3 Spettrofotometria di assorbimento UV-VIS

SKOOG et al. Cap.2(2C), Cap.6(tutto), Cap.7(7A,7B,7C,7D,7E,7F,7G), Cap.13(13A, 13B,13C,13D),

Cap.14(14A,14B,14C,14D,14E)

3.1.Introduzione.
- Spettrofotometria di assorbimento molecolare:
a) UV-VIS,
b)IR
-Spettroscopia di fluorescenza molecolare
- Spettroscopia atomica:
a) Assorbimento atomico
b) Emissione atomica
c) Fluorescenza dei raggi X
Definizioni.
Energia radiante(E): energia della radiazione. Si misura in J, Kcal, erg, n fotoni.
Potenza radiante(P) (o flusso radiante) : P=dE/dt . Si misura in watt(w), 1w =1J/s
Intensit della radiazione (I):

I metodi spettroscopici studiano linterazione della radiazione luminosa con le sostanze.

TRANSIZIONI: ELETTRONICHE VIBRAZIONALI ROTAZIONALI

METODI IN ASSORBIMENTO;
METODI IN EMISSIONE.

Spettro di assorbimento.
Insieme delle radiazioni assorbite dalla sostanza, opportunamente eccitata, ordinate in funzione della
lunghezza donda ().
atomi (e ioni) isolati (es. in fase gassosa);
specie molecolari (e ioni idratati) (es. in soluzione).

SPECIE ATOMICHE. Lassorbimento da parte di atomi (ottenibili allo stato di vapore) da luogo ad uno spettro
costituito da assorbimenti discreti (spettro a righe). Per le transizioni dallo stato fondamentale o ad uno
stato eccitatoi (oi), le frequenze delle radiazioni assorbite sono definite dallequazione:
i =(Ei-Eo) / h = c/i
3-1
dove: Eo=energia elettronica dello stato fondamentale, Ei=energia elettronica degli stati eccitati,
i=frequenza, i=lunghezza donda, c=velocit della luce, h=costante di Planck.

Le transizioni coinvolte riguardano stati elettronici e comprendono lintervallo UV-VIS.

SPECIE MOLECOLARI. Lassorbimento di radiazioni da parte di molecole da origine ad assorbimenti che

coinvolgono stati elettronici , vibrazionali e rotazionali,. In tal modo si hanno assorbimenti discreti molto
ravvicinati, che costituiscono delle bande (spettro a bande).

Spettrofotometria di assorbimento molecolare: studio delle radiazioni assorbite da specie molecolari

(prevalentemente in soluzione).
Assorbimento di composti organici:
- Transizioni * :cadono nella regione dell'UV lontano, detta anche UV sotto vuoto
- Transizioni *.: sono ipiche dei composti insaturi e comprendono la transizione E (o etilenica) di sistemi
isolati; la transizione B (o benzenoide) di anelli benzenici, la transizione K (o di coniugazione) di sistemi
aromatici o coniugati. Tanto pi estesa la delocalizzazione, tanto maggiore la lunghezza d'onda di
assorbimento e l'intensit della banda
non molto intensa perch proibita dalle regole di selezione
- Transizioni n-* e n-* :sono transizioni di tipo R(o radicalico) che coinvolgono eteroatomi con doppietti di
non legame. Non molto intense perch proibite dalle regole di selezione
- Transizioni per trasferimento di carica: sono dovute a veri e propri spostamenti di elettroni
I composti aromatici sostituiti presentano bande di questo tipo che cadono nell'intervallo 220-370 nm.

3-2
Assorbimento di composti di coordinazione.
Mostrano le bande di assorbimento dei leganti insieme all'assorbimento caratteristico dei metalli di transizione
(che hanno orbitali d) o dei lantanidi (che hanno orbitali f).
- Transizioni d-d o f-f:
- Transizioni d-d
- Transizioni per trasferimento di carica:
Lassorbimento per trasferimento di carica avviene in un complesso in cui esiste un donatore di
elettroni e degli accettori

La risoluzione di uno spettro dipende dallo stato fisico della sostanza. In figura sono riportati degli spettri della
1,2,4,5-tetrazina.

