ANNO ACCADEMICO 2016/2017

Indice

1. Introduzione
2. Background:
a. Il tessuto osseo: caratteristiche
b. La rigenerazione dellosso
c. Biomateriali e ingegneria tissutale
d. Estetica facciale e protesi zigomatiche
e. Applicazione clinica di Granular ProOsteon 200 e Avitene
Microfibrillar Collagen Hemostat

3. Obiettivo

4. Materiali e metodi
a. Descrizione del biomateriale
b. Human adipose derived stem cells (hASCs): isolamento,
caratterizzazione e colture
c. Isolamento RNA e analisi PCR della matrice extracellulare e dei
geni delle molecole di adesione
d. Retrotrascrizione
e. Real Time PCR
f. Markers osteogenici
g. Analisi al microscopio elettronico (SEM) fino a 40 giorni
h. Analisi della sopravvivenza cellulare e della morfologia del
citoscheletro

5. Risultati:
a. Morfologia cellulare hASC
b. Citometria e flusso e analisi al SEM delle cellule staminali e del
biomateriale
c. Espressione genica della matrice extracellulare umana e delle
molecole di adesione
d. Sopravvivenza cellulare, proliferazione e architettura del
citoscheletro

6. Discussione

7. Conclusione

8. Bibliografia
Introduzione
Negli ultimi anni sono state portate avanti numerose ricerche finalizzate ad
analizzare nuovi biomateriali utilizzati come innesti ossei. Sono stati ottenuti
risultati significativi nello sviluppo di innesti a base di materiali ceramici, polimeri
e metalli applicati in ambito maxillo-facciale, odontoiatrico e ortopedico. I
miglioramenti pi importanti sono stati ottenuti per quanto concerne la
biocompatibilit, le capacit meccaniche, le propriet osteoconduttive e
osteoinduttive e i tempi di guarigione (Marques C, 2014) (Venkatesan J, 2014).
Nonostante i numerosi sforzi effettuati nel campo dei sostituti ossei, da quanto
emerge dalla letteratura, si conosce poco riguardo gli effetti biologici che si
ottengono quando gli innesti ossei vengono a contatto con losso. Dovrebbero
essere portati a termine una vasta gamma di sperimentazioni riguardo gli effetti dei
sostituti ossei e i relativi studi clinici prima che il materiale venga utilizzato in vivo.
Studi preclinici su modelli in vivo e in vitro hanno fornito informazioni importanti
sullosteoconduttivit dei sostituti ossei allinterno dei loro macro e micro ambienti
(Srouji S, 2013). Tuttavia questi studi non hanno sempre confermato le propriet di
osteoconduzione e osteoinduzione dei materiali testati. Gli innesti impiegati per la
rigenerazione ossea possono essere saggiati per specifiche propriet come
losteoconduzione, losteoinduzione e lespressione di singoli geni nelle cellule
umane.
In letteratura cellule staminali mesenchimali di origine umana (hMSC), ottenute da
aspirato di midollo osseo, vengono utilizzate come modello per analizzare il loro
comportamento durante la crescita a contatto con diversi biomateriali (Barbanti
Brodano G, 2012). Materiali derivati dallidrossiapatite (HA) sono attualmente
utilizzati in applicazioni cliniche in forme diverse. Lidrossiapatite adatta per
sostituire o integrare insufficienti volumi ossei dal momento che va a simulare la
componente mineralizzata di osso (Mendelson BC, 2010) (Moreira-Gonzalez A,
2003). In particolare biomateriali a base di idrossiapatite porosa/collagene
(HA/Coll) sono ideali per innesti di osso trabecolare e, allo stesso modo, anche per
la ricostruzione di osso compatto.
Recentemente stato riportato lutilizzo di un materiale a base di idrossiapatite
porosa di origine cristallina, Pro Osteon 200, insieme a collagene microfibrillare
Avitene come un biomateriale innovativo usato per migliorare i profili facciali e
come protesi zigomatica nellambito della chirurgia ortognatica (D'Agostino A,
2016). Dalla letteratura, infatti, emerge come dei profili facciali armonici e delle
proporzioni naturali del viso abbiano un notevole impatto psicologico
sullautostima dei pazienti.
Gli effetti biologici che si originano dal contatto tra HA e collagene microfibrillare,
dando origine ad un innesto ibrido, sono poco conosciuti. Pro Osteon 200, a
base di idrossiapatite porosa cristallina, ha dimostrato unelevata biocompatibilit
nei modelli cellulari (Gupta G, 2007) (Barron M, 2007), animali (Zhukauskas R,
2010) (Jensen TB, 2002) (Leupold JA, 2006), e nelle applicazioni cliniche
(D'Agostino A, 2016) .
Con tale lavoro si vuole, quindi, determinare la biocompatibilit, le capacit
osteoconduttive, osteoinduttive e osteogenetiche di un nuovo materiale da innesto,
Coll/Pro Osteon 200 valutato in vitro con cellule staminali adipose di origine
umana (hASC) e in vivo su pazienti sottoposti a interventi chirurgici maxillo-
facciali. In particolare le cellule sono cresciute a contatto con il biomateriale e
valutate in termini di vitalit, morfologia e architettura citoscheletrica; poi le
propriet osteoconduttive, osteoinduttive e osteogenetiche vengono analizzate
valutando lespressione genica delle molecole di adesione, della matrice
extracellulare e di specifici marcatori osteogenici. Inoltre 400 pazienti, che sono
stati sottoposti a chirurgia ortognatica e posizionamento di protesi zigomatiche,
sono stati clinicamente valutati riguardo la formazione di nuovo osso.
Background
Il tessuto osseo: caratteristiche

Losso un tessuto connettivo specializzato con funzione di protezione e di

sostegno formato da matrice extracellulare mineralizzata e cellule.
La matrice extracellulare costituita da cristalli di idrossiapatite (HA) e in quantit
minore di carbonato di calcio e altri minerali. Oltre alla componente inorganica la
matrice extracellulare composta da una parte organica costituita da fibre di cui
l80-90% sono a base di collagene, mentre la restante parte costituita da proteine
non collageniche come osteonectina, osteopontina, sialoproteina ossea, fosfatasi
alcalina e osteocalcina.
Queste proteine sono fondamentali per il mantenimento strutturale e funzionale
dellosso stesso. Losteonectina una proteina glicosilata che si pensa abbia un
ruolo fondamentale nel determinare linizio della mineralizzazione ossea.
Losteopontina una sialoproteina che influenza ladesione delle cellule alla
matrice ossea e controlla il riassorbimento osseo (Sodek, 2000). La sialoproteina
ossea (BSP) una proteina probabilmente coinvolta nella formazione dei cristalli
di idrossiapatite della matrice. La fosfatasi alcalina la proteina glicosilata pi
abbondante nella matrice ossea, partecipa anchessa alla mineralizzazione della
matrice, anche se il suo ruolo preciso non ancora stato ben identificato.
Losteocalcina tra le proteine non collageniche pi abbondanti, una proteina -
carbossilata con importante funzione nel modulare la morfologia dei cristalli di
idrossiapatite (Hoang, 2003).
La componente cellulare rappresentata dalle cellule osteoprogenitrici che
derivano dal mesenchima e mantengono la capacit di differenziarsi in osteoblasti
e, in caso di necessit, in cellule condrogeniche. Sono presenti, inoltre, gli
osteoblasti che derivano dalla linea osteoprogenitrice e sono responsabili della
sintesi della componente organica della matrice ossea compreso il collagene, i
proteoglicani e le glicoproteine. Si trovano, poi, gli osteociti che rappresentano le
cellule mature dellosso, derivanti dagli osteoblasti, che rimangono intrappolate
nelle lacune ossee e infine vi sono gli osteoclasti che derivano da progenitori dei
granulociti-macrofagi e agiscono nel riassorbimento osseo (Leslie P. Gartner,
2009).
Le ossa dello scheletro adulto sono costituite da osso spongioso e osso compatto,
presenti in quantit variabili a seconda della regione anatomica. Losso spongioso,
o trabecolare, rappresenta circa il 20%, costituito da trabecole che si
anastomizzano tra loro, caratterizzato da una morfologia a spugna, da spazi
midollari e da una porosit molto accentuata (50-90%); losso compatto rappresenta
l80%, molto pi denso e presenta una porosit molto ridotta (10%).
Un involucro di tessuto connettivo denominato endostio riveste le cavit midollari,
mentre la superficie esterna dellosso ricoperta da periostio. Sia lendostio che il
periostio contengono elementi cellulari con potenziale osteogenetico. Gli
osteoblasti dopo aver prodotto la matrice ossea, una volta che questa si
mineralizzata, restano intrappolati in piccoli spazi detti lacune e si trasformano
in osteociti. Questi rimangono in comunicazione tra loro tramite lunghi
prolungamenti citoplasmatici che percorrono estesi canalicoli che confluiscono in
pi ampi canali molto vascolarizzati, denominati canali di Havers. Ogni canale di
Havers, insieme a tutti i canalicoli che vi confluiscono e allinsieme di lamelle ossee
che lo circondano, forma un osteone o sistema di Havers. Questa organizzazione
strutturale permette lapporto di nutrienti agli osteociti e lo scarico dei cataboliti
(L.C Junqueira, 2006).
Il tessuto osseo pu essere formato mediante due processi diversi: per
mineralizzazione diretta della matrice secreta dagli osteoblasti (ossificazione
intramembranosa) o per deposizione di una matrice ossea su una matrice
cartilaginea preesistente (ossificazione endocondrale). In entrambi i tipi di
ossificazione, in un primo momento si forma il tessuto osseo primario caratterizzato
da fibre intrecciate, che temporaneo ed rapidamente sostituito dallosso
secondario o lamellare, che definitivo.
Lossificazione intramembranosa ha luogo nellambito di addensamenti del tessuto
mesenchimale ed responsabile della produzione della maggior parte delle ossa
piatte, tra cui ricordiamo le ossa frontali e parietali del cranio, porzioni dellosso
occipitale, dellosso temporale, della mandibola e delle ossa mascellari. Nello strato
di addensamento mesenchimale, lossificazione inizia in corrispondenza del
cosiddetto centro di ossificazione primario, quando gruppi di cellule si trasformano
in osteoblasti. Gli osteoblasti producono la matrice ossea e fanno seguito i processi
di calcificazione e linglobamento di alcuni osteoblasti che si trasformano in
osteociti. Queste isole di osso in via di sviluppo formano delle pareti che delimitano
cavit allungate contenenti i capillari sanguigni, le cellule del midollo osseo e le
cellule staminali; la fusione delle diverse pareti conferisce allosso primario una
struttura spugnosa.
Lossificazione endocondrale , invece, responsabile della formazione delle ossa
corte e di quelle lunghe. Inizialmente il primo tessuto osseo che appare ha la forma
di un cilindro osseo vuoto che circonda la porzione intermedia del modello
cartilagineo. Questa struttura, il cosiddetto collare osseo, prodotta mediante un
processo di ossificazione intramembranosa che si svolge nellambito del
pericondrio locale. Nella fase successiva la cartilagine locale va incontro ad un
processo degenerativo di morte cellulare caratterizzato dal rigonfiamento delle
cellule e dalla calcificazione della matrice. Questi eventi determinano come esito la
formazione di una struttura tridimensionale costituita da resti della matrice
cartilaginea calcificata. Questo processo comincia in corrispondenza della porzione
centrale del modello cartilagineo dove i vasi sanguigni penetrano attraverso il
collare osseo precedentemente perforato dagli osteoclasti, facendo cos giungere in
tale sede le cellule osteoprogenitrici. Successivamente gli osteoblasti aderiscono
alla matrice cartilaginea calcificata e producono strati continui di osso primario che
circondano i residui della lamina cartilaginea. In tal modo si forma il centro di
ossificazione primario; quindi, in corrispondenza dei rigonfiamenti posti alle
estremit (epifisi) del modello cartilagineo appaiono i centri di ossificazione
secondari (L.C Junqueira, 2006).

