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Fermentazioni Industriali

Nel corso della storia dell’uomo, numerosi processi di fermentazione sono stati
praticati come arte soprattutto in campo alimentare: la produzione del vino risale a
diecimila anni prima di Cristo e gli egiziani producevano birra già 7000-8000 anni
fa. Analogamente, la produzione di pane, di formaggio, di bevande e di
medicamenti ha sempre coinvolto, più o meno consapevolmente, biofermentazioni.

Si è soliti far risalire la nascita delle moderne biotecnologie al XVII secolo, quando
Antoine van Leeuwenhoek osservò per primo le cellule di lievito esaminando gocce
di birra fermentata grazie ad un rudimentale microscopio.

Solo nella prima metà del secolo scorso (1836-37) i ricercatori Cagniard -Latour ,
Schwann e Kutzing giunsero contemporaneamente a stabilire la natura vivente del
lievito: questa scoperta, per allora assolutamente azzardata, venne severamente
ridicolizzata da altri famosi scienziati dell’epoca, tra i quali Berzelius , Wholer e lo
stesso von Liebig.

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Nel 1847 un professore di fisica, Blondeau , determinò che funghi diversi fossero
responsabili di fermentazioni diverse.

Qualche anno più tardi, Louis Pasteur (1822-1895) arrivò a concludere che le
cellule viventi del lievito producono la fermentazione dello zucchero ad alcool e
anidride carbonica in ambiente anaerobico.

Nel 1870 lo stesso Pasteur, con altri colleghi ricercatori, sperimentò l’effetto
antibiotico di alcuni microrganismi, giungendo anche a prevederne il possibile
impiego a scopo terapeutico.

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Si fa invece risalire al medico Robert Koch (1843 - 1910) la messa a punto di
metodiche per la produzione di colture pure e metodi batteriologici classici, ancora
oggi utilizzati.

Robert Koch definì i criteri per determinare se uno specifico agente infettivo sia
effettivamente responsabile di una patologia:
• l’agente deve essere presente in tutti i casi della malattia;
• deve essere isolato e cresciuto in vitro;
• la malattia si deve riprodurre inoculando una coltura pura dell’agente infettivo
all’interno di un organismo sano;
• il medesimo agente infettivo deve essere recuperato dall’organismo
sperimentalmente infettato.

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Produzione di antibiotici: la
penicillina
S

La struttura di base della penicillina è la R CO NH CH CH C(CH3)2

molecola dell’acido 6- C N CHCOOH

amminopenicillanico (6-APA), ottenuto O


anelloβ-lattame
lattameanello
anello tiazolidina
da un anello di tiazolidina condensato
con un b- lattame . In assenza di Pen G CH2 CO
particolari precursori, nel mezzo di
acido fenilacetico
fermentazione si ottiene una miscela di
penicilline naturali che si distinguono
Pen V O CH2 CO
sulla base della natura del gruppo R-CO-
acido fenossiacetico
e delle quali due solo hanno importanza
terapeutica: Pen G, che va assunta Pen O H2C CH CH2 S CH2 CO
parenteralmente, e Pen V, che va acido allilmercaptoacetico
assunta oralmente.

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Per circa cinquant’anni dopo che Pasteur intuì il potenziale utilizzo terapeutico
dell’azione antibiotica di alcuni microrganismi, furono sperimentati diversi
preparati microbici senza successo.

Solo nel 1928, presso il St. Mary’s Hospital di Londra, Alexander Fleming (1881
- 1955) osservò, in modo del tutto fortuito e casuale, che quando la muffa
Penicillium notatum contamina colture di Staphilococcus aureus ne inibisce la
crescita, uccidendo di fatto tutti i batteri.

Fleming verificò il potentissimo effetto antibatterico della muffa nei confronti di


numerosi microrganismi, anche patogeni, e chiamò il principio attivo penicillina,
ma non riuscì ad isolarlo e a purificarlo.

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Nel 1938 Chain e Florey ripresero, alla Sir William Dunn School of Pathology di
Oxford, le ricerche di Fleming e, lavorando a bassa temperatura e in condizioni
di pH neutro, separarono un prodotto che, nonostante fosse ancora ricco di
impurezze, manifestava elevatissime proprietà antibiotiche in vivo nel topo.

Infatti, di otto topi infettati con Streptococcus haemoliticus , quattro furono


trattati con quel prodotto e non morirono, a differenza degli altri quattro che
non sopravvissero più di 24 ore.

Ernst Chain e Howard Florey


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Tre anni più tardi, nel 1941, venne curato un poliziotto londinese affetto da
setticemia: l’uomo riuscì a sopravvivere finché ci fu abbastanza penicillina per
poterlo curare; in realtà, nel prodotto usato a scopo terapeutico, il principio
attivo costitutiva il solo 1%, mentre il 99% erano impurezze tra le quali,
fortunatamente, nessuna sostanza tossica che potesse mascherare l’atossicità
della penicillina.