Spettro di emissione.
Insieme delle radiazioni emesse dalla sostanza, opportunamente eccitata, separate in funzione della
lunghezza donda ().
Le radiazioni che una specie pu emettere sono le stesse che in grado di assorbire.
Leccitazione da parte di atomi pu avvenire con vari sistemi: fiamma,arco elettrico, scintilla, sistemi a plasma,
ecc..
3-3
Spettroscopia di emissione atomica: studio delle radiazioni emesse da atomi.
Lemissione di radiazioni di specie molecolari eccitate con radiazioni UV-VIS, si chiama fluorescenza ( o
fosforescenza, se lo stato eccitato permane anche quando termina la radiazione eccitatrice).

Spettroscopia di fluorescenza molecolare (o spettrofluorimetria): studio delle radiazioni emesse da specie

molecolari (in soluzione).

Nel presente capitolo si studier la SPETTROFOTOMETRIA DI ASSORBIMENTO MOLECOLARE UV-VIS.

3.2. Legge di Lambert-Beer.

LEGGE DI LAMBERT-BEER

Trasmittanza della soluzione, T=I/Io

Assorbanza della soluzione ad una lunghezza donda : A=log (Io/I) (o Estinzione).
Per una radiazione monocromatica lassorbanza di una specie assorbente in soluzione di concentrazione c :
A = l C
dove:
: coefficiente di assorbivit molare (o estinzione molare) alla lunghezza donda .
l : cammino ottico della radiazione, cio spessore della soluzione attraversata.
T = 10- l C.
Dimostrazione (solo lettura).
Sia dS la superficie infinitesima di soluzione di spessore dx. La frazione di area assorbente sar dS/S, dove S la superficie della
soluzione. La frazione dellintensit assorbita da tale strato, dIx/I, uguale alla frazione dellarea assorbente:
-dIx/I= dS/S (il segno (-) tiene conto del fatto che dIx negativo). dS risulta proporzionale al numero dn di particelle contenute nello
spessore dx : dS=K dn (K si chiama sezione trasversale di cattura).
-dIx/I= dS/S =Kdn/S
Integrando tra Io e I e tra 0 e n particelle totali della specie assorbente, contenute nella soluzione:
log(Io/I)=Kn/(2.3S). Poich il volume (in cm3) della soluzione V=S l (dove l lo spessore della soluzione attarversata dalla
radiazione) e la concentrazione molare della specie
C=n1000/(VNA) (dove NA il Numero di Avogadro), si ottiene:
log(Io/I)=KNAlC/(2.31000)
Indicando con = KNA/(2.31000), si ottiene lequazione di Lambert-Beer.

3-4
Impiego di radiazioni monocromatiche.

Misura di .
Impiego della legge di Lambert-Beer
C =A / l

= pendenza della retta.

Propriet additiva della legge di Lamber-Beer.
Data una soluzione con X1, X2, ...., XN specie assorbenti, a concentrazione C1, C2 , ....., CN e coefficienti di
assorbivit molare 1, 2, ...., N, segue:

A = 1 l C1+2 l C2+.....+N l CN.

Intervallo di concentrazione applicabile: 10-5M10-2M.

DEVIAZIONI DALLA LEGGE DI LAMBERT-BEER.

o deviazioni chimiche;
o deviazioni strumentali.

DEVIAZIONI CHIMICHE.Si verificano quando non si considerano tutte le specie assorbenti in soluzione.
Esempio: Indicatori acido base, come il rosso metile.
HIn +H2O =In- + H3O+

3-5
A = In l CIn+HIn l CHIn dove la CT la concentrazione totale dellindicatore CT=CIn+CHIn
Misure di assorbanza di soluzioni al variare del pH.