La rigenerazione dellosso

Il tessuto osseo, come la maggior parte dei tessuti e come in tutti gli organismi
pluricellulari, presenta capacit di autorigenerarsi, non solo in seguito al normale
ricambio di cellule che giungono al termine della loro vitalit, ma anche in seguito
a danni o insulti di varia natura al fine di sopperire ad uneventuale compromissione
strutturale o della generale funzionalit del tessuto.
importante ricordare come ogni tessuto presenti una propria riserva di cellule
indifferenziate, ovvero di cellule staminali, che sono in grado, sotto specifici stimoli
di differenziarsi nel tessuto necessario e consentire la rigenerazione cellulare.
I meccanismi molecolari che regolano la rigenerazione ossea sono sistemi molto
complessi che vedono una partecipazione multifattoriale. Si tratta di sistemi gi
ampiamente studiati (Westhouser, 2015) dove si evidenzia la partecipazione di
citochine e fattori di crescita (Binder, 2015) contenuti nella matrice extracellulare
(ECM). Questi fattori vanno ad interagire con diversi tipi cellulari presenti nel sito
del danno, scatenando pathways di segnalazione intra ed extra cellulare che
porteranno come risultato alla rigenerazione del tessuto stesso. Una frattura non
consiste soltanto nellinterruzione della continuit ossea, bens anche nella
distruzione delle strutture vascolari; ci determina la formazione di un ematoma tra
i capi della frattura rappresentante una fonte di molecole segnale (fattori di crescita
e citochine) per i precursori monocito-macrofagici e osteo-condroblastici.
I macrofagi e le altre cellule infiammatorie reclutate secernono fibroblast growth
factor (FGF), tumor necrosis factor- (TNF-), platelet derived growth factor
(PDGF), transforming growth factor (TGF), insulin-like growth factor I (IGF-I)
ed una variet di citochine tra cui interleuchina 1 (IL-1) e interleuchina 6 (IL-6). A
loro volta queste hanno un effetto chemiotattico sulle cellule infiammatorie e sui
precursori osteoblastici (Lichte, 2015) (Haller, 2015).
Durante la fase precoce i precursori mesenchimali (Zhou, 2015) proliferano e si
differenziano in senso osteogenico e condrogenico (Lemos, 2015); si assiste,
inoltre, alla formazione di nuovi vasi sanguigni per gemmazione delle strutture
vascolari preesistenti attraverso una complessa cascata di eventi: degradazione
enzimatica della membrana basale, migrazione delle cellule endoteliali in direzione
dello stimolo angiogenico, proliferazione, maturazione e organizzazione delle
cellule endoteliali in tubi capillari. Tale processo regolato da FGF, vascular
endothelial growth factor (VEGF) (Subbiah, 2015) e angiopoietina 1 e 2.
Al termine della precedente fase, definita fase infiammatoria, segue la fase di
riparazione. Lossificazione intramembranosa ha inizio pochi giorni dopo il danno
tissutale, mentre lossificazione endocondrale, che coinvolge i tessuti adiacenti il
sito della frattura, si sviluppa nellarco di un mese circa. Larea subperiostale e i
tessuti molli immediatamente circostanti il sito della frattura formano il cosiddetto
callo duro e creano direttamente nuovo tessuto osseo. In tale processo i precursori
mesenchimali reclutati al sito della lesione si differenziano in senso osteoblastico e
producono sia osso compatto che trabecolare senza indurre la formazione di
cartilagine.
 Illustrazione delle varie popolazioni cellulari reclutate durante le diverse fasi della
guarigione ossea, dalla fomazione dellematoma, fino alla completa rigenerazione
Lossificazione endocondrale coinvolge il reclutamento e la proliferazione dei
progenitori multipotenti ed il loro differenziamento in cartilagine. La proliferazione
delleLossificazione
cellule staminali mesenchimali
endocondrale (hMSC)
coinvolge gi apprezzabile
il reclutamento tre giorni dopo
e la proliferazione dei la
frattura e rimane elevata per alcuni giorni (Vetter, 2011) (Lavenus, 2011).
progenitori multipotenti ed il loro differenziamento in cartilagine. La
Diversi sistemi di segnalazione sono implicati nel differenziamento delle hMSC in
senso osteogenicodelle
proliferazione (Huang, 2007).
cellule Il Wnt
staminali signaling pathway,
mesenchimali (hMSC) derivato da Wingless
gi apprezzabile 3
ed INT1, rappresenta una via di segnalazione molto importante; infatti le proteine
giorni dopo la frattura e rimane elevata per alcuni giorni [12] [13]. Diversi sistemi
Wnt regolano crescita, differenziamento, funzione e morte cellulare e hanno un
ruolodi fondamentale
segnalazione nella
sono biologia
implicati delneltessuto osseo (Tornero-Esteban,
differenziamento nelle hMSC in2015). sensoUn
importante
osteogenicopathway
[14]. che interviene quello delle proteine Hedghog (Hg): la
proteina Indian Hedghog (Ihh) prodotta dai condrociti ipertrofici ed ha un effetto
Il Wnt
diretto signaling pathway
sui progenitori (derivato
osteoblastici nellada fase
Wingless ed INT1)
precoce (Zou, rappresenta
2014). Il FGF una via di
Signaling
costituito
segnalazione da molto
polipeptidi dellacostituita
importante, famigliadaFGF proteinecheWntregolano lossificazione
appartenenti ad una
endocondrale e membranosa (Hankenson, 2015); in particolare Fgrg 1 espresso
nei famiglia
condrocitidi glicoproteine
ipertrofici ed secrete, che legano
ha effetti i recettori transmembrana
stadio-specifici sulla maturazione Frizzled
degli
osteoblasti: stimoladue
(FZD) attivando il differenziamento dei precursori,
diverse via di segnalazione: il pathwayma canonico
arresta lae quello
maturazione
non
degli osteoblasti differenziati (Tim, 2015 ). Notch signaling partecipa anchesso al
canonicoosteogenico,
programma di Wnt. Il primodalcoinvolge
momentola cheformazione di un
i recettori complesso
Notch e i lorotraligandi
le proteine
(Delta
1, 3,Wnt,
4 e FZD,
Jaggeded il corecettore low density lipoprotein receptor related protein (LRP)del
1,29 sono proteine transmembrana, la cascata di trasduzione
segnale viene attivata in seguito allinterazione cellula-cellula (Ma, 2015)
5 o 6. Nel pathway
(Yavropoulou, 2014). non
Daticanonico, Wnt5a
sperimentali lega il recettore
sostengono FZD eddimorfica
la funzione attiva le proteine
di Notch
signaling, che sembra essere in grado di regolare positivamente lespressione dei
geni del differenziamento osteoblastico ed indurre osteosclerosi, ma anche di
reprimere la maturazione degli osteoblasti indotta da BMP, inibendo lazione
15
transattivatrice di Runx2.
Uno dei fattori chiave espressi nella rigenerazione ossea BMP, ovvero Bone
Morphogenetic Proteins, membro della famiglia dei TGF e del relativo pathway
delle TGF Signaling (Rahman, 2015). Runx2, membro della famiglia dei fattori
Runt-related, considerato linterruttore molecolare chiave del differenziamento
osteoblastico; media, infatti, lattivazione temporale e/o la repressione di geni
essenziali nel processo (Bruderer, 2014). Runx2 abbondantemente espresso nella
cartilagine calcificata e nellosso; possiede un dominio di transattivazione che attiva
i promotori di osteocalcina e collagene di tipo 1 (Huang J. e., 2015). La sua
inattivazione determina linibizione della formazione di osso, rivelando il ruolo
essenziale del fattore tissutale nellossificazione endocondrale e diretta. Oltre ad
essere espresso negli osteoprogenitori ad uno stadio precoce di differenziamento ,
Runx2 essenziale per la funzionalit degli osteoblasti (Otto, 1997) (Choi, 2005).
Bisogna, inoltre, evidenziare che Runx2 in grado di indurre e promuovere
lespressione non solo del collagene di tipo 1 ma anche dellosteopontina, delle
sialoproteine ossee e dellosteocalcina, dimostrato in vitro (Komori, 2005).
La progressione del programma differenziativo delle cellule osteoprogenitrici vede
implicati altri geni chiave, come Osterix (SP7) (Wu, 2007), che codifica per un TF
geneticamente a valle rispetto a Runx2.
Nel caso in cui i monconi di un osso vengano persi o seriamente danneggiati da
essere asportati non possibile la saldatura ossea naturale da parte dei sistemi
riparativi endogeni; in questo caso, quindi, non c riparazione ossea dato che non
si pu formare un callo osseo.
In questa evenienza si deve ricorrere ad un trapianto di osso. Le conoscenze
scientifiche attuali dei meccanismi biologici alla base dellosso hanno portato alla
nascita delle banche dosso e allo sviluppo di diffuse applicazioni cliniche; studi
fondamentali sugli innesti ossei sono in gran parte attribuiti al lavoro di Albee
(Albee F. , 1932) (Albee F. , 1930) (Albee F. , 1919) (Albee F. , 1915) , Barth,
Lexter, Phemister (Phemister, 1915) (Phemister, 1948) durante la fine del XIX e
linizio del XX secolo. Questi contributi scientifici hanno reso gli innesti ossei una
tecnica comune relativamente efficace come procedura clinica.