Questa colonia di Penicillium notatum è stata fatta crescere


nel laboratorio di Alexander Fleming

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Il coinvolgimento dell’Inghilterra nella II Guerra Mondiale costrinse Florey ed i suoi
collaboratori a rivolgersi alle industrie americane per poter dare luogo alla
realizzazione su scala industriale del processo di produzione della penicillina;
ampio fu l’interesse dimostrato da numerose aziende d’oltreoceano ( Merck, Pfizer,
Squibb) e da centri di ricerca quale il Northern Regional Research Laboratory di
Peoria .

Inizialmente, grande attenzione fu rivolta alla possibile sintesi chimica, relegando il


processo fermentativo alle necessità strettamente connesse ai test clinici.
Ma le enormi difficoltà di sintesi da un lato, e le pressioni del War Production
Board dall’altro, permisero di intensificare ogni sforzo nella direzione di reperire, al
più presto, un processo di produzione per via fermentativa che consentisse
forniture di penicillina adeguate alle richieste belliche.

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Il problema principale incontrato, tipico del resto della maggior parte dei
bioprocessi, era legato alla minima quantità di prodotto utile a fronte della
necessità di impiegare reattori e colture di volume enorme, con conseguenti
difficoltà nelle operazioni di separazione e di purificazione: nel 1939 la
concentrazione di penicillina nel brodo di coltura era di 0.001 g/L.

I ricercatori del NRRL individuarono un mezzo di fermentazione a base di lattosio


che consentì di incrementare di 10 volte la produttività; contemporaneamente
vennero isolati altri ceppi di Penicillium (p. es., P. chrysogenum) più efficienti ed in
grado di tollerare l’applicazione in colture sommerse anziché nei tradizionali “bottle
plant”.

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Il primo impianto fu realizzato dalla Pfizer in meno di sei mesi; era costituito di
14 fermentatori da circa 32.000 litri ciascuno: reattori di dimensioni
gigantesche, che ponevano grossissimi problemi in termini di sterilità, di
agitazione, di fornitura d’aria e di controllo termico.

I successivi progressi nel campo delle fermentazioni e l’isolamento di sempre


migliori ceppi di muffa hanno permesso di arrivare a concentrazioni di principio
attivo dell’ordine dei 50 g/L.

E’ importante evidenziare come questo processo, in virtù della sua novità


intrinseca rispetto ai tradizionali processi della chimica industriale, abbia
richiesto, nella realizzazione, l’interfacciamento tra figure professionali diverse:
il microbiologo, il medico, il chimico e l’ingegnere di processo, le cui
competenze confluirono in una nuova figura, quella dell’ingegnere biochimico.

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La penicillina viene attualmente prodotta in fermentatori di capacità variabile
tra i 100 e i 250 litri; la composizione di un tipico brodo di coltura è la
seguente:

acqua di macerazione del mais 70 grammi


CaCO3 7 grammi
olio di lardo o di soia 50 grammi
lattosio 90 grammi
glucosio 5 grammi
(NH4)2SO4 7 grammi
Na2SO4 5 grammi
MgSO4·7H 2O 1 grammo
acido fenilacetico 0.5 grammi
acqua q.b. 1 litro

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Durante la parte iniziale del processo
fermentativo il microrganismo utilizza il
carbonio del glucosio e quello estratto
dall’acqua di macerazione del mais oltre
alla ammoniaca libera; poi avviene
l’attacco degli amminoacidi che sono
deamminati con rilascio di ammoniaca e
conseguente innalzamento del pH del
mezzo di crescita. In questa fase (1-2
giorni) il microrganismo cresce senza
produrre penicillina.

Quando sono esaurite le altre fonti di


carbonio, ha inizio l’attacco del lattosio
con rallentamento della crescita e con
inizio della produzione di penicillina (fino
al 6°-7° giorno); infine, quando il
lattosio è consumato, si arresta la
produzione di penicillina e il pH aumenta
fino a circa pH 8.

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Dunque il glucosio è utilizzato nella fase di crescita, mentre il lattosio è idrolizzato
a glucosio e galattosio lentamente: è la lenta disponibilità di glucosio che
determina le condizioni di produzione della penicillina.

I grassi vengono impiegati sia come antischiuma che come sorgente di carbonio;
l’acido fenilacetico funge da precursore della catena laterale, tenendo presente che
in quantità eccessiva può essere tossico.

A fine fermentazione, la coltura viene filtrata, raffreddata a 0-5°C e acidificata con


acido solforico a pH 2.4; si estrae con solvente e si separa per centrifugazione la
fase organica. Dalla fase organica la penicillina viene nuovamente trasferita in fase
acquosa per trattamento con NaOH a pH 7.5.

A seguito di un ulteriore passaggio acido/base si ottiene penicillina pura dopo


liofilizzazione e cristallizzazione.