Punto isosbestico. Le curve di assorbimento si incontrano tutte in un punto, detto punto isosbestico.
Nel punto isosbestico In =HIn=I
A = In l CIn+HIn l CHIn = I l CT dove CT=CIn+CHIn
Da misure nel punto isosbestico possibile calcolare la concentrazione totale dellindicatore.
E possibile anche misurare il pH di soluzioni incognite da misure spettrofotomeriche, aggiungendo minime
concentrazioni di un indicatore.
Esempio:dissociazione: si consideri la determinazione dellacido benzoico.
C6H5COOH + H2O = C6H5COO- + H3O+
MAX=273nm MAX=268nm
MAX=970 MAX=560

Associazione: analisi dello ione bicromato:

Cr2O72- + H2O = 2 CrO42- + 2H+
MAX=350nm MAX=372nm

DEVIAZIONI STRUMENTALI. Uso di radiazioni non monocromatiche. Per 1 : I1=I0110-1l c, per 2 :

I2=I0210-2 l C
A = log[(I01+I02)/(I1+I2)] = log[(I01+I02)/( I0110-1l C + I0210-2 l C)]

3-6
Presenza di radiazioni diffuse.
Sia IP lintensit di una radiazione diffusa:
A = log[(I0+IP)/(I+IP)] . Per I0 si ha A log[(I0+IP)/(IP)]. S i ha una deviazione dalla linearit dalla legge di
Lambert-Beer.

DIPENDENZA DELLE SPETTRO DALLAMPIEZZA DELLA FENDITURA.

Ampiezza della fenditura,w,
Ampiezza di banda passante e:

SCELTA DELLA LUNGHEZZA DONDA DI MISURA

ERRORE NELLA MISURA DELLASSORBANZA.

dC
Errore relativo della concentrazione per unit di trasmittanza ()
CdT
A=0.20.8 per avere il minimo errore sulla determinazione della concentrazione.

Dimostrazione (solo lettura).

A=l C, ln(Io/I)=(/ln10)l C , lnT=- (/ln10) l C. Differenziando: dT/T=-(/ln10) l dc. Poich -(/ln10) l =lnT/C, si ha: dT/T=lnTdC/C.
Quindi lerrore relativo sulla concentrazione dC/C dato da: dC/C=dT/TlnT. Landamento della funzione dC/C/dT in funzione di T
mostrato nella figura seguente:

3-7
3.3. Componenti di uno spettrofotometro UV-VIS

SORGENTE MONOCROMATORE CELLA PORTACAMPIONE RIVELATORE

SORGENTE.
Lampada ad arco di Xenon (a scarica di gas).
E una lampada ad alta potenza radiante (80-450 w).
: 200nm 1300nm.

Per coprire tutto lintervallo UV-VIS si utilizzano due lampade, a D2 e a tungsteno, oppure una sola lampada a
Xenon.
Lampada a H2 o D2 (con finestra di quarzo)( =180nm 375nm) insieme ad una lampada a filamento di
Tungsteno(W) (o a W/alogeno) (=350nm 950nm).

SELETTORE DI LUNGHEZZA DONDA O MONOCROMATORE.

Filtri.
Prisma.

3-8
Reticolo di diffrazione.
Reticolo in trasmissione

Dimensione tipica del reticolo :(55)cm , con N=1500-2000 righe/mm

Reticolo in riflessione.

Parametri strumentali del monocromatore.

f = distanza focale dello specchio

Dispersione lineare DL= dy/d
Dispersione lineare reciproca .DL-1= d/dy .Si esprime in (nm/mm)
Un monocromatore presenta un valori di DL-1 pari a 20 nm/mm.per un valore di lunghezza donda della
radiazione 0, si ha:

3-9
DL-1= d/dy=e/w
In genere e =0.2-2 nm e w=0.5-2mm.
Potere risolutivo (R).
Capacit del monocromatore di separare due radiazioni che differiscono di .Si pu esprimere:
- . Esempio: =0.1 nm
- R= / . In genere si fissa =300 nm. In genere R=103-105 .
R=mN , dove m lordine della frangia di diffrazione ed N il numero di righe per mm.