Biomateriali e ingegneria tissutale

La possibilit di agire sulla crescita ossea attuabile grazie ai progressi della

scienza che hanno permesso sia lapplicazione di tecniche chirurgiche sempre pi
avanzate, sia lutilizzo di innesti ossei e biomateriali sempre pi intelligenti in
grado di caratterizzarsi come biomimetici. Essi devono, cio, essere in grado di
mimare alcuni processi metabolici che fanno parte della cascata di eventi che porta
alla formazione dellosso, sostituendo e/o accelerando alcune funzioni.
Un biomateriale un materiale progettato per interfacciarsi ed interagire con
sistemi biologici al fine di trattare, incrementare o sostituire tessuti, organi o
funzioni corporee. Esso deve essere biocompatibile, biodegradabile e bioattivo,
avere cio la capacit di interagire positivamente con i tessuti riceventi. In tale
definizione sono compresi i sostituti ossei semisintetici, ovvero preparati a base di
tessuto osseo non vitale allogenico o eterologo, sottoposto a opportuni trattamenti
e conservati nelle banche dellosso, e i materiali alloplastici. Lavvento poi
dellingegneria tissutale ha aperto nuove ed allettanti possibilit future (Burg KJ,
2000).
Lingegneria tissutale definita come la scienza a carattere multidisciplinare che
utilizza i principi dellingegneria e delle scienze biomediche per elaborare prodotti
artificiali o biologici fino a creare dei derivati completamente nuovi, in grado di dar
luogo alla riparazione di organi e tessuti danneggiati o addirittura alla loro
rigenerazione. Essa ha permesso anche la progettazione e lo studio di biomateriali
in grado di dar luogo alla formazione di nuovo tessuto osseo anche in sedi diverse
dallosso tramite un processo denominato osteoinduzione.
La rigenerazione ossea ha la necessit di utilizzare biomateriali perch richiede un
supporto (scaffold) che permetta la creazione di un ambiente tridimensionale
simile a quello del tessuto osseo originario, dove le cellule ed i vasi possano
svilupparsi promuovendo il processo di osteoconduzione. Lo scaffold dovrebbe
possedere unampia superficie disponibile per ladesione cellulare, essere dotato di
pori numerosi ed ampi che presentino una vasta interconnettivit in modo da
consentire la penetrazione di strutture vascolari neoformate e di cellule
osteogeniche.
Luso dei biomateriali ha consentito, negli ultimi decenni, di risolvere con successo
problemi di carenza e di supporto osseo in vari campi dellodontoiatria, come
parodontologia, protesi, implantologia e chirurgia.
La risposta che un biomateriale pu provocare, una volta posizionato in situ,
dipende dalle propriet biologiche del materiale stesso e pu variare da un punto di
vista sia qualitativo che quantitativo, ma rimane comunque strettamente legata alle
capacit di guarigione individuali dellorganismo del paziente.
Un materiale da innesto ideale dovrebbe:
- Essere biocompatibile, atossico, non immunogeno, radiopaco, sterile,
economico e reperibile sotto varie forme, in modo da essere utilizzato per
tutte le esigenze cliniche;
- Possedere ottime propriet meccaniche, in modo da supportare
adeguatamente la struttura ossea circostante;
- Essere totalmente riassorbibile e sostituito, nel tempo, da osso vitale;
- Ricalcare, una volta impiantato nel tessuto dellospite, nelle modalit ma in
tempi pi brevi, lo stesso modello di guarigione dellosso naturale
fratturato;
- Essere bioattivo, capace cio di determinare la rigenerazione ossea
attraverso tre meccanismi: losteogenesi, losteoinduzione, e
losteoconduzione.
Nessun materiale soddisfa attualmente tutte le caratteristiche richieste.
I meccanismi alla base della rigenerazione ossea sono losteogenesi,
losteoinduzione e losteoconduzione.
Per osteogenesi si intende la capacit di neogenesi ossea dellinnesto. Questa trae
origine dalle cellule viventi, ovvero osteoblasti endostali e cellule midollari
progenitrici, presenti allinterno dellinnesto e con esso trapiantate in un nuovo sito,
dove sopravvivono per i primi giorni attraverso le sostanze nutritive provenienti dai
tessuti vascolari adiacenti. Questo meccanismo si riscontra maggiormente negli
innesti di spongiosa, pi ricchi di cellule vitali rispetto a quelli di corticale. Losso
autologo il solo materiale da trapianto disponibile con propriet osteogeniche.
Losteoinduzione la capacit di un biomateriale innestato di indurre la
neoformazione di osso anche quando il materiale posizionato in sedi eterotopiche,
cio diverse dallosso. Losteoinduzione implica la neoformazione ossea a partire
da cellule osteoprogenitrici, a loro volta derivanti da cellule mesenchimali primitive
sotto linfluenza di uno o pi fattori inducenti liberati dalla matrice ossea (Marshall
R. Urist, 1965).
Losteoconduzione la capacit dellinnesto di supportare e guidare la crescita
ossea sulla sua superficie quando impiantato in siti intrascheletrici.
Losteoconduzione si realizza quando il materiale da innesto presenta un reticolo
tridimensionale, che serve come scaffold per accogliere e guidare i vasi e le
cellule che dal sito ricevente penetrano dapprima nella periferia e poi allinterno
dellinnesto, dando luogo a uninvasione cellulare e vascolare. Il materiale
progressivamente sostituito da osso neoformato che ne segue limpalcatura
inorganica (fenomeno della creeping substitution) (Rosenbaum., 2012).
Lapporto ematico molto importante ai fini della sopravvivenza dellinnesto,
dellosteogenesi, dellosteoinduzione e dellosteoconduzione. Il posizionamento di
un innesto osseo osteoconduttivo promuove una serie di eventi allinterfaccia tra il
materiale impiantato e losso ricevente, dando luogo ad una straordinaria variet di
reazioni e processi biochimici dinamici. Questi ricalcano molto da vicino i processi
fisiologici che si verificano in caso di frattura, ma da questi si differenziano per la
presenza di un materiale che, non avendo n propriet osteogenetiche n
osteoinduttive, per essere integrato deve essere colonizzato da vasi e cellule
osteoprogenitrici provenienti dal tessuto che ospita linnesto. Questultimo, una
volta posizionato, viene bagnato dal sangue dellorganismo ospite con conseguente
formazione del coagulo dal quale, per effetto delle piastrine, si liberano BGF, BMP
ed altri mediatori chimici. Le proteine interagiscono con la superficie del
biomateriale innestato e si adsorbono su di esso, formando uno strato proteico le
cui caratteristiche dipenderanno dalle propriet di superficie del biomateriale e
dallaffinit delle proteine per la superficie stessa. Questo passaggio permette la
trasformazione della superficie del materiale estraneo ed inerte, in una superficie
biologicamente attiva, in grado di legare, attraverso i recettori specifici delle
proteine, le cellule provenienti dal tessuto ospitante. In tal modo viene indotta una
risposta cellulare specifica che determiner la risposta dellospite allinnesto,
portando alla sua integrazione nel tessuto ricevente o al suo rigetto, indice di scarsa
biocompatibilit.

Estetica facciale e protesi zigomatiche

Sebbene le proporzioni facciali, gli angoli e i contorni del viso possano variare in
base allet, al sesso e alla razza, importante riconoscere degli ideali di estetica
quando si analizza un profilo facciale. Inoltre dei lineamenti del viso armonici e
naturali hanno un impatto importante anche a livello psicologico (Heldt L, 1982).
Quando una deformit dentofacciale cos accentuata da non poter essere risolta
con il solo trattamento ortodontico la soluzione terapeutica pu essere ottenuta con
una combinazione di ortodonzia e chirurgia ortognatica. Questo ha lobiettivo di
ottenere una migliore armonia facciale sia a livello scheletrico sia per quanto
riguarda i tessuti molli e locclusione funzionale. Pianificare un intervento di
chirurgia ortognatica richiede degli ideali per le proporzioni facciali. Questi
standard a livello estetico si basano sulla valutazione dellanalisi cefalometrica e di
misure antropometriche.
Il viso diviso in tre parti orizzontali: il terzo superiore si estende dallattaccatura
dei capelli alla glabella, il terzo medio dalla glabella alla linea sub-nasale, e il terzo
inferiore dalla linea sub-nasale al mento. Raramente queste tre porzioni sono uguali
tra loro.
Il terzo medio unarea critica per lestetica facciale; le eminenze malari, infatti,
insieme al naso e al mento rappresentano le aree pi prominenti del viso (Whitaker,
1987). Lipoplasia malare ha come diretta conseguenza lappiattimento generale
del volto e lalterazione delle normali proporzioni facciali; pu, inoltre, portare a
un apparente invecchiamento del soggetto (Hinderer, 1975). Un incremento
maxillo-zigomatico, quando indicato, richiede unaccurata pianificazione sia
estetica sia di analisi cefalometrica (Wilkinson, 1983).
In letteratura sono state descritte svariate tecniche chirurgiche di incremento a
livello zigomatico (Mladick RA, 1991) (Nocini PF, 2009) (EO., 1992).
Tradizionalmente linserimento di protesi zigomatiche ottenuto simultaneamente
a interventi di osteotomia (Jones RHB, 1995) (Layoun W, 2003) (Salyer, 1994).
Le prime tecniche di ricostruzione facciale risalgono agli anni 70 quando venivano
comunemente utilizzate protesi in silicone (Rees TD, 1973). Moos nel 1978
descrive luso di Proplast per ottimizzare i difetti facciali e per la ricostruzione delle
creste alveolari; in base ai risultati dei suoi trattamenti conclude che si tratta di un
materiale utile ma con un alto rischio di infezioni dovute allapproccio intraorale
(K.F. Moos, 1977). Anche Mladick, nel 1991, sostiene lutilizzo di protesi in
silicone e a base di Proplast che vengono inserite tramite accesso intraorale, o con
laccesso utilizzato nella blefaroplastica o sollevando un lembo nella porzione
inferiore del viso (Mladick RA, 1991).
Per molti anni, poi, gli innesti di osso autologo sono stati considerati il gold standard
per ottimizzare larmonia facciale; in seguito emersero, per, il possibile contagio
in base alla morbidit del donatore, la difficolt di modellazione del materiale e
limprevedibile riassorbimento a distanza di tempo (Wolfe, 1991).
Negli anni 80 diversi autori, tra cui Tessier, proposero procedure di osteotomia, in
particolare Le Fort II e Le Fort III, per ottenere un movimento postero-anteriore
dellintera faccia ottimizzando locclusione e migliorando la capacit orbitaria
tramite laumento del diametro verticale orbitario (Tessier, 1971). Questa tecnica,
per, fu abbandonata a causa della sua invasivit, delle difficolt tecniche
intraoperatorie, della non predicibilit e della frequente necessit di utilizzare
osteotomie meno invasive come la Le Fort I per correggere il piano occlusale
(Brusati R, 1989) (Denny AD, 1993).
A tal proposito Maurice Y. Mommaerts sostiene lapplicabilit di questa procedura
introducendo delle modifiche; la tecnica dellosteotomia zigomatica a sandwich
prevede, infatti, che il corpo dellosso zigomatico venga lussato lateralmente e
ventralmente dopo unosteotomia combinata obliqua orizzontale e verticale. La
frattura a legno verde della sutura temporo-zigomatica che ne deriva insieme ad uno
spostamento (DEGLOVING) minimo laterale permette allo zigomo di tornare nella
sua posizione precedente. Viene posizionato un blocco di idrossiapatite porosa che
agisce come mantenitore di spazio finch i siti in cui avvenuta losteotomia
vengono ossificati (Mommaerts MY, 1995).
Attualmente lutilizzo di biomateriali come scaffold gioca un ruolo fondamentale
in queste procedure. Il Silastic, elastomero biomedico, stato utilizzato in chirurgia
plastica ed estetica grazie alla propriet di essere posizionato facilmente, di non
necessitare di stabilizzazione e di portare a risultati soddisfacenti nellestetica
facciale dei pazienti. Tuttavia si sono verificati diversi casi di complicanze come
infezioni, dislocazioni, formazioni di una capsula fibrotica, perdita di integrazione
e in alcuni casi anche riassorbimento di osso nativo (Sheen JH, 1987) (Metzinger
SE, 1999) (Goncales ES, 2009).
In letteratura sono state descritte altri materiali alloplastici derivati dai polimeri e
dalle ceramiche. Tra queste Medpor, un polietilene poroso ad alta densit, viene
utilizzato in chirurgia cranio-maxillofacciale, come materiale di camouflage nei
deficit dei tessuti molli post-oncologici o post-traumatici, nella ricostruzione del
pavimento e della parete laterale dellorbita, delle strutture ossee mediofacciali, del
mento e del naso, nella ricostruzione dellorecchio conseguente ad ustioni gravi.
Esso ha numerosi vantaggi: facile da posizionare, preformato ed possibile
fissarlo con apposite viti. Tuttavia questo materiale caratterizzato da una ridotta
malleabilit e adattabilit al sito ricevente e pu essere correlato ad alcuni rischi
come il malposizionamento, una significativa incidenza di infezioni sia precoci che
tardive, la formazione di pseudocapsule e il fallimento dellosteointegrazione
(Frodel JL, 1998) (Gosau M, 2008).
Altri studi analizzano il Gore-Tex come materiale da innesto mettendo in evidenza
la propriet di essere preformato e facile da posizionare ma a distanza di tempo
emergono notevoli complicanze e risultati non soddisfacenti come la fuoriuscita del
materiale da innesto, la formazione di sieroma e la perdita di osteointegrazione nel
tempo (Owsley TG, 1994).
Lidrossiapatite corallina porosa Interpore-200 (Interpore Orthopaedics, Inc.,
Irvine, CA), disponibile in granuli o sotto forma di blocchetti, un altro materiale
frequentemente usato in chirurgia maxillo-facciale come innesto osseo per
ottimizzare i profili facciali. I granuli di idrossiapatite sono stabili, biocompatibili,
sicuri e hanno propriet osteoconduttive ma nonostante ci le protesi possono
richiedere una correzione successiva e possono creare dei problemi di asimmetria
facciale. Inoltre per le sue caratteristiche strutturali tale materiale sembra non essere
in grado di sostenere il carico funzionale (Rubin & Yaremchuk, 1997) e per la sua
natura granulare non prefabbricato o preformato e questo lo rende di minor
utilizzo rispetto ai materiali finora descritti.