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Fermentatore da circa 1000 litri Testa del fermentatore
e modulo di controllo

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Produzione di aspartame
L’aspartame è un dolcificante sintetico con potere dolcificante 200 volte
superiore a quello del comune zucchero. Chimicamente l’aspartame è l’estere
metilico di un dipeptide ottenuto per condensazione tra l’acido aspartico e la
fenilalanina.

O O

H2N CH C NH CH C OCH3

CH2 CH2

COOH

Acido L-aspartico
L’acido L-aspartico viene ottenuto quasi interamente per biotrasformazione da
acido fumarico; normalmente all’interno delle cellule questo amminoacido è
prodotto a partire da acido ossalacetico per azione dell’enzima transamminasi
che sfrutta l’acido glutammico come donatore di amminogruppi .

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In alcuni batteri l’acido aspartico può formarsi per addizione di ammoniaca
all’acido fumarico: questa reazione è catalizzata dall’enzima aspartato
ammoniacaliasi (AAL).

COOH COOH

CH AAL CH2

CH NH3 H C NH2

COOH COOH

Produzione di acido L-
L-aspartico
aspartico da acido fumarico

Utilizzando microrganismi del genere Pseudomonas o Bacillus è possibile


ottenere rese molto elevate in amminoacido (oltre il 90%).

L’acido aspartico può infine essere ottenuto da zucchero per fermentazione,


secondo un processo che non è però competitivo con quello di
biotrasformazione.

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Fenilalanina
Questo amminoacido può essere prodotto in vari modi: per fermentazione
diretta da zuccheri mediante mutanti di Brevibacterium o attraverso
biotrasformazione da acido trans -cinnamico o da acido fenilpiruvico. Entrambi
questi composti possono essere sintetizzati in maniera relativamente semplice.

NH2
NH3
(A) CH CH COOH CH2 CH COOH
PAL

(B) COOH COOH

C O CH NH2
trans-amminasi
CH2 CH2

glutammato chetoglutarato

Reazione di produzione della fenilalanina a partire da acido


trans--cinnamico (A) e da acido fenilpiruvico (B)
trans (B)..

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La reazione di conversione dell’acido trans -cinnamico a fenilalanina è catalizzata
dall’enzima L-fenilalanina ammoniacaliasi (PAL) in presenza di NH3; l’enzima PAL
è presente nelle cellule del lievito Rhodotorula glutinis: viene indotto dalla
fenilalanina ed è espresso dal glucosio.

Nelle condizioni operative si forma rapidamente: dopo 20-30 ore di coltura il PAL
raggiunge il massimo livello di concentrazione e le cellule, raccolte mediante
centrifugazione, sono incubate in presenza di acido cinnamico e ammoniaca.

La resa finale in fenilalanina dipende dalla concentrazione di NH3 (che non può
essere particolarmente elevata) e dal pH (± 10): nelle migliori condizioni, si
ottengono rese di conversione dell’ordine del 70÷ 80% in tempi brevi (15-20 ore).
La reazione di produzione della fenilalanina a partire da acido fenilpiruvico
coinvolge l’enzima transamminasi e richiede la presenza di un amminoacido -NH2
donatore.
La transamminasi è un enzima assai diffuso e può essere ricavato, ad esempio,
dallo stesso Escherichia coli. Si deve operare in condizioni di pH≈ 7 in assenza di
NH3.

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Sintesi dell’aspartame
Come è stato già detto, la sintesi dell’aspartame a partire dai due amminoacidi
costituenti può avvenire per via chimica, per via enzimatica, per
biotrasformazione:

• la sintesi chimica è un metodo attualmente molto impiegato, nonostante le


difficoltà intrinseche;
• la sintesi enzimatica sfrutta un enzima (proteasi) molto diffuso nei
microrganismi e consente rese di circa 70÷80%;

• il processo per biofermentazione non è attualmente molto impiegato a causa


delle rese non elevate, ma si prevede che possa conoscere una rapida
estensione in tempi brevi, sia per effetto delle più moderne strategie di
immobilizzazione enzimatica, sia per le metodologie del DNA ricombinante che
consentono di ottenere organismi mutanti di maggiore produttività.

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Produzione di birra
La produzione di birra è un tipico processo dell’industria alimentare che fa uso di
reazioni di fermentazione; diverse sono le fasi di lavorazione, di seguito elencate e
brevemente descritte.

Maltatura: l’orzo, dopo essere stato sottoposto ad un efficace lavaggio, viene


fatto macerare per alcuni giorni, durante i quali i chicchi sani assorbono acqua
rigonfiandosi, mentre quelli avariati vengono separati e recuperati per mangime
ad uso animale; i chicchi sani vengono lasciati germinare a 15-20°C per una-due
settimane, promuovendo la formazione di alcuni enzimi ( proteasi, α- e β-amilasi).