Due picchi sono considerati risolti quando lintensit nella zona di sovrapposizione il 10% dellintensit
massima del picco.

CELLE DI MISURA

RIVELATORI
Tubo fotomoltiplicatore.
E il rivelatore pi utilizzato. Si sviluppa dal fototubo
3-10
Il catodo costituito da strati successivi di miscele di metalli alcalini ((KNaCsSb, CsSb) e ossidi di metalli
alcalini Cs2O/CsSb, BeO, GaP, CsSb.

Rivelatore multicanale a serie di diodi (diode array detector, DAD)

Un insieme di fotodiodi (circa 500) costituisce un rivelatore a serie di fotodiodi;ogni singolo fotodiodo pu
misurare lintensit in un intervallo spettrale di 1-2 nm.

3-11
Per strumenti portatili, ove non richiesta una elevata accurateza, si utilizza la cella fotovoltaica oppure il
rivelatore a fotoconducibilit

TIPI DI SPETTROFOTOMETRI UV-VIS

- a singolo raggio;
- a doppio raggio;
- multicanale.
Spettrofotometro a doppio raggio.

Spettrofotometro multicanale con rivelatore a serie di diodi (DAD).

Il segnale S proporzionale al numero di misure N (S=KN), mentre il rumore R proporzionale a (N) (cio
S=KN ).

3.4. Metodi di analisi quantitativa.

(v. Potenziometria I, per alcuni richiami sulla validazione di un metodo analitico)
Metodo della curva di taratura (o di calibrazione)
Metodo delle aggiunte standard.
Titolazioni spettrofotometriche.
Analisi multicomponente: i componenti della soluzione sono determinati simultaneamente da misure di
assorbanza a varie lunghezze donda, senza effettuare una separazione.

3-12
METODO DELLA CURVA DI CALIBRAZIONE

La concentrazione cx si ottiene per per interpolazione lineare.

METODO DELLE AGGIUNTE STANDARD

In generale si pu scrivere Y=K C (dove K= A e K= l ).
A = l C= l (CXVX+CSVS)/VTOT (dove VTOT=VX+VS)
Estrapolando la retta per AVTOT0, si ha :
CXVX+CSVC=0 CX= - CSVC/VX

3.5 Determinazioni spettrofotometriche

Analisi di specie assorbenti.
Benzene 204 nm
Chetoni 282 nm
Azo-composti 340 nm
Esempio.
Determinazione di NO3- nelle acque potabili.
Misura a 202 nm. Il limite di legge per le acque potabili 50 mg/l.

3-13
CX=A/=0.431/0.141=3.06 mg/l di NO3-

Analisi di specie non assorbenti.

Si utilizza un reagente specifico R che produce con la sostanza da determinare X un composto che
assorbente P:
X + R P
La quantit di P prodotta direttamente proporzionale alla concentrazione di X.

DETERMINAZIONE DEGLI CATIONI (v. Cap. Eser_1)

DETERMINAZIONE DEGLI ANIONI (v. Cap. Eser_1)

3.6.Analisi Multicomponente.
Lassorbanza di una soluzione contenente pi di una specie assorbente mostra la propriet delladditivit. Nel
caso di due specie assorbenti 1 e 2 .
A = 1l C1+2l C2

Da misure di assorbanza a varie lunghezze donda possibile determinare la concentrazione di 1 (C1) e di

Y(C2), simultaneamente, da misure sulla stessa soluzione (cio senza effettuare una separazione chimica. In
tal caso bastano due equazioni ( cio due lunghezze donda 1: 1 e 2:2).
Ponendo per semplicit l=1 cm, si considera il sistema di equazioni:
A1 = 11 C1+12C2
A2 = 21 C1+22C2
I valori di 11 e 21 si ottengono da misure di assorbanza in soluzioni a concentrazione nota di 1 (dalla
=A/(lC)); analogamente per i coefficienti 12 e 22. Risolvendo:

3-14
E si chiama determinante dei coefficienti di estinzione molare.
Affinch il sistema ammetta una soluzione deve essere E>0 (altrimenti le espressioni di C1 e di C2 tendono
allinfinito). Ci significa che :
11 22 > 12 12 , quindi 11 > 12 e 22 > 12 .
Le lunghezze donda 1 e 2 devono essere scelte in modo da soddisfare tali criteri.
Esempio.
Determinazione simultanea di Cr e di Mn in un acciaio inossidabile.
Una quantit nota di acciaio si tratta con H2SO4 conc. e successivamente con HNO3 conc. Il Cr3+ ed il Mn2+
vengono ossidati rispettivamente a Cr2O72- e MnO4-.
Il Cr3+ si ossida con persolfato di ammonio (in presenza di Ag+ come catalizzatore):
2Cr3++3S2O82- + 7H2O Cr2O72- + 6SO42- +14H+
Il Mn2+ viene ossidato con periodato di potassio (la reazione con persolfato di ammonio lenta):
2Mn2++5IO4- + 3H2O 2MnO4- + 5IO3- +6H+

Assumendo con 1= 440 nm e con 2=525 nm, si ha:

A1 = 1Cr CCr+1MnCMn
A2 = 2Cr CCr+2MnCMn
Preparata una soluzione di Cr2O72- 1.008 mM si misura lassorbanza a 440 nm: A1=0.440. Da cui
1Cr=0.440/(1.008 10-3)=436.5
Per una soluzione 0.2248 mM di MnO4-, si misura A2=0.480:
1Mn=0.480/(0.2248 10-3)=2135.2
Sostituendo tali valori nel sistema si ottengono le concentrazioni dei delle specie incognite.
Per avere una valutazione piu accurata occorre utilizzare un numero maggiore di lunghezze donda.
A1=11c1+12c2
A2=21c1+22c2
A3=31c1+32c2

An=n1c1+n2c2

3-15
La retta passante (y=ax+b) per n punti sperimentale ( xi ,yi ) si ottiene con il metodo dei minimi quadrati,
minimizzando la funzione U (scarto quadratico medio):
U=( yi a xi -b)2
La condizione di minimo e la risoluzione del sistema:

Nel caso in questione:

U=i(Ai -i1c1-i2c2)2

Risolvendo il sistema, si ottengono le due equazioni:

ii12 c1+i i1i2c2=iAii1
ii1i2 c1+ii22 c2=iAii2
Valutando il determinante D del sistema, si ha;

Si osserva che il determinante D si ottiene dal determinante della matrice dei coefficienti E. Infatti si verifica
che
D=ET E
dove ET rappresenta la matric eche si ottiene dalla matrice E, scambiando le righe con le colonne (matrice
trasposta).

SCELTA DELLE LUNGHEZZE DONDA.

Comesi detto nel paragrafo precedente il valore del determinante E deve essere il pi alto possibile e quindi
anche di D. Quindi il numero ed il valore delle lunghezze donda si selezionano in modo da avere il piu
alto valore di D

Nellesercitazione di laboratorio si analizzer una miscela di acido acetilsalicilico e vitamina C, che

rappresenta un prodotto analgesico commerciale.

3-16
3.7. Titolazioni spettrofotometriche.
Il punto finale viene individuato dalla variazione di assorbanza ad una fissata lunghezza donda di una specie
che partecipano alla reazione.