Applicazione clinica di Granular ProOsteon 200 e Avitene

Microfibrillar Collagen Hemostat

Il punto di partenza di questo lavoro dato dagli ottimi risultati che lutilizzo di
questo materiale ha portato sia a livello clinico, che radiografico che istologico.
Tale studio sui pazienti stato realizzato in accordo con i principi fondamentali
della Dichiarazione di Helsinki redatta nel 1977 e aggiornata nel 2000 per quanto
riguarda le ricerche sullessere umano ed stato approvato dalla commissione di
revisione dellAzienda Ospedaliera di Verona (Verona, Italy). I pazienti sono stati
ampiamente informati sulla natura e sullo scopo dello studio e solo successivamente
hanno sottoscritto un consenso informato relativo al trattamento e alluso dei loro
dati in forma anonima ai fini di ricerca scientifica. Tutti i pazienti, inoltre hanno
partecipato ad almeno 3 anni di follow-up (follow-up medio di 6 anni; il ragen va
da 3 a 10 anni).
In un periodo di 7 anni, dal 2005 al 2012, 430 pazienti (270 donne e 160 uomini) la
cui et media di 28 anni (il range varia tra i 18 e i 45 anni) sono stati sottoposti al
trattamento di aumento della regione zigomatica e di miglioramento dellestetica
facciale usando granuli di idrossiapatite porosa. In totale sono state posizionate 860
protesi.
Tutte gli interventi chirurgici sono stati realizzati nel Centro Arnett-Gunson di
chirurgia ricostruttiva mascellare (Santa Barbara, CA) o nel Reparto di Odontoiatria
e Chirurgia Maxillo-Facciale dellAzienza Ospedaliera-Universitaria integrata di
Verona (Verona, Italy).
Il trattamento chirurgico a cui i pazienti sono sottoposti ha lo scopo di migliorare
sia dal punto di vista estetico che funzionale larea malare nei casi in cui ci sia una
proiezione zigomatica insufficiente o una asimmetria facciale dellarco zigomatico.
Le procedure chirurgiche sono state realizzate in anestesia generale dopo la
somministrazione di una profilassi antibiotica di ampicillina e sulbactam 1,5 g in
endovena 1 ora prima dellintervento. In accordo con i pazienti di G. William
Arnett, le protesi sono state assemblate a mano e preparate mescolando 5 mL di
granuli di idrossiapatite (Pro-Osteon 200, Interpore Cross International, Irvine,
CA), 1g di collagene emostatico microfibrillare (Avitene, Davol Inc., Warwick, RI)
e 5 mL di soluzione fisiologica sterile (come nelle immagini precedenti).
I due materiali vengono assemblati utilizzando strumenti sterili. In una prima fase
il composto molto malleabile; successivamente, dopo che stato modellato, viene
posizionato per 150 minuti sotto una lampada da 150 Watt e lasciato indurire.
Il posizionamento delle protesi zigomatiche avviene nella fase finale della chirurgia
ortognatica (Le Fort I) dal momento che lincisione superiore vestibolare usata
dopo rimosso in maniera selettiva larea tra il nervo infraorbitario medialmente e
larco zigomatico lateralmente, creando delle tasche, la cui grandezza dipende dalla
grandezza delle protesi, allinterno dellosso zigomatico. Questo un passaggio
fondamentale che previene il dislocamento delle protesi.
fondamentale un attento controllo emostatico del sito ricevente. Se la protesi
viene posizionata troppo lateralmente verr aumentato maggiormente il diametro
inter-zigomatico. Daltra parte, se la protesi viene posizionata pi medialmente
verr aumentata la proiezione sagittale. Non necessaria una fissazione interna per
stabilizzare le protesi, ma vengono applicate delle manovre compressive extraorali
per stabilizzarle.
Le valutazioni cliniche dei pazienti sottoposti a follow-up consistono nella
quantificazione delle complicanze a breve e a lungo termine correlate a
problematiche infiammatorie o infettive ma anche la necessit di altre procedure;
nella stabilit delle protesi (assenza o presenza di segni clinici apprezzabili di
riassorbimento); e infine nelle fotografie realizzate da 1 a 3 anni dopo la chirurgia.
76 dei 430 pazienti hanno dato lautorizzazione a completare la scala analogica
visiva (VAS), una scala di valutazione che prevede una serie di valori su una scala
da 0 a 100. In questo studio viene chiesto ai pazienti di giudicare la naturalezza del
contorno facciale nella regione dellarco zigomatico: viene, prima, spiegato di dare
punteggio 0 se ritengono che le protesi siano innaturali e 100 se sono
completamente soddisfatti del loro nuovo profilo. Viene poi valutata la simmetria:
viene chiesto di conferire voto 0 se un lato risulta diverso dallaltro e 100 se le due
parti risultano esattamente uguali. Il terzo parametro consiste nella sensazione di
naturalezza delle protesi: viene chiesto di dare un punteggio di 0 se la protesi risulta
estranea al proprio corpo e 100 se risulta essere parte del corpo. A tutti i pazienti
viene richiesto di esprimere la loro soddisfazione nei confronti delle protesi e dare
votazione 0 se sono completamente insoddisfatti e 100 se sono completamente
soddisfatti.
Tutti i pazienti sono stati sottoposti a controllo radiografico dopo 1 mese, al tempo
T1, e dopo 24 mesi, al tempo T2. 110 dei 430 pazienti hanno accettato di eseguire
una tomografia computerizzata a raggio conico (CBCT; NewTom 3G device; QR
srl, Verona, Italy) ad almeno 36 mesi dopo la chirurgia (nel tempo T3). I segni di
riassorbimento dellosso nativo e le variazioni nella struttura e nella radiopacit del
materiale impiantato sono stati valutati da un osservatore cieco, ovvero il radiologo
che ha analizzato le CBCT; questo fenomeno stato su lungo periodo (maggiore o
uguale a 36 mesi) in 110 dei pazienti analizzati.

FOTO POSIZIONAMENTO e TAC

Sono stati realizzati dei campioni bioptici dalle protesi in 8 pazienti che
richiedevano la rimozione delle viti di fissaggio a livello del mascellare superiore
dopo 2 anni dalla chirurgia. Dopo aver dato il consenso informato, i campioni
bioptici sono stati prelevati usando una fresa trephine (diametro interno di 2mm e
diametro esterno di 3mm) e, in totale, sono stati raccolti 19 campioni del materiale.
Ciascun campione stato prelevato in modo tale da raccogliere una porzione della
 CLINICAL EVALUATION structure and that the granules ha
Clinical evaluation (Table 1) of patients showed that the surrounding soft tissues (Fig
prosthesis malposition, which was noted in 6 cases, of the prosthesis was radiotran
was probably due to excessively large subperiosteal with the compact portion of the z
pockets in which the prostheses were positioned. T2, the prosthesis seemed to adhe
The inappropriate dimension led to a caudal rather underlying zygomatic bone in all
ular structure was still distinguis
protesi nella lunghezza totale dal periostio
than contralateral slippage ofallosso nativo,
the prosthesis. Fivee cases
la parte del periostio
was less evident, and the partial
stata segnata con una penna.
of partial Il materiale
resorption wereraccolto stato
noted; all were fissato
linked to in formaldeide
had evolved conto a radiopacity sim
inadequate hemostasis of the recipient site
il 4% di fosfato e lavato in un buffer. Dopo la decalcificazione con or in Osteodec
some cases to massive bleeding at the patients awak- compact part of the native bone, m
(BioOptica Milano Spa, Milan, Italy), il campione
ening. There were 2 cases of early infection
stato disidratato
to con the interface betwe
distinguish
concentrazioni crescenti
(<30 days)direquiring
alcol e removal
xilene eof poi inserito inThere
the prosthesis. paraffina. andLeboneanalisi
(Fig 8). That tendency co
morfologiche e immunoistochimiche dei campioni di osso sono
were no cases of late-onset infection, dehiscence, fis- stati realizzati
to the per data available at T3,
imaging
valutare il rimodellamento e leventuale
tula, or thinning or alterationosteogenesi. Quattro
of overlying soft loss of definition
tissues.sezioni sono state of the granular a
almost complete radiopacity and ap
colorate con ematossilina
Comparison e eosina, e limmunoistochimica
of photographs taken 1 and 3 yearslaterstata realizzata
tion of
sulle
the bone in contact with t
sezioni usando 2 confirmed the registeredspecifici
anticorpi monoclonali clinical data
per la(Figs 3-6). K (clone CK4,
catepsina interface between the prosthesis
Some patients reported bilateral edema and pain in
Novocastra, Newcastle, UK; clone 3F9, Abcam, Cambridge, UK) perappeared colorareindistinguishable
gli (Fig 9).
the zygomatic region during the first month after
osteoclasti e per CD56
surgery.(clone 123C3.D5,
Thirteen 1:100; had
patients (1.56%) Thermo
some Scientific,
kind of Grand Island,
NY) per colorare gli osteoblasti,
complication; come had
2 (0.2%) precedentemente descritto (PedicaHISTOLOGIC
infectious complications. F, 2009). EVALUATION
La catepsina K fondamentale per la degradazione
The VAS was completed by 76 of the 430delpatients
collagene di Thetipopersistence
I nel of porous HA an
riassorbimento osseo
(Tablemediato
2). Thedagli osteoclasti
patients (Wilson
substantially SR,
agreed on2009)
their e CD56 macchia
although without inflammatory infi
all samples (Table 3). Fibrous strom
perceptionattivati
gli osteoblasti rimanenti . (Ely parameters
of the primary SA, 2002). characterizing
Le aree vitaliandsono stati
the presence of new osteog
the result. On a scale of 0 to 100%, the average judg-
identificate controllando la sezione colorata con ematossilina
ment about the natural contour of the zygomatic pro-
e eosina con
bone was found il in 70% of cases. A
microscopio otticofile ewas
cercando
85.83 ! gli osteociti
22.22 nucleati.95.19).
of 100 (median, Poi, The
applicando lanalisi
findings, the presence of mature
immunoistochimica, la presenza di osteoclasti
average judgment about symmetry was 85.68 ! stata valutata mediante
only at the la
periosteal side (marked
colorazione dellanticorpo
23.00 (median, catepsina
96.44).KThe
(G., 2001)judgment
average e degliabout the presence
osteoblasti reattivi al of new formation
CD56 (Ely SA, the implants
2002). Sononatural
state feeling
anche was 80.30 ! la
investigate 26.28 of
percentualewas found
di nuova entirely on the deep
100 (median, 92.10). The patients average general bone with a bone maturation gr
formazione ossea, la percentuale di tessuto fibroso e la presenza del biomateriale.from the periosteal to the deep side
histochemical investigations u
Da questi dati emerso che le complicanze si sono verificate solo nell1,56% deiprotease contained in
cathepsin K
Table 1. CLINICAL COMPLICATIONS
casi: the macrophages, thus indicating th
Prostheses oclast activity localized around th
Complications (N = 860), n (%) 11). The anti-CD56 antibodies ind
osteogenesis activity at the side of
Malposition requiring 6 (0.72) adjacent to the native bone (deep),
secondary correction sults of histomorphometric analyse
Partial or total resorption 5 (0.64)
requiring secondary Discussion
correction
Dehiscence 0 Arem et al2 and Moos et al3 were
Fistula 0
describe pioneering experiences
Infection 2 (0.2)
enhance the lower third of the fac
Thinning of overlying soft tissue 0
1970s. These procedures were follo
Total 13 (1.56)
onlay bone grafts that were initially
DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral rib and iliac crest and later from
stata, inoltre, indagata
Maxillofacla soddisfazione
Surg 2016. dei pazienti che hanno giudicato su those
Although una grafts that were pos
scala da 0 a 100% la naturalezza del profilo a livello zigomatico, la simmetria, la
sensazione
DAGOSTINO ET soggettiva
AL della protesi e la soddisfazione generale. 1238.e10

Table 2. VISUAL ANALOG SCALE OUTCOMES

Patients, n Natural Contour Symmetry Natural Feel Satisfaction

76 85.83 ! 22.22; 85.68 ! 23.00; 80.30 ! 26.28; 84.41 ! 23.96;

95.19 (88.19, 99.91) 96.44 (87.14, 100) 92.10 (70.86, 99.39) 96.72 (79.77, 100)

Note: Data are presented as mean ! standard deviation; median (quartiles 1, 3).
DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral Maxillofac Surg 2016.