Il malto verde ottenuto dopo degerminazione (eliminazione dei prodotti oleosi che
potrebbero agire, nelle fasi successive, da antischiuma ), viene essiccato a 40-80°C
finché il contenuto in umidità scende a valori prossimi al 4%; in ragione
dell’essiccamento, il processo di idrolisi dei polisaccaridi viene accelerato
inizialmente, mentre poi si assiste alla progressiva inattivazione degli enzimi.

Per produrre birra scura, a questo punto del processo il malto viene torrefatto a
circa 100°C per caramellizzare gli zuccheri.

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Saccarificazione: in questa fase, detta anche ammostatura , si prepara il mosto,
inviando il malto macinato in caldaia dove viene mescolato con acqua e farina di
cereali crudi. In questa fase proteine e carboidrati vengono idrolizzati per
consentire la successiva azione di alcuni lieviti; d’altro canto, l’idrolisi totale deve
essere evitata perché sono proprio alcuni peptidi, peptoni e destrine che
determinano l’aroma ed il corpo della birra. Così si devono operare cicli di
riscaldamento controllati, tra i 40 e gli 80°C, ottimizzando l’azione degli enzimi.
A temperature medie (± 60°C) si favorisce l’azione degli enzimi che producono
zuccheri fermentabili responsabili del grado alcolico della birra, mentre a
temperature più elevate si ottengono birre di minor grado.
Alla fine di questa fase, il mosto (a 65-75°C) viene chiarificato mediante filtrazione
ed il residuo viene esaurito con acqua calda.

Decozione: in questa fase, dopo aver aggiunto luppolo, il mosto viene cotto,
portandolo per alcune ore ad ebollizione; così facendo, si ottiene la sterilizzazione,
la concentrazione e la aromatizzazione per dissoluzione dei principi contenuti nel
luppolo. Si tratta di una fase fondamentale per caratterizzare il sapore, la
limpidezza e l’aroma della birra. Alla fine, dopo aver separato i residui del luppolo,
si raffredda a 5-6°C e si ossigena per poi passare alla fase fermentativa.

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Fermentazione: una volta raffreddato, il mosto viene inoculato con lievito
Saccharomyces cerevisiae o carlsbergensis , dando luogo a fermentazione
alta o bassa , a seconda che il lievito si disponga nella parte alta o bassa del
fermentatore. Nel primo caso, la temperatura è di circa 10-25°C ed il tempo
di fermentazione è di 2-5 giorni; nel secondo caso, la temperatura è più
bassa (5-10°C) e la durata varia da una a due settimane.

Durante questa fase, condotta in tini chiusi, si genera CO2 che può essere
recuperata per le fasi successive di confezionamento, allo scopo di
proteggere la birra dall’azione dell’aria.

Alla prima parte (tumultuosa) della fermentazione, segue una lenta


stagionatura in botti chiuse, a pressione controllata per favorire la
saturazione della birra in CO2. Anche la stagionatura può essere alta o
bassa: nel primo caso dura fino a venti giorni a 10°C, nel secondo dura
anche tre mesi a 0°C. Durante questo lungo periodo, alla birra può essere
aggiunta qualche sostanza stabilizzante e tensioattiva, al fine di rendere più
persistente la schiuma, e possono essere addizionate proteasi che,
insolubilizzando la parte proteica, ne impediscono la coagulazione e la
precipitazione con conseguente intorbidimento del prodotto.

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malto e cereali vaglio filtro
trebbie
H2O

saccarificazione

decoizione
maltatura
caldaia caldaia
sedimentatore

CO2 inoculo
residuo
filtro a
piatti
H2O
serbatoio di
6 °C 95 °C
maturazione fermentatore

residuo

birra Crescita cellulare - 4 25


Produzione di etanolo
La produzione di etanolo come combustibile, praticata già durante la II Guerra
Mondiale, venne accantonata data la disponibilità di petrolio a basso costo; il
rinato interesse verso questa tecnologia ha cominciato a manifestarsi verso gli
anni ‘70, in ragione di alcune caratteristiche dell’etanolo:

• è liquido e facilmente trasportabile;


• ha un potere calorifico elevato;
• può essere addizionato alla benzina tradizionale fino al 10% senza
richiedere modifiche ai motori a scoppio;
• incrementa il numero di ottani della benzina senza piombo.

Le materie prime dai cui prende origine il processo di fermentazione per la


produzione di etanolo possono essere le più varie: dagli zuccheri alle sostanze
amidacee, dai residui delle lavorazioni agricole agli scarichi urbani ed industriali.

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È evidente che la scelta delle materie prime condiziona l’economia del processo
ma ne determina anche la resa finale; attualmente le più convenienti risultano
essere le materie prime di origine ligneo-cellulosica e amidacea, per cui si sta
puntando ad una metodologia di idrolisi della cellulosa e dell’amido per fornire
ai microrganismi produttori di alcool zuccheri semplici come substrati
fermentabili .