Titolazione acido-base.
E possibile misurare la forma colorata dellindicatore, in modo strumentale. Nel caso della titolazione
dellacido benzoico con NaOH, utilizzando come indicatore il Blu di Bromotimolo, viraggio gialloblu (=615
nm). Misurando lassorbanza a 615 nm:
A = l C= l (CXV0+CTVT)/VTOT
Si valuta lassorbanza corretta A, definita come A=(A VTOT) / V0 :
A= l (CX+(CT /V0)VT)
Dal grafico dellassorbanza corretta in funzione del volume di titolante, per estrapolando per A0 si ottiene il
punto equivalente, Vpe

Titolazione complessometrica.
La determinazione di minime quantit di Fe(III) ( 10-50 g) si possono effettuare mediante titolazione con
EDTA, impiegando come indicatore lacido salicilico. Il complesso (Fe-Salicilato) assorbe a 525 nm. Misurando
lassorbanza corretta A della soluzione in funzione del volume di titolante, si determina il punto finale per
estrapolazione.

3-17
Titolazione redox.
Le titolazioni che impiegano il permanganato come reattivo titolante (es. determinazione di Fe 3+) possono
essere seguite misurando lassorbanza del MnO4- nel massimo a =545nm. Nella cerimetria possibile
misurare lassorbanza dello ione Ce4+ a 325 nm.Le curve che si ottengono in ambedue i casi sono simili a
quella riportata sotto:

La misura dellassorbanza di una soluzione durante la titolazione si pu effettuare pi comodamente

attraverso limpiego di un elettrodo con fibra ottica, in quanto il volume di una cella di misura posizionata nello
spettrofotometro ha un volume troppo piccolo per contenere la soluzione di titolando. La fibra ottica costituita
da una fibra cava di silice pura di dimensione 0.1-1 mm. Una fibra costituita da una parte interna di silice
(anima) ed una guaina che lavvolge. Il tutto racchiuso in un materiale di supporto.

Lindice di rifrazione del materiale dellanima maggiore di quello della guaina. Il sensore per misurare
lassorbanza direttamente nella soluzione costituito da due fibre ottiche: la prima trasporta la radiazione nella
soluzione, mentre la seconda raccoglie la luce che ha attraversato uno spessore di soluzione ed stata
riflessa da uno specchio posto allestremit della sonda.

3.8. Turbidimetria e Nefelometria.

Metodi di analisi che si basano sulla diffusione di radiazioni da parte di sospensioni colloidali (in soluzione, ma
anche in fase gassosa). Quando la radiazione incidente viene diffusa senza variazione della lunghezza donda
3-18
si verifica la diffusione elastica o di Rayleigh (a differenza della diffusione anelastica o Raman in cui si
registrano radiazioni con lunghezze donda differenti da quella incidente).

Indicando con r il raggio delle particelle e con la polarizzabilit della molecola la radiazione diffusa I
rispetto alla direzione che forma un angolo rispetto alla radiazione indidente :

La lunghezza donda di diffusione per alcuni sistemi :

- sospensioni (r15 m): = 10m (IR)
- colloidi (r1 m): = 0.5m (VIS)
- sospensioni (r0.002 m) : = 0.001m (raggi X)
Sperimentalmente si osserva che:
I / I0 =exp(- b) (: coefficiente di torbidit, b: cammino ottico).
Il coefficiente di torbidit dipende dalla concentrazione delle particelle disperse. Se 10-2cm-1 si applica la
turbidimetria, invece la nefelometria si impiega quando <10-2cm-1.
Di solito si impiega una lunghezza donda compresa tra 400-600 nm.
Applicazioni.
Determinazione di Cl-.
Formazione di una sospensione di AgCl(s)., per aggiunta di una soluzione di AgNO3.
Determinazione di SO42-.
Formazione di BaSO4(s), per aggiunta di una soluzione di BaCl2.
Determinazione nefelometrica della torbidit delle acque.
Si utilizza una sospensione di formazina, che si ottiene mescolando il solfato di idrazina (N2H4 H2SO4) con
esametilentetrammina ((CH2)6N4)).
Scala NTU ( Nefelometric Turbidimetric Unit:unit nefelometrica di torbidit):
1 unit NTU= soluzione contenente una sospensione formata da 0.05 g/l N2H4 H2SO4+ 0.5 g/l CH2)6N4.

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