a livello radiografico, ad eccezione dei casi di riassorbimento parziale o totale, si

purposes were considered the gold standard in the advancement, at times in conjunction with bone graft-
pu
1980s,evidenziare
they have sinceche beenad un mese
abandoned dallaofchirurgia
because ing andle protesi hanno
stabilization. Given themantenuto la loro
high surgical invasive-
struttura granulare, non vi stata migrazione del materiale allinterno dei tessuti
donor site morbidity, the difficulty in modeling non- ness of these procedures, the need for an extraoral
adaptable graft materials, and, in particular, the unpre- (coronal sub-palpebral) approach, the technical diffi-
molli circostanti e appaiono radiotrasparenti.
dictable results of graft volumetric maintenance.5,24-27
Dopo 24 mesi dalla chirurgia la
culty in carrying them out, and controlling occlusal
struttura
Brusati et al granulare
7
and Denny and Rosenberg
ancora who
8
distinguibile,
pro- ma they
problems, meno are noevidente
longer usedein la parziale
traditional or-
posed using Le Fort III osteotomies to obtain esthetic thognathic surgery and currently are used only in
results initially followed the method described by Tess- cases of malformations in pediatric patients. The low
ier6 to harmonize facial disharmonies and his sugges- zygomatic maxillary osteotomy proposed by Bell
tions on modifying and simplifying those et al28 in 1988 is a technique that corrects defects in
procedures. Those methods foresaw midfacial a transverse direction of the zygomatic region,
 95.19 (88.19, 99.91) 96.44 (87.14, 100) 92.10 (70.86, 99.39) 96.72 (79.77, 100)

Note: Data are presented as mean ! standard deviation; median (quartiles 1, 3).
DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral Maxillofac Surg 2016.

purposes were considered the gold standard in the advancement, at times in conjunction with bone graft-
1980s, they have since been abandoned because of ing and stabilization. Given the high surgical invasive-
donor site morbidity, the difficulty in modeling non- ness of these procedures, the need for an extraoral
adaptable graft materials, and, in particular, the unpre- (coronal sub-palpebral) approach, the technical diffi-
dictable results of graft volumetric maintenance.5,24-27 culty in carrying them out, and controlling occlusal
radiotrasparenza si trasformata in radiopacit. Si arriva, poi, a 36 mesi
Brusati et al7 and Denny and Rosenberg8 who pro- problems, they are no longer used in traditional or-
posed using Le Fort III osteotomies to obtain esthetic thognathic surgery and currently are used only in
dalloperazione chirurgica in cui si ha una perdita di definizione dellarchitettura
results initially followed the method described by Tess- cases of malformations in pediatric patients. The low
granulare, una completa radiopacit e unapparente corticalizzazione dellosso in
ier6 to harmonize facial disharmonies and his sugges-
tions on modifying and simplifying those
zygomatic maxillary osteotomy proposed by Bell
et al28 in 1988 is a technique that corrects defects in
contatto con la protesi.
procedures. Those methods foresaw midfacial a transverse direction of the zygomatic region,

1238.e11 HYDROXYAPATITE FOR MALAR AUGMENTATION

FIGURE 7. Cone-beam tomogram, coronal slice, at 1 month after surgery.
DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral Maxillofac Surg 2016.

FIGURE 8. Cone-beam tomogram, coronal slice, at 24 months after surgery.

DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral Maxillofac Surg 2016.

requiring an augmentation of the bizygomatic diam-
eter, but also necessitating9 grafts composed of onlay
bone grafting material (eg, HA granules) if an increase
in the sagittal projection of the malar bone is clinically
necessary. Traditional orthognathic and plastic sur-
geries have moved in the direction of using allogeneic
material, or rather so-called implantable biomaterials.
The ideal material should be biocompatible and osteo-
conductive and show a high degree of reabsorption
that is predictable over time.17 More specifically,
biocompatibility presupposes an inert chemical state,
an absence of toxicity, an inability to induce hypersen-
sitivity responses, and a low rate of infections.
Gore-Tex (polytetrafluoroethylene), a widely used
prosthetic bone graft material, presents a sufficient de-
gree of volumetric stability over time. Because it is pre-
shaped, it is easily positioned and can guarantee
satisfying esthetic results. However, it needs to be sta-
bilized with screws, it is difficult to adapt it to the
recipient site, and it is characterized by a relevant
rate of infectious complications. Moreover, Gore-Tex
implants remain slippery because there is no host
tissue ingrowth and they carry an increased risk of
infections, seroma formation, and extrusion.16,29-31
Although rigid screw fixation is a very effective and
efficient method of fixing malar implants, there are
complications, such as the pneumatocele described
by Garner and Jordan.30 The low biocompatibility of
the material probably plays a part in this type of
complication.
Silicone derivatives likewise present a series of ad-
vantages and disadvantages. They are available in pre-
shaped forms, are easily positioned, and do not need
to be stabilized with screws, characteristics that
explain their wide use. According to many investiga-
tors, such as Metzinger et al11 and Mommaerts et al,9
the percentage of residual malposition asymmetry
varies from 15 to 35%. Nevertheless, silicone im-
plants lack the potential for vascularized healing, pro-
mote thick capsule formation, cause resorption of the
underlying bone, and display a tendency of shifting
or extruding over long periods.10,32 In the present
study, the complications were probably linked to
the limited osteoconductive properties of the
DAGOSTINO ET AL 1238.e12

FIGURE 9. Cone-beam tomogram, coronal slice, at 36 months after surgery.

DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral Maxillofac Surg 2016.

a livello istologico, infine,

stabledai
derivatives and to a chronic inflammatory reaction to over reperti
time, but bioptici
it is difficult tostata evidenziata la presenza di osso
position, 13

extraneous bodies (chronic inflammatory

because of its rigidity, and to contour surfaces of com-
peripheral reaction). maturo solo nella porzione di periostio,
plex skeletal mentre
structures. It needs la presenza
to be stabilized with di nuovo osso immaturo
stata reperita nella parte
As in the cases cited earlier, Medpor (porous poly-
pi profonda dellosso
screws. The complication rate varies from 5 to 20%
ethylene) is a material that is widely used for surgical
and it is associated with a relatively large percentage nativo con un gradiente di
maturazione che aumenta dal periostio al lato pi profondo.
33,34
purposes and in trauma patients. It is preshaped and
of early- and late-onset infections (1 to 12%).
Medpor creates a fibrous capsule, it is not
osteoconductive, and it is not very inert with respect
Table 3. HISTOLOGIC EVALUATION OUTCOMES to immunologic responses.14
Different researchers have described using porous
2-yr Postoperative Histologic
Findings (19 Specimens) %
HA as onlay bone grafts for the facial skeleton.35,36 In
a study by Moreira-Gonzales et al17 on the use of HA
Hydroxyapatite granules 100 in procedures to contour the face, the percentage of
Macrophages (foreign body 100 complications was relatively small (5.6%); more specif-
reaction) ically, 4.3% had contour irregularities and 1.3% had
Fibrous stroma 50 infection and extrusion of granules requiring overcor-
New bone formation and 70 rection of 15% of the required volume. An animal study
mature trabecular bone showed that, in contrast to the rapid resorption of
DAgostino et al. Hydroxyapatite for Malar Augmentation. J Oral autologous grafts, porous HA matrix had long-term
Maxillofac Surg 2016. permanence with maintenance of contour and osseous
Obiettivo
Lo scopo di questo lavoro quello di saggiare le propriet osteoconduttive,
osteoinduttive di uno scaffold sostitutivo osseo denominato granular
ProOsteon200 coralline hydroxyapatite e Avitenemicrofibrillar collagen
hemostat con cellule staminali mesenchimali derivate da tessuto adiposo umano
adulto (hASC) come modello cellulare in vitro.
Il punto di partenza di questo studio dato dai buoni risultati ottenuti a livello
clinico, radiografico e istologico a lungo termine, come illustrato precedentemente.
Materiali e Metodi
Biomateriale

Il materiale a base di idrossiapatite corallina porosa di questo lavoro composto da

Granular ProOsteon 200 (Interpore Cross Irvine, CA, USA) e Avitene
Microfibrillar Collagen Hemostat (Bard Warwick, Rhode Isalnd, USA). Questo
scaffold chiamato Coll/Pro Osteon 200.
Granular ProOsteon 200 coralline hydroxylapatite (Biomet Osteobiologics
Parsippany, NJ, U.S.A) (Baas, 2011) unidrossiapatite sintetica ottenuta
dallesoscheletro del corallo, molto simile per composizione alla componente
minerale dellosso umano. Un processo di produzione brevettato preserva la
struttura porosa del corallo mentre lo scheletro di carbonato di calcio subisce una
conversione chimica idrotermale in idrossiapatite. Le dimensioni dei pori vanno da
190 a 230 micron sebbene ci possano essere alcune variazioni della porosit in base
a come presente in natura il materiale. Questo scaffold disponibile in fiale da 5
ml di granuli sterili con un diametro ipotetico di 425-1000 microns. Pro Osteon
200 stoccato a temperatura ambiente prima dellanalisi in questione.

IMMAGINE

Avitene Microfibrillar Collagen Hemostat usato comunemente in procedure

chirurgiche ed costituito da collagene con attivit emostatica, in grado di
accelerare la formazione del coagulo migliorando laggregazione piastrinica e il
rilascio di proteine come fibrina, con conseguente emostasi, per il controllo del
sanguinamento quando legature o procedure convenzionali risultano efficaci o
impraticabili.

IMMAGINE

Nel nostro modello in vitro i granuli di Pro Osteon 200 sono stati assemblati
insieme a Avitene Microfibrillar Collagen per la formazione dello scaffold
definitivo impiegando 5ml di Pro Osteon, 1 g di Avitene e 5 ml di soluzione
fisiologica. Vengono, quindi, formate delle unit singole a forma discoidale di 1 cm
di diametro e 0,2 cm di spessore. A livello clinico il materiale viene manipolato
utilizzando strumenti sterili e la forma finale dipende dal profilo facciale del
paziente. In una prima fase il materiale molto malleabile ma, dopo che stato
preformato, viene sottoposto ai raggi UV per almeno 150 minuti a 150 Watt per
assicurarne la sterilit, la disidratazione e la consistenza fisica (D'Agostino A,
2016).

hASC: isolamento, caratterizzazione e coltura

Le linee cellulari utilizzate per questo studio sono le hASC (huan adipose-derived
stem cell), ovvero cellule staminali primarie derivanti da lipoaspirati di soggetti
umani sani. Le hASC presentano caratteristiche molto simili sia fenotipicamente
che funzionalmente alle cellule staminali mesenchimali provenienti da midollo,
ovvero le hMSC. Ampi studi hanno dimostrato la capacit delle hASC di
differenziarsi nella linea condrogenica, osteogenica, adipogenica e neuronale.
Queste cellule sono ottenute dal grasso addominale sottocutaneo, in seguito ad
anestesia locale, da tre pazienti sottoposti a liposuzione per ridurre il loro peso.
Dopo essere stato lavato con soluzione salina (PBS), il tessuto adiposo viene
digerito dalla collagenasi I (Sigma Aldrich, St Louis, MO, USA) a 37 C per 60
minuti. Poi lenzima viene neutralizzato aggiungendo un intero medium di coltura
cellulare e ci che si ottiene viene centrifugato a 700g per 10 minuti per eliminare
leccesso di tessuto adiposo. La sospensione cellulare ricavata viene centrifugata a
700g per 10 minuti. Il pellet cellulare viene sospeso in 10 ml di soluzione salina
(Lonza, Milan, Italy), centrifugato a 700g per 5 minuti, lavato e sospeso in terreno
DMEM-F12 (Dulbeccos Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12,
GIBCO) addizionato di FBS (Fetal Bovine Serum) al 10%, penicillina e
streptomicina 10.000 U/ml, coltivate in fiasca T75 (Falcon BD, Franklin Lakes, NJ)
e con cambio di terreno ogni due o tre giorni. Le colture cellulari vengono allestite
ad una densit di semina pari a 5.000 cellule/cm2. Le cellule sono state incubate a
37 C in ambiente umidificato al 5% di CO2.
Dopo lisolamento il fenotipo staminale delle hASC garantito da analisi al
citometro a flusso (FCA) per gli antigeni di superficie positivi CD13, CD29, CD44,
CD73, CD90, CD105, CD166 e negativi CD14, CD34, CD45 come visto in
letteratura (Manfrini M, 2013) (Fortini C, 2014). Inoltre le colture sono state testate
e risultate negative per micoplasmi, batteri, lieviti, funghi, HIV-1, epatite B ed
epatite C.
Al secondo passaggio le hASCs sono state assegnate in maniera randomizzata a tre
diversi gruppi: il primo rappresentato dalle cellule mesenchimali cresciute in
monostrato in 24 pozzetti con polistirene (TCPS, Tissue Culture Polystyrene) e
funge da controllo negativo; vi sono, poi, le hASCs cresciute in un terreno
osteogenico (OM, osteogenic medium) e infine le hASCs cresciute a contatto con
il biomateriale Coll/Pro Osteon 200. Il medium di differenziamento osteogenico
(Poietics human ADSCs-osteogenesis medium, Lonza, Milano) costituito da
desametasone, L-glutammina, ascorbato, penicillina/streptomicina, MCGS
(Mesengial cell growth supplement) e -glicorolfosfato. Affinch il medium
osteogenico agisse correttamente, le hASCs sono state seminate in well da 24
pozzetti ad una densit di 10.000 cellule per cm2 in 1 ml, come da protocollo. Le
cellule cos piastrate sono state incubate in ambiente umidificato a 37 C con il 5%
di CO2 ed il terreno stato scartato o sostituito ogni due giorni. Daltra parte, il
gruppo messo a contatto con il biomateriale prevede che questultimo venga
adagiato in ogni pozzetto come precedentemente descritto; in seguito la
sospensione cellulare contenente 5x105 cellule viene depositata sul biomateriale.
Questo viene coperto da una quantit minima (1 ml) di terreno di coltura al fine di
massimizzare la probabilit di interazione cellula-scaffold. La sospensione cellulare
stata agitata ogni 15 minuti, per 2 h; le piastre sono state incubate a 37C in
ambiente umidificato (5% di CO2). In base agli esperimenti condotti, le colture di
hASC cresciute a contatto con il biomateriale vengono utilizzate dopo 3, 6, 9, 21,
40 giorni con cambio del terreno di coltura ogni due giorni.