In realtà il processo di produzione dell’etanolo richiede alcuni passaggi


intermedi che vanno valutati e discussi singolarmente.

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Raffinazione

materiale ligneo-cellulosico

idrolisi delle emicellulose xilosio,, glucosio, ...


xilosio

soluzione acida di glucosio


alcool
estrazione della lignina
lignina

de-cristallizzazione della cellulosa

idrolisi della cellulosa

residui solidi

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Idrolisi della cellulosa
Il residuo che si ottiene una volta eliminate le emicellulose viene ridotto a
polvere e sottoposto ad idrolisi chimica o enzimatica.

eso--β-1,4-
eso -1,4-cellobioidrolasi
cellobioidrolasi

eso--β-1,4-
eso -1,4-cellobioidrolasi
cellobioidrolasi β-glucosidasi
cellulosa cristallina cellobiosio glucosio
endo--β-1,4-
endo -1,4-glucanasi
glucanasi

endo--β-1,4-
endo -1,4-glucanasi
glucanasi
cellulosa amorfa
cellulosa rigonfiata
derivati solubili
eso--β-1,4-
eso -1,4-glucan
glucan--glucoidrolasi

Schema del processo di idrolisi della cellulosa:


le linee tratteggiate indicano gli effetti di inibizione.
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Liquefazione dell’amido
L’amido è costituito da due frazioni: amilosio (25%), che è un polimero dell’α-D-
glucosio, e amilopectina (75%), di composizione simile all’amilosio ma ramificata.

L’idrolisi dell’amido può essere ottenuta con acidi (a pH 2 e 120-150°C), con rese
non elevate e con prodotti di qualità non soddisfacente.
L’idrolisi enzimatica dell’amido avviene secondo lo schema di figura, ad opera di
diversi enzimi, tra i quali i più utilizzati sono α-amilasi , β-amilasi, amiloglucosidasi
(o glucoamilasi).

glucoamilasi
amilosio oligosaccaridi lineari glucosio
(veloce)

amido α-amilasi pullulanasi


glucoamilasi
glucoamilasi
amilopectina oligosaccaridi ramificati
(lenta)
isomaltosio

Schema del processo di idrolisi dell’amido

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Fermentazione
La reazione di fermentazione, mediante glicolisi, è prodotta per intervento di
diversi batteri, tra i quali i più noti sono il Saccharomyces cerevisiae e il
Kluyveromyces fragilis e segue la seguente stechiometria:

C6H12O6 2 C2H5OH + 2 CO2 +∆E

Tipicamente, il processo industriale viene condotto a lotti con melasse a


concentrazione del 15-20% di saccarosio, a pH 4.5 e a temperatura di 25-30°C
per cinquanta ore, ottenendo conversioni del 90% sul teorico, con
concentrazioni finali di etanolo di 10-16% sul volume.

Inizialmente si opera in ambiente aerobico per favorire la crescita dell’inoculo,


introdotto in forma di sospensione molto densa; successivamente, anche in
ragione della stratificazione superficiale di CO2, si conduce la fase anaerobica.

L’etanolo non è, ovviamente, l’unico prodotto della fermentazione: si


ottengono infatti anche alcoli superiori che derivano dalla trasformazione degli
amminoacidi presenti e che costituiscono il cosiddetto olio di fusello. Questa
miscela di alcoli può essere recuperata ed utilizzata come solvente. Un altro
prodotto secondario sempre presente è la glicerina.
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Il principale problema legato alla produzione di etanolo per biofermentazione di
melasse è che i microrganismi coinvolti non sono in grado di resistere a
concentrazioni di prodotto più elevate: ciò implica operazioni di separazione e
purificazione estremamente onerose. La diversa tolleranza verso l’etanolo esibita
dai microrganismi è dovuta alla maggiore o minore permeabilità della membrana
cellulare a questo alcol: maggiore è la quantità di lipidi presenti, maggiore la
permeabilità.

Key points

costo delle materie prime , che rappresenta la parte più consistente degli interi
costi del processo produttivo;

velocità di reazione, che è attualmente piuttosto lenta richiedendo l’utilizzo di


reattori di elevate dimensioni;

ottenimento di prodotti secondari di interesse;

fabbisogno energetico per distillare i prodotti ottenuti: circa il 30% del potere
calorifico dell’etanolo prodotto viene consumato per questa operazione.