Isolamento dellRNA

LRNA totale stato isolato dalle colture cellulari cresciute a contatto con il
biomateriale per 3 e 9 giorni (I gruppo sperimentale). Colture di controllo cresciute
in plastica per 3 e 9 giorni (TCPS) sono impiegate come controlli della gene
expression (II gruppo sperimentale) (Barbanti Brodano G, 2012). LRNA totale
viene estratto anche da colture cellulari condizionate con terreno osteogenico per 3
e per 9 giorni (III gruppo sperimentale).
Dopo aver tripsinizzato le cellule si trasferisce tutta la soluzione contenente le
cellule in una falcon da 15 ml lavorando in ghiaccio aggiungendo 1 ml di Trizol e
lasciando 5 minuti in incubazione.
Successivamente si aliquotano circa 200 l di cloroformio nella falcon mescolando
le provette per 15 secondi, infine si centrifuga a 4C a 12.000 rpm per 15 minuti.
Al termine della centrifugazione saranno visibili tre diverse fasi, una fase inferiore
rosa costituita dal fenolo-cloroformio, una intermedia costituita da DNA e proteine
ed infine una fase superiore acquosa trasparente di RNA, che verr quasi
interamente prelevato (sar circa il 60% del volume di Trizol usato) e nella quale
saranno aggiunti 0,5 ml di isopropanolo freddo; il tutto viene, poi, lasciato ad
incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
Al termine dellincubazione si effettua unulteriore centrifugazione sempre a 4C a
12.000 rpm per 10 minuti cos da ottenere un pellet di RNA sul fondo
delleppendorf simile ad un gel e, una volta eliminato il surnatante per inversione,
viene aggiunto 1 ml di etanolo al 75% freddo, e centrifugato a 4C a 7500 rpm per
7 minuti, al termine viene eliminato il surnatante e leppendorf viene lasciata ad
asciugare per poi procedere con la risospensione dellRNA ottenuto. LRNA viene
risospeso in 60 l di H2O con dietilpolicarbonato (DEPC). LRNA stato estratto
con DNAsi per eliminare eventuali tracce di DNA. Qualit e quantit di RNA sono
stati valutati utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop (ND-1000, NanoDrop
Technologies, Wilmington, DE, USA). Tutti gli RNA sono stati conservati a -80C
fino al momento dellanalisi.

Retrotrascrizione
La retro-trascrizione consiste nella sintesi di una molecola di DNA (chiamata
cDNA, DNA complementare) a partire da RNA. Lenzima che catalizza questa
particolare reazione viene chiamato trascrittasi inversa, e consiste in una particolare
DNA polimerasi che utilizza come filamento stampo una molecola di RNA
(Andrew D. L. Nelson, 2015). Lenzima trascrittasi inversa per catalizzare la sintesi
di una catena di cDNA complementare allRNA, oltre allRNA stampo necessita di
deossiribonucleotidi trifosfati (dNTPs), primer, una soluzione tampone e Mg2+. I
primer, che costituiscono gli inneschi per lenzima, possono essere di due tipi:
Random Examer Primer, cio sequenze oligonucleotidiche di 6 basi, che legano in
maniera casuale le molecole dellRNA, o Oligonucleotide Primer Di Poli-T, cio
sequenze oligonucleotidiche costituite da basi timina, che legano la coda poli-A
dellRNA.
Questa tecnica molto utilizzata in biologia molecolare perch permette di
convertire lmRNA in cDNA, molecola molto pi stabile e meno sensibile ai
processi di degradazione. Il cDNA specifico per un gene si diversifica dal
corrispettivo DNA perch privo di introni.
Durante la reazione di retrotrascrizione i primer si legano alle specifiche sequenze
complementari di RNA per venir poi estesi dallenzima, formando un composto
ibrido dato da un filamento di cDNA e uno di RNA. Il composto pu essere
utilizzato direttamente nella reazione di real-time PCR, per determinare la quantit
relativa di specifici trascritti.
LRNA estratto, come descritto sopra, viene retrotrascritto mediante KIT
Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis Stem (ThermoFisher SCIENTIFIC,
Waltham, MA USA). Si esegue una reazione di pre-RT utilizzando 0,5-1 g di
RNA addizionato a 1 l di random hexamers e 7 l di acqua DEPC, in modo da
ottenere un volume finale di 10 l. La mix cos ottenuta verr sottoposta a 70C per
10 minuti in termociclatore.
Al termine della pre-RT, al prodotto ottenuto verranno aggiunti 4 l di Buffer 5X,
4 l di MgCl2 25mM, 1l di dNTPs 10 mM e 1l di Retrotrascrittasi inversa (RT)
in modo da ottenere un volume finale di 20 l che a sua volta verr sottoposto a
retrotrascrizione in un termociclatore mediante un eteroterma che prevede 42C per
1 ora e 70C per 15 minuti, al termine della quale lRNA inserito allinizio della
reazione sar retrotrascritto in cDNA. I cDNA cos ottenuti sono saggiati in Real
Time PCR e PCR Array.

Il sistema RT2 Profiler PCR Arrays (Qiagen, Maryland, USA) ha permesso di

analizzare lespressione di 84 geni per la matrice extracellulare umana (ECM), le
molecole di adesione cellulare e 5 geni costitutivi al terzo e al nono giorno. La PCR
stata realizzata utilizzando il metodo SYBR Green su CFX96 Touch PCR
detection system (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Il metodo SYBR Green utilizza
una molecola fluorescente non specifica che si lega al solco minore del DNA, una
metodica semplice, non costosa e non specifica in quanto la molecola fluorescente
si lega random a tutte le doppie eliche, includendo i dimeri di primers. Per questo
necessario ottimizzare la metodica per evitare la formazione di prodotti aspecifici.
Per quanto riguarda le variazioni dellespressione genica, queste sono state
calcolate utilizzando il metodo 2-CT dove i geni costitutivi usati come controlli
sono fondamentali per normalizzare i risultati. (DA SPIEGARE METODO
DELTA_DELTA CT). Vengono realizzati i due esperimenti simultaneamente e
valori positivi indicano geni individuali up-regolati mentre valori negativi indicano
i geni down-regolati, paragonati ai controlli. Solo una doppia espressione up o
down-regolata considerata significativa, mentre un unico cambiamento significa
che lo stesso valore dei geni analizzati viene espresso nelle cellule a contatto con il
biomateriale quando paragonato alle cellule cresciute in TCPS, ovvero il controllo.

Real-Time PCR

La reazione di polimerizzazione a catena (PCR) in real time stata eseguita

mediante CFX96 TouchReal-Time PCR Detection System (Bio-Rad)
impiegando SYBR Green come sonda fluorescente (FastStart DNA Master SYBR
Green I, Roche Applied Science). La master mix (2x) usata per la reazione
composta da: sonda fluorescente, hot-start polymerase, miscela di nucleotidi
(dNTPs) e buffer di amplificazione contenente MgCL2. Alla reazione vengono
adddizionati i primers (100 M) corrispondenti al gene che si vuole amplificare. In
tale metodica la fluorescenza molto stabile, solo il 6% dellattivit viene persa
nellarco di 30 cicli di amplificazione. Allinizio del processo di amplificazione il
DNA denaturato, quindi presente come singola elica. Il colorante, ancora libero
in soluzione, produce un minimo segnale di fluorescenza percepito come
background e sottratto automaticamente dal software di analisi. Il segnale
fluorescente rilevato al termine di ogni ciclo, quando lestensione completata ed
una quantit sempre maggiore di SYBR Green si lega al prodotto sintetizzato. La
reazione monitorata in tempo reale e linizio della crescita esponenziale del
prodotto di amplificazione corrisponde al ciclo soglia, ossia al ciclo in cui diviene
possibile rilevare una quantit di fluorescenza relativa (relative fluorescence units=
RFU) rispetto al background (baseline). La relazione tra ciclo soglia e
concentrazione di templato quindi proporzionalmente inversa. Lattendibilit dei
dati ottenuti tramite PCR real time valutata mediante lanalisi della curva di
melting. Essa generata dalla rilevazione dei valori di intensit di fluorescenza
acquisiti continuativamente durante il ciclo di melting. Il ciclo di melting consiste
in incrementi graduali della temperatura, partendo dal valore della T di annealing
fino a 95C. In tale intervallo di temperature si verifica la fusione (melting) del
prodotto di amplificazione con la liberazione del fluorocromo in esso intercalato
che da origine al picco di melting (-dF/dT). Ogni prodotto ha una sua specifica
temperatura di melting, pertanto la presenza di un singolo picco nella curva di
melting indica lassenza di prodotti aspecifici. Ciascun cDNA (1 l) stato
amplificato e il corrispondente ciclo soglia stato riferito ad una curva standard. Il
gene, GAPDH, stato usato come riferimento per normalizzare i dati della real time
PCR, i quali sono stati espressi come ratio di cDNA analizzato e cDNA di
riferimento. Di seguito vengono elencate le sequenze dei geni analizzati (mRNA).

Gene Primer sequence (5-3)

GAPDH F: CAATGAATACGGCTACAGCAAC
(gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi) R: TTACTCCTTGGAGGCCATGT

SP7 F: AGAGATCTGAGCTGGGTAGAGG
(Fattore di trascrizione SP7 o Osterix) R: AAGAGAGAGCCTGGCAAGAGG

OSTEONECTINA F: GCGGGACTGGCTCAAGAAC
R: GATCTTCTTCACCCGCAGCTT

CLEC3B F: GGGGGCCTACCTCCTCCTCT
(C-Type Lectin Domain Family 3 Member R: ACGCTCTGGCGCAGGTACTC
B)
ALP F: AGTGCCAGAGAAAGAG
(Fosfatasi alcalina) R: ACTTGTCCATCTCCAG

SPP1 F: AACAAGAGACCCTTGC
(Osteopontina) R: TCTACATCATCAGAGTGG

SOX9 F: CGTTCAGAAGTCTCCA
(SRY-Box 9) R: CAGCAAGAACACAAGCC

COL1A1 F: CCCTCTGGAAATGCT
(Collagen Type I Alpha 1 Chain) R: GGACCAACTTCACCA

CHAD F: TATTGGTAAGGGCGAG
(Chondroadherin) R: GGCAGATACCTGGAG

Elenco dei geni esaminati in Real Time Rt-PCR

Array geni coinvolti nellosteogenesi a 21 e 40 giorni??

Markers osteogenici

Attivit della Fosfatasi Alcalina (ALP): le hASCs dei tre gruppi (TCPS,
biomateriale e terreno osteogenico) sono state analizzate in merito allattivit di
ALP in tre diversi momenti: al terzo, al nono e al ventunesimo giorno. Nei tre tempi
di analisi le cellule sono state lavate con soluzione salina di PBS e fissate usando
parafolmaldeide al 4% per 2 minuti. Le colture sono state sottoposte a colorazione
istochimica con un kit per la rivelazione della fosfatasi alcalina (Alkaline
Phosphatase Detection Kit, Catalog No. SCR004 Millipore). Dopo aver aspirato il
fissativo le cellule sono state coperte con Rinse Buffer 1X (TBST: 20 mM Tris-
HCl, pH 7.4, 0,15M NaCl, 0,05% Tween-20) e successivamente le cellule sono
state messe in contatto con una soluzione colorante costituita da acqua distillata,
Fast Red Violet solution (0,8 g/L Part No. 90239) e Naphthol AS-BI phosphate
solution (4mg/mL) in AMPD buffer (2 mol/L), pH 9.5 (Part No. 90234) in un
rapporto 2:1:1 (Fast Red Violet, Naphthol e acqua) per 15 al buio. Al termine
dellincubazione il colorante stato rimosso e le cellule coperte con Rinse Buffer
1x osservate poi al microscopio.

Potenziale di biomineralizzazione: le hASCs dei tre gruppi sono state, poi,

analizzate in tre diversi tempi (3, 9 e 21 giorni) per la mineralizzazione della matrice
sottoponendo le colture a colorazione istochimica con Alizarina Red (Alizarina Red
S, C.I. 58005; Alizarina Red; Alizarin Sodium monosulfonate. Sigma-Aldrich
USA) in grado di evidenziare i depositi di fosfato di calcio presenti a livello delle
colture a 3, 9 e 21 giorni.
Il terreno di coltura stato scartato e le cellule sono state lavate con PBS 1X,
successivamente sono state fissate con formalina al 10% per 10 a temperatura
ambiente, al termine della quale il fissativo stato rimosso e le cellule sono state
lasciate 30 con una soluzione all1% di alizarina red in acqua distillata con
idrossido di ammonio 0,5 N (Sigma, 318612) a pH 4,1.
Al termine di questultima incubazione le cellule sono state lavate con acqua
distillata ed osservate al microscopio (Nikon Eclipspe TE 2000-E; Nikon
Instruments Spa, Sesto Fiorentino, Italy) (Manfrini M, 2013).

Immunocitochimica di pFAK in hASC

FAK (Focal Adhesion Kinase) una proteina che si visto essere implicata nel
meccanismo di adesione cellulare e osteogenesi (M.J.P Biggs, 2010). Sulla base di
questo, le cellule entrate in contatto con il biomateriale sono state testate mediante
saggio di immunocitochimica. Le cellule sono state private del terreno di coltura,
lavate con PBS 1X e fissate con parafolmaldeide al 4% per 20 a temperatura
ambiente. Si proceduto, poi, allaggiunta dellanticorpo primario (pFAK Tyr-397-
R, Rabbit-Polyclonal IgG, Santa Cruz Biotechnology) per 1 h a 37C, al termine
della quale le cellule sono state lavate con PBS 1X aggiungendo poi lanticorpo
secondario (Goat anti-rabbit IgG-TR, Texas Red Conjugated, Santa Cruz
Biotechnology) diluito 1:50 in PBS/0,1% BSA. Successivamente i nuclei sono stati
evidenziati con il colorante DAPI 4,6-diamidin-2-fenilindolo (0,5 g/ml) ed i
vetrini sono stati adesi a vetrini coprioggetto per la visione al microscopio a
fluorescenza (TE2000E Nikon s.p.a., Florence, Italy). Le immagini sono state
ottenute mediante il software ACT-1 ed ACT-2 per la fotocamera digitale
DXMI200F (Nikon s.p.a., Florence, Italy).

Microscopia Elettronica a Scansione (SEM)

Per lanalisi al SEM le hASCs (104 cellule/pozzetto) sono state coltivate sugli
scaffolds per 3 giorni (Manfrini M, 2013). Le cellule adese al biomateriale sono
state lavate con PBS 1X e fissate per 1 ora in glutaraldeide al 2,5% in tampone
fosfato e poi per 4 ore con una soluzione di osmio 1% in tampone fosfato. I
campioni sono stati rivestiti con oro colloidale e analizzati utilizzando la
microscopia elettronica a scansione (SEM, Cambridge UK, modello S-Stereoscan
360).
Analisi al SEM a 40 giorni ?

Analisi della vitalit cellulare e della morfologia citoscheletrica

Le hASCs (104 cellule) sono state seminate a contatto con il biomateriale Coll/Pro
Osteon 200 per valutare linfluenza dello scaffold sulla vitalit e proliferazione
cellulare e sullorganizzazione citoscheletrica.
Identificazione delle hASCs: al fine di valutare la citocompatibilit e la corretta
crescita delle cellule a contatto con il biomateriale, le cellule sono state infettate
con un adenovirus legante una GFP per consentire, dopo lavvenuta infezione, di
visualizzare la morfologia cellulare delle cellule mediante microscopia a
fluorescenza dopo 3 giorni di crescita a contatto con il biomateriale. Ladenovirus
stato conservato a -80C e scongelato in ghiaccio, le cellule precedentemente
coltivate su vetrini allinterno di well da 6 pozzetti sono state lavate con PBS 1X e
successivamente messe in contatto con 6 l di virus. Linoculo stato lasciato
overnight in incubatore a 37C, 5% di CO2 e ambiente umidificato; il giorno dopo
stato cambiato il terreno. Dopo linfezione le cellule sono state lasciate in
incubazione per 24-48 ore, si poi proceduto con il colorante nucleare DAPI 4,6-
diamidin-2-fenilindolo ed il vetrino con le cellule adese stato riposto su vetrino
per la visione al microscopio a fluorescenza.
Imaging confocale: per valutare linfluenza del biomateriale sulla morfologia
cellulare dopo 3 giorni di crescita a contatto con Coll/Pro Osteon 200 le colture
sono state colorate mediante Rodamina al fine di evidenziarne la morfologia. Il
terreno di coltura stato rimosso e le cellule lavate per tre volte con PBS 1X,
successivamente fissate con formalina al 10% e incubate 2 ore al buio. Al termine
della fissazione il fissativo stato eliminato e le cellule reidratate con acqua
distillata per 5. Si proceduto, poi, con laggiunta della Rodamina B al 2% in
acqua per soluzioni iniettabili e lasciato a contatto con le cellule per 1 ora, al termine
della quale il colorante stato prelevato e scartato procedendo poi con i diversi
lavaggi, sempre con PBS 1X, al fine di eliminare leccesso di colorante presente a
livello delle cellule e del pozzetto di coltura. Successivamente le cellule sono state
messe a contatto con il colorante nucleare DAPI 4,6-diamidin-2-fenilindolo ed il
vetrino con le cellule adese stato riposto su vetrino per la visione al microscopio
ottico.
Analisi di vitalit cellulare: le hASCs sono state caricate sul biomateriale in piastre
di coltura da 24 pozzetti e coltivate come precedentemente descritto. Il test
impiegato quello dellAlamarBlue per analizzare la vitalit cellulare delle cellule
a contatto con il biomateriale confrontate con le colture di controllo rappresentate
da cellule coltivate in TCPS (Manfrini M, 2013). Il terreno di coltura stato
rimosso, ogni campione lavato con PBS 1X ed stato aggiunto 1 ml di terreno
fresco con il 5% AlamarBlue per ciascun pozzetto. Il campione stato incubato per
2,5 ore a 37C, 5% di CO2. Lattivit metabolica cellulare stata rilevata misurando
la fluorescenza a = 590 nm (eccitazione = 540 nm).
Organizzazione del citoscheletro: per valutare linfluenza del biomateriale
sullorganizzazione del citoscheletro delle hASCs, le colture cellulari, dopo 3
giorni, sono state colorate mediante Falloidina-TRITC al fine di evidenziarne i
filamenti di actina. Le cellule, coltivate su vetrino e presenti allinterno di una well
da 6 pozzetti, sono state lavate con PBS 1X per 20 a temperatura ambiente.
Successivamente le cellule sono state sottoposte a permeabilizzazione mediante
TRITON X-100 (0.5% W/v in PBS 1X) per 10 e poi lavate con PBS 1X, incubate
con Falloidina-TRITC (1g/ml) per 1 ora a 37C al buio. Al termine della
colorazione si proceduto alla colorazione dei nuclei cellulari mediante DAPI 4,6-
diamidin-2-fenilindolo (0,5 g/ml). I vetrini vengono fatti aderire a vetrini
coprioggetto per la visione al microscopio a fluorescenza (TE2000E Nikon s.p.a.,
Florence, Italy). Le immagini sono state ottenute mediante il software ACT-1 e
ACT-2 per la fotocamera digitale DXMI200F, Nikon s.p.a., Florence, Italy).
Risultati
MORFOLOGIA CELLULARE DELLE hASC

Mediante luso di un microscopio a fluorescenza (Nikon TE2000) stato possibile

Morfologia
valutare cellulare delle
la morfologia hASC di cellule umane staminali derivate da tessuto
di colture
adiposo
Mediante(hASC)
luso dicresciute a contatto
un microscopio con il biomateriale
a fluorescenza per 3 giorni.
(Nikon TE2000) statoLepossibile
colture
valutare la morfologia di colture di cellule umane staminali derivate da tessuto
cellulari sono morfologicamente valutate mediante la colorazione con rodamina
adiposo (hASC) cresciute a contatto con il biomateriale per 3 giorni. Le colture
ed eGFP sono
cellulari comemorfologicamente
descritto in materiali e metodi
valutate (Figura
mediante 1). La morfologia
la colorazione cellulare
con rodamina ed
eGFPhASC
della comedescritto
coerente in con
materiali e metodi.
il fenotipo delleLacellule
morfologia
stesse,cellulare
la quale delle
nonhASC
risulta
coerente con il fenotipo delle cellule stesse, la quale non risulta alterata dalla
alterata
traduzionedalla traduzione
della eGFP, in della
accordoeGFP,
con inla accordo con
letteratura la letteratura
(Ripoll, 2009) e dal[101] e dal
contatto
con il biomateriale
contatto in esame.in esame.
con il biomateriale

Figura 1. Morfologia cellulare delle colture primarie staminali ottenute da

FIGURA 1 Morfologia cellulare delle colture primarie staminali ottenuto da
tessuto adiposo(hASC)
tessuto adiposo (hASC)coltivate
coltivate assieme
assieme al biomateriale
al biomateriale per 3 giorni. 1A.
per 3 giorni
Visualizzazione al microscopio
1a: Visualizzazione ottico
al microscopio della
ottico dellecolture
colturehASC.
hASC 1B. Colorazione con
rodamina delle colture hASC. 1C. Colture primarie di hASC infettate con virus
1b: Colorazione con Rodamina delle colture hASC
recante eGFP e visualizzate con microscopio a fluorescenza (Nikon TE2000).
1c: Colture primarie di hASC infettate con virus recante eGFP e visualizzate con
microscopio a fluorescenza (Nikon TE2000)

Citometria a flusso e Analisi di microscopia elettronica a scansione (SEM)

I markers delle cellule staminali adipose umane (hASC) sono stati valutati usando
lanalisi di citometria a flusso (FCA) per specifici antigeni di superficie. I profili
degli antigeni di superficie sono appaiati con markers noti, in accordo con le linee
guida della Societ Internazionale per la Terapia Cellulare (Dominici M, 2006). Il
livello di purezza delle hASC nei campioni analizzati >95% nei confronti
dellespressione di CD13, CD44, CD73 e CD90, mentre CD29 era espresso per il
90%. Lanalisi del fenotipo conferma che le hASCs risultano negative per i markers
ematopoietici (CD34 e CD45) e macrofagici (CD14) (Figura 1).
53
Lanalisi al SEM (microscopio elettronico a scansione) stata effettuata come da
protocollo, sul materiale Avitene Microfibrillar Collagen Hemostat, sui granuli
di ProOsteon 200 e sul biomateriale composto dai due elementi di collagene e
derivato di idrossiapatite con e senza le hASC.