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• fermentazioni a pressione ridotta, che permettono la volatilizzazione
dell’alcol man mano che si forma così da ridurne la concentrazione nel brodo di
coltura e prolungare il processo fermentativo consentendo un maggiore utilizzo di
zucchero;

• processo continuo, che oltre alla pressione ridotta prevede un riciclo delle
cellule, con conseguente aumento di produttività (anche di 12 volte) rispetto ai
processi tradizionali;

• batteri, che consentono una velocità specifica di produzione di alcol superiore a


quella dei lieviti;

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• immobilizzazione di cellule, che manifestano produttività volumetriche
decisamente superiori a quelle delle colture in sospensione;

• fermentatori continui a letto fluido, che raggiungono densità cellulari elevate


e pur richiedendo periodi di avviamento piuttosto lunghi (qualche settimana),
garantiscono poi processi continui anche per anni;

• processi modificati per il recupero dell’etanolo, come ad esempio la


compressione dei vapori, l’uso di colonne accoppiate termicamente per consentire il
recupero di calore, la disidratazione delle miscele acqua/alcol.

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etanolo 30-40%

gas terreno

fermentatore

aria

centrifuga residuo (20-40% solido)


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Trattamento biologico delle acque
In generale, i rifiuti possono essere suddivisi in tre grandi categorie:
• rifiuti industriali, che hanno caratteristiche fortemente dipendenti
dalla loro origine e sono generalmente ricchi in carbonio e poveri di
azoto;
• rifiuti domestici, il cui flusso e composizione cambiano a secondo
dall’attività umana;
• rifiuti dell’agricoltura, generalmente ricchi in carbonio per il loro
elevato contenuto in cellulosa.

Per quanto riguarda in particolare le acque di scarico, possono essere


sottoposte a trattamenti di diverso tipo: fisico-meccanico, chimico e biologico; il
trattamento biologico si distingue in:
primario, che prevede la rimozione del materiale solido sospeso;
secondario, che include l’ossidazione biologica sia aerobica (con
produzione di CO2 e H2O) che anaerobica (con formazione di CO2, CH 4
e H2S);
terziario, che permette la rimozione finale di inorganici e di organici
refrattari.

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L’acqua possiede caratteristiche fisiche, legate al colore, all’odore, al pH e alla
temperatura, al contenuto in solidi sospesi;
caratteristiche chimiche, che dipendono dal contenuto in composti organici
(carboidrati, lipidi, olii, idrocarburi, proteine da un lato e fenoli, tensioattivi, erbicidi,
pesticidi, aromatici dall’altro), in composti dell’azoto (NH 4+, NO3-), dello zolfo (SO4--,
SO3--, S, S--), del fosforo (PO4---, HPO4--, H2PO4-), in metalli pesanti (Ni ++, Pb++,
Cd++, Fe+++, Cu++, Zn++, Hg++), in gas disciolti (H2S, NH3, CH4).

Crescita cellulare - 4 37
La quantità complessiva di carbonio presente, che costituisce un indice importante
del carico inquinante dell’acqua in esame, può essere individuata attraverso due
indici:
BOD (Biological Oxygen Demand): quantità di ossigeno disciolta nell’acqua
di scarico per effetto del processo di ossidazione biologica durante un
periodo di incubazione a 20°C;

COD (Chemical Oxygen Demand): milligrammi di ossigeno richiesti dal


campione di acqua in esame quando venga sottoposto ad un trattamento
di ossidazione con una soluzione calda di dicromato di potassio.

E’ evidente che in generale, per un medesimo campione di acqua, il valore di COD


sia superiore a quello di BOD, dal momento che l’ossidazione chimica risulta
sicuramente più efficace e completa di quella biologica.

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Processo a fanghi attivi
Uno dei processi più interessanti che vengono di norma utilizzati nel trattamento
secondario delle acque di scarico, è il cosiddetto processo a fanghi attivi; esso si
avvale della presenza in uno stesso reattore di una complessa popolazione di
microrganismi che, utilizzando come substrato per la loro crescita i composti
inquinanti contenuti nell’acqua, li convertono in biomassa facilmente separabile e
in prodotti quali CO2 e H2O.

Si tratta dunque di un processo aerobico, che richiede una costante fornitura di


aria (circa 30-60 m 3 di ossigeno per Kg di BOD rimosso).

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La configurazione tipica di un impianto per fanghi attivi è analoga a quella di un
reattore CSTR con riciclo: all’interno del reattore sono collocati i microrganismi,
alcuni dei quali producono materiale gel-polimerico che ne favorisce
l’agglomerazione in fiocchi microbici.

Dal momento che la fase di adsorbimento dei composti organici sui fiocchi
microbici risulta più lenta della successiva fase di ossidazione, si può scegliere di
separare fisicamente le due operazioni, facendole avvenire in vasche distinte.

L’alimentazione può essere introdotta secondo un solo flusso in ingresso o


piuttosto in step successivi.