Dallanalisi si evidenzia la struttura del ProOsteon 200 granulare, in cui

apprezzabile la struttura cavernosa e altamente porosa. I pori hanno una grandezza
che varia tra i 190 e i 230 microns. (Figura 3 a, 3 b).

LAvitene appare come fibrille di collagene disorganizzate. Si nota infatti una

struttura ampiamente irregolare e disordinata, con strutture fibrillari che si
intrecciano in modo casuale e con andamento microstrutturale a loop e a turning
back. Queste caratteristiche microstrutturali indicano unorganizzazione non
uniforme (Figura 3 c, 3 d).

In figura 3 e, 3 f si evidenzia il biomateriale assemblato, costituito da collagene

Avitene microfibrillar collagen hemostat e granuli di ProOsteon 200, in cui
presente unampia interazione tra al componente fibrillare e la granulare dei due
elementi. Sono visibili cellule hASC cresciute a contatto con il biomateriale, in cui
si evidenziano ampi prolungamenti citoplasmatici e corpi cellulari a diretto contatto
con la superficie. Le cellule coltivate sugli scaffold dimostrano una corretta
morfologia e sembrano essere ben attaccate al substrato con pseudopodi di contatto
della matrice extracellulare (Figura 3 g, 3 h)
Espressione genica della matrice umana extracellulare e delle molecole di
adesione

Con esperimenti di Real-Time PCR Super Array si amplificano 84 geni implicati

nella adesione cellula-cellula e cellula-matrice extracellulare ai fini di valutare la
capacit osteoinduttiva del biomateriale in esame. A tal fine vengono coltivate le
cellule hASC a contatto con il biomateriale e a contatto con la plastica di coltura
(TCPS) per 3 e per 9 giorni. LmRNA estratto dalle colture citate viene saggiato
con il saggio array per lespressione di molecole mediatrici del legame cellula-
cellula e cellula-matrice extracellulare.

In tabella 1 e in figura 4a e 4b si evidenziano che alcuni geni sono up e down regolati

in hASC cresciute a contatto con il biomateriale per 3 e per 9 giorni, quando
confrontate con le stesse cresciute sulla plastica. Si evidenzia, infatti, la down
regolazione di geni per alcune molecole quali integrine (es. ITGA4, ITGA6),
molecole che mediano ladesione cellula-matrice, quali ad esempio SGCE e
VCAN. Interessante notare lup-regolazione dei geni che codificano per integrine
come lIntegrina alpha M (ITGAM o CD11b), Integrina alpha-3 (ITGA3) e
Integrina beta 5 (ITGB5). stato evidenziato che laumento delle integrine indica
un ruolo fondamentale di queste per un adeguato sviluppo, funzione e rigenerazione
del tessuto osseo (Docheva D, 2014) (Yang W, 2014) (Lane NE, 2005). Le proteine
della matrice extracellulare, come le proteine collagene COL6A2, COL6A1 il
costituente della membrana basale LAMA2 sono up-regolate al giorno 3, mentre
LAMB3 up-regolata al giorno 9. La differente espressione genica evidente per
queste laminine, come LAMA2 e LAMB3, che sono comunque entrambe up-
regolate. Le laminine sono un gruppo di proteine che regolano la crescita cellulare,
la motilit cellulare e ladesione delle cellule tra loro (Lavrijsen IC, 2014). Queste
sono anche implicate nella formazione e nellorganizzazione delle membrane
basali, strutture sottili che separano e supportano le cellule in diversi tessuti. La
formazione ossea un complesso processo che include diversi eventi cellulari e
molecolari, come la deposizione della matrice del collagene 6 e un gran numero di
proteine extracellulari non collagene che porteranno, poi, alla mineralizzazione
della matrice (Izu Y, 2016) (Sun Z, 2013).

I geni down-regolati sono quelli coinvolti nelladesione cellula-cellula, come CDHI

al giorno 3, la molecola di integrina ITGA2 (giorno 9), e CNTN (giorno 9), e il
componente della matrice extracellulare della membrana basale LAMA3 (giorno
9). Linibitore della metalloproteinasi KAL1 (giorno 3) e la metalloproteinasi
MMP3 (giorno 9) sono down-regolati. Le MMPS (metalloproteinasi della matrice)
sono le maggiori proteasi che prendono parte alla regolazione della matrice
extracellulare: partecipano alla formazione del tessuto osteoide, sono ricche in
collagene e in altri proteoglicani della matrice. Inoltre prendono parte alla
formazione dei pro-osteoclasti, degli osteoclasti e degli osteoblasti. MMP3 pu,
poi, attivare le altre MMPs che sono in grado di degradare diverse proteine come le
proteine che legano la cartilagine, la fibronectina e il collagene di tipo IV, VII, IX
e XI (Kobayashi A, 2007) (Mamehara A, 2010).

Lattivit della fosfatasi alcalina (ALP), un marcatore precoce dellosteogenesi,

stato valutato nelle hASC cresciute a contatto con lo scaffold, con il terreno
osteogenico e con TCP. Tale attivit enzimatica stata studiata al giorno 3, 9 e 21.
 Log 2 Fold
Days Fold change
change
Type of molecules Gene post- (respect to
(respect to
seeding TCPS)
TCPS)
Cell adhesion molecules
cell-matrix adhesion
(integrins)
ITGAM 3 9.3 3.2
ITGA3 3 6.1 2.6
ITGB5 3 2.2 1.2
ITGA2 9 -2.9 -1.5
transmembrane molecules
SELE 3 2.5 1.3
cell-cell adhesion
CDH1 3 -3.2 -1.7

Extracellular Matrix
(ECM) proteins
Basement Membrane
Constituents
LAMA2 3 5.9 2.6
LAMB3 9 2 1
LAMA3 9 -2.4 -1.2
Collagens and ECM
Structural Constituents
COL6A2 3 2.8 1.5
COL6A1 3 2.5 1.3
ECM -Metalloproteases
MMP3 9 -3.3 -1.7
ECM Metalloproteases
Inibitors
KAL1 3 -4.3 -2.1
Osteoblast differentiation
and ossification molecules
SPP1 3 2.00 1
CLEC3B 3 -6.8 -2.7
CLEC3B 9 3.6 1.8
other adhesion molecules
CNTN1 9 -2.9 -1.5

Lattivit enzimatica della proteina osteogenica fosfatasi alcalina pu essere

misurata con il reagente naftolo AS-BI fosfato. Lattivit enzimatiche della proteina
osteogenica evidenziata, infatti, dalla sua capacit di metabolizzare il reagente
naftolo. Se tale reagente metabolizzato, un substrato cromogeno (fast-red) viene
evidenziato in rosso. Dalla colorazione rossa si evidenzia la corretta corrispondenza
dellattivit enzimatica di ALP. Nelle cellule cresciute con il biomateriale e in
presenza del medium osteogenico stato osservato un significativo aumento
dellattivit di ALP al 9 e al 21 giorno. Il biomateriale ha favorito la
mineralizzazione della matrice pi precocemente rispetto alle cellule cresciute nel
terreno osteogenico a 3 giorni. Inoltre i depositi di calcio si possono osservare
chiaramente nelle cellule coltivate sullo scaffold fino al 21 giorno.
infine le cellule staminali cresciute a contatto con il biomateriale, le colture cellulari
di controllo TCPS e le colture cresciute con il terreno osteogenico sono state
sottoposte a colorazione con Alizarina Red al fine di evidenziare i depositi di fosfato
di calcio a livello cellulare a 3, 9 e 21 giorni di coltura. Nelle cellule di controllo,
nei vari tempi analizzati, si osserva un modesto aumento del deposito di sali di
calcio. Le cellule staminali, cresciute a contatto con il biomateriale evidenziano
invece un importante aumento del deposito di sali di calcio a 9 e 21 giorni (vedi
figura). Nelle cellule di controllo positivo, ovvero cresciute in terreno osteogenico,
si osserva un elevato deposito di sali di calcio.
Saggio di vitalit cellulare, proliferazione e architettura citoscheletrica

Le cellule hASC, cresciute sul biomateriale, sono state analizzate per la loro
vitalit, proliferazione e organizzazione citoscheletrica al giorno 3 e al giorno 9.
Per valutare la vitalit cellulare stata eseguita unanalisi della morfologia delle
hASC cresciute a contatto con lo scaffold usando il microscopio ottico e a
fluorescenza (Fig. 6 a-d)
Le cellule hASC, che esprimono la GFP (Green Fluorescent Protein), cresciute a
contatto con il biomateriale mostrano una normale morfologia cellulare, in accordo
con la letteratura (Ripoll, 2009) (Fig 6a). Il biomateriale mostra biocompatibilit,
al giorno 3 e al giorno 9, in termini di adesione cellulare e proliferazione in questo
modello in vitro: la morfologia cellulare delle cellule hASC-eGFP indistinguibile
rispetto alle cellule hASC originarie. Una simile morfologia stata osservata con il
microscopio confocale tra le cellule macchiate con Rodamina al giorno 9 ((Fig. 6b).
Inoltre la vitalit cellulare dimostra che il materiale non causa effetti citotossici,
sebbene questo induca differenti cinetiche di crescite cellulare.

Le cellule hASC cresciute a contatto con il biomateriale per 3 giorni sono state
sottoposte a colorazione con falloidina-TRITC e osservate al microscopio a
fluorescenza Nikon TE2000 (Fig. 6c-d). da tale analisi emersa unevidenza di
architettura citoscheletrica ben organizzata ed integra. Le fibre di actina sono ben
visibili e regolarmente collegate alla membrana plasmatica, non visibile alcuna
perdita o alterazione strutturale.

Come evidenza al possibile ruolo del biomateriale sulladesione cellulare, stata

verificata lespressione della proteina pFAK Tyr397 (Phosphorylated Focal
Adhesion Kinase) nelle cellule hASCS coltivate a contatto con il biomateriale in
esame. Limmuno-localizzazione di pFAK, fosforilata nella posizione tirosina (Tyr
397), resa possibile grazie ad unanalisi di immunocitochimica fluorescente che
prevede luso di un anticorpo policlonale specifico per la forma fosforilata della
proteina FAK. Lespressione di pFAK stata, quindi, osservata sulle colture di
hASC cresciute a contatto con il biomateriale per 3 giorni e su cellule cresciute sulla
plastica (TCPS). Entrambi i gruppi sperimentali evidenziano unomogenea
distribuzione citoplasmatica della proteina pFAK e unattivazione della proteina
per quanto riguarda ladesione cellulare.

questo evento molecolare induce una risposta cellulare che porta lla sopravvivenza,
alla proliferazione e alla differenziazione cellulare. Inoltre pFAK gioca un ruolo
centrale nelladesione presente e nella crescita di fattori coinvolti direttamente
nellattivit trascrizionale di Runx2, nellespressione genica specifica degli
osteoblasti e nella mineralizzazione della matrice (Manfrini M, 2013) (Xu J, 2015).

stato eseguito il test di vitalit cellulare Alamar Blue su hASC coltivate a contatto
con il biomateriale a 3, 6, 9 giorni di coltura rispettivamente t1, t2, t3.

Dal grafico si evidenzia un aumento esponenziale della vitalit cellulare delle hASC
cresciute su TCPS e cresciute sul biomateriale per tutto il tempo dellesperimento.
Dallanalisi si evidenzia un aumento del metabolismo cellulare delle hASC
cresciute sul biomateriale anche se inferiore al gruppo di controllo. Il metabolismo
delle hASC al t3 statisticamente superiore rispetto al metabolismo osservato al t1
(p<0,05), con un incremento del 50%. Il metabolismo delle hASC al t3
statisticamente inferiore al metabolismo delle cellule di controllo al medesimo
tempo (p<0,05).