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(1+α)F (1-β)F Effluente
F, S 0
S, X Se, Xe charificato

Ossidazione biologica
Separatore
aerobica

(α+β) F
aria

aria

aria
Sr, Xr

Fanghi in eccesso
αF βF

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Bilancio stazionario al bioreattore (X0=0):

biomassa α ⋅ F ⋅ X r + µ ⋅V ⋅ X = (1 + α )⋅ F ⋅ X
µ ⋅V ⋅ X = (1 + α )⋅ F ⋅ X −α ⋅ F ⋅ X r

µ ⋅ F ⋅ X + (1 + α ) ⋅ F ⋅ S
1
substrato F ⋅ S 0 + α ⋅ F ⋅ Sr =
Y

Bilancio stazionario al separatore:

biomassa (1+α ) ⋅ F ⋅ X = (1 − β ) ⋅ F ⋅ X e + (α + β )⋅ F ⋅ X r
(1+ α )⋅ F ⋅ X −α ⋅ F ⋅ X r = (1− β )⋅ F ⋅ X e + β ⋅ F ⋅ X r

substrato (1+ α )⋅ F ⋅ S = (1 − β ) ⋅ F ⋅ Se + (α + β )⋅ F ⋅ Sr

Con riferimento al bilancio sulla biomassa si ha:


µ ⋅V ⋅ X = (1− β )⋅ F ⋅ X e + β ⋅ F ⋅ X r
da cui:
(1− β ) ⋅ F ⋅ X e + β ⋅ F ⋅ X r
µ = Crescita cellulare
V⋅X -4 42
(1− β ) ⋅ F ⋅ X e + β ⋅ F ⋅ X r
µ=
V⋅X
Questa espressione, che fornisce il valore della velocità specifica di crescita in
funzione delle concentrazioni della biomassa, permette di determinare il tempo di
permanenza medio:
1 V ⋅X
θ= =
µ (1 − β ) ⋅ F ⋅ X e + β ⋅ F ⋅ X r
mentre il tempo di permanenza idraulico è definito come:
V (1 − β )⋅ X e + β ⋅ X r (1− β ) ⋅ X e + β ⋅ X r
θH = = =θ ⋅
F µ⋅X X

Dalla seguente equazione stechiometrica


F ⋅ (S 0 − S ) =
1
⋅ µ ⋅ X ⋅V
Y
si ricava il volume del reattore richiesto a fronte del tempo di permanenza medio,
della portata in ingresso, del rapporto di riciclo e del valore della conversione
desiderata:

Y ⋅ F ⋅ (S0 − S ) Y ⋅ F ⋅ (S0 − S )  X 
V= =θ ⋅ = F ⋅θ ⋅ 1 + α − α r 
µ⋅ X X
Crescita cellulare - 4  X  43
In alternativa al reattore CSTR,
all’interno del quale l’agitazione è
garantita dal continuo apporto di
aria, si possono usare i filtri
percolatori (TBF, trickling bed
filter ), ovvero letti impaccati di
forma circolare costituiti da un
supporto inerte (sabbia, pietrisco,
plastica) sul quale aderiscono le
colture cellulari disponendosi
secondo un film biologico.
Sulla fase biotica viene fatta
fluire l’acqua da depurare.

Crescita cellulare - 4 44
È evidente che per favorire un ampio ed efficace contatto tra le due fasi, il
mezzo di supporto deve essere dotato di una elevata area superficiale per
unità di volume e deve possedere un elevato grado di vuoto (50%) per
permettere la libera circolazione di aria in virtù della convezione naturale,
legata alla differenza di temperatura provocate dalle stesse reazioni biologiche.

Nelle zone più interne del letto, meno accessibili all’aria, si realizzano condizioni
anaerobiche che portano alla formazione di bolle di gas, responsabili del
distacco del film che, in questo modo, si rinnova mantenendo uno spessore
ideale di circa 0.25-0.35 mm.

I residui solidi e i fanghi in eccesso provenienti dalla ossidazione biologica


vengono poi inviati ad un separatore e trattati a parte. Il loro smaltimento
costituisce un serio problema.
Nella maggior parte dei casi si ricorre ad un processo di fermentazione
anaerobica detto di digestione .

Crescita cellulare - 4 45
Questo processo, che consente di ridurre considerevolmente il volume dei fanghi e
dei residui solidi facilitandone l’eliminazione, consiste sostanzialmente di tre parti:

solubilizzazione dei composti insolubili, mediante idrolisi acida o enzimatica;

formazione di acidi volatili: i composti organici solubilizzati vengono attaccati da


batteri anaerobi facoltativi, ad una temperatura di circa 35°C ed un pH 4-6; il
prodotto principale che si ottiene è acido acetico, ma sono presenti anche acido
propionico e butirrico;

formazione di metano: i batteri metanogeni aggrediscono gli acidi volatili


trasformandoli principalmente in metano e anidride carbonica (temperatura
ideale 35-40°C, pH 7-7.8).

Il processo di fermentazione anaerobica viene condotto, in continuo o in


discontinuo, all’interno di un reattore chiamato digestore, all’interno del quale i
tempi di permanenza variano fra 10 giorni ed un mese.

Crescita cellulare - 4 46
La miscela gassosa prodotta nel
digestore prende il nome di biogas,
ed è composta da circa il 70% di metano,
da circa il 30% di anidride
carbonica e dal rimanente
di idrogeno, monossido
di carbonio e acido solfidrico.

Questa miscela gassosa può essere


usata come combustibile sia
per le necessità dell’impianto
che per uso domestico,
anche se il suo potere calorifico
è decisamente inferiore
a quello del gas naturale.

Il fango esaurito che si ottiene in uscita dal digestore ha un volume ridotto del
50-60% rispetto al volume iniziale ed ha una composizione decisamente
diversa; questo prodotto può essere dunque incenerito o sottoposto a
compostaggio per ottenere fertilizzante.
Crescita cellulare - 4 47
Single cell protein (SCP)
Come è noto, i lieviti possiedono un elevato contenuto proteico e si è perciò
ritenuto di poterli direttamente utilizzare come integratori alimentari, sia per l’uomo
che per gli animali.

Le proteine che derivano dalle colture microbiche accresciute, per questo scopo, su
substrati paraffinici sono dette proteine unicellulari o bioproteine.

Il grande problema legato a questa tecnologia è che le cellule trattengono, oltre


alle proteine, anche composti aromatici cancerogeni ed altri composti tossici e/o
allergenici dovuti ai processi metabolici di trasformazione di substrati, anche diversi
da quelli paraffinici (p. es., metanolo, siero di latte).

Crescita cellulare - 4 48
SCP da n- paraffine
Gli impianti di produzione di SCP da n-paraffine vennero inizialmente avviati allo
scopo di deparaffinare il petrolio; successivamente, in ragione della produzione di
paraffine sempre più pure e a prezzo accessibile, le si utilizzò come substrato per la
crescita di lieviti, funghi e batteri (principalmente del genere Candida ).

Solitamente il substrato è costituito da gasolio al 15-25% di alcani o n-paraffine


C15-C30, addizionate di NH 3 gassosa (quale fonte di azoto), di acido fosforico, di sali
minerali e di agenti antischiuma.

Anche il metano può essere utilizzato come substrato, con le difficoltà legate alla
lavorazione di miscele gassose aria/CH 4, soprattutto per la crescita di colture miste.

Crescita cellulare - 4 49
I reattori possono essere del tipo agitato (volume ±300 m3) o airlift con efficace
agitazione, data la scarsa solubilità in acqua del substrato organico, per favorire
la formazione di emulsioni: d’altra parte gli stessi microrganismi producono
sostanze gelificanti che favoriscono l’adesione del substrato.

La temperatura del brodo di coltura va mantenuta attorno ai 30°C, la qual cosa


implica un elevato scambio termico verso l’esterno in virtù del fatto che il
processo è fortemente esotermico.

In genere, si usano due fermentatori in serie, in modo che nel primo si


favorisca la crescita delle popolazioni microbiche e nel secondo l’esaurimento
dei nutrienti; a seconda del substrato impiegato, i metodi di separazione del
prodotto ottenuto si differenziano di molto: con n-alcani puri è sufficiente un
lavaggio con tensioattivi, mentre con gasolio sono richieste operazioni più
complesse di decantazione e di separazione con solvente.

Crescita cellulare - 4 50
Se le SCP sono destinate alla dieta umana, occorre diminuirne il contenuto in
acidi nucleici o mediante recupero del solo materiale proteico dalle cellule
frantumate o attraverso shock termico o, infine, con estrazione in soluzione
alcalina.

Alla fine, il prodotto ottenuto va essiccato per eliminare tutti i microrganismi


presenti.

Crescita cellulare - 4 51
SCP da metanolo
La tecnologia di produzione delle SCP sfruttando come substrato il metanolo è
di competenza della I.C.I. inglese. L’elevata produttività richiede una efficace
aerazione ed uno scambio termico elevato: per un reattore da 250 m3, si
richiedono 16 Kg/m 3· h di ossigeno e si devono allontanare 4·107 KJ/h di
calore. Si opera a pH leggermente acido (6.5-6.9) e a temperatura di 34-37°C.
Il brodo finale che si ottiene, estremamente denso, viene alimentato
direttamente alle centrifughe, eliminando l’operazione di filtrazione; in questo
modo il processo può essere condotto in continuo.

SCP da siero di latte


Il siero di latte pastorizzato, deproteinizzato e decantato, può costituire un
substrato ideale per la produzione di SCP destinate anche all’alimentazione
umana. Diversi sono i lieviti che possono essere rapidamente accresciuti sul
siero; i reattori usati sono sia continui che discontinui e vengono alimentati con
siero diluito al 30% di lattosio e addizionato di NH3, acido fosforico e sali.
Il pH, in questo caso, è decisamente acido (3.5) e la temperatura è mantenuta
attorno ai 35°C.

Crescita cellulare - 4 52