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BIOTRASFORMAZIONI

Il passato
La fermentazione dello zucchero per dare etanolo mediante l’utilizzo di lieviti è un processo
conosciuto da molto tempo. Questo processo è stato modificato moltissimo nel trascorrere degli
anni: anche oggi vi è un grande interesse nell’ottimizzazione della conversione dello zucchero di
canna in alcol in quanto questo composto viene aggiunto alla benzina. Questo processo è molto
importante in quei paesi dove il costo dello zucchero di canna è molto basso come in Brasile.
Non soltanto la trasformazione di zucchero in alcol è importante ma dal punto di vista commerciale
è interessante anche la produzione di glicerolo che è un sottoprodotto di questa biotrasformazione
come è stato messo in evidenza dagli studi di Pasteur. Ricerche più recenti hanno dimostrato che,
quando Saccharomyces cerevisiae cresce in un mezzo tamponato a pH alcalino, la resa di glicerolo
aumenta Manipolazioni del metabolismo del lievito hanno portato a produzioni in larga scala.
Così come la produzione di etanolo caratterizza la fermentazione, così la produzione per via
fermentativa di acido acetico ed acido lattico si legano all’industria dell’aceto e della
fermentazione del latte. Oggi l’acido lattico è prodotto dal lattosio presente nel siero utilizzando
Lactobacillus bulgaricus. Microrganismi analoghi come L. delbrueckii e L. pentosus convertono il
glucosio nello stesso prodotto.
Un altro prodotto molto importante è l’acido citrico. Il processo originario coinvolge la
degradazione del saccarosio con Aspergillus niger. Una variante di questo processo è ancora
utilizzata oggi. L’acido citrico viene utilizzato come aroma per cibi e bevande e come antiossidante.
In aggiunta ai prodotti ottenuti attraverso le reazioni del metabolismo primario, molti organismi
producono metaboliti secondari molto interessanti. I più conosciuti metaboliti secondari prodotti dai
funghi sono le penicilline e le cefalosporine ottenute rispettivamente da Penicillium sp. e
Cefalosporium sp.. La produzione annuale di Penicillina-G e V è di circa 12.000 tonnellate.

H H
H
N S

Penicillina G
O N

O
COOH
 2

Le penicilline e le cefalosporine sono agenti antibatterici di grande importanza e poiché si è

riscontrato da parte dei batteri un’aumentata resistenza a questi derivati è diventato molto
importante sintetizzare nuovi antibiotici.
Tali “antibiotici semisintetici” sono prodotti dalla rottura enzimatica del legame ammidico tra la
catena laterale della penicillina G e la porzione dell’acido 6-amminopenicillanico. Si attacca poi una
nuova catena laterale l’acido 6-amminopenicillanico sul gruppo amminico rilasciato dalla rottura. Il
primo antibiotico semisintetico è stata l’ampicillina introdotta sul mercato nel 1961.

H H
H
N S

Penicillina G
O N

O
COOH

penicillina G amidasi

H H

H2N S

Acido 6-amminopenicillanico
N

O
COOH

fenilglicina

H2N H H H
H
N S

Ampicillina
O N

O
COOH
 3

Questa reazione è stata resa possibile dalla scoperta che il fungo Penicillium chrysogenum
produceva l’acido 6-amminopenicillanico che poteva essere convertito in nuovi derivati
penicillinici. Sebbene fosse stata scoperta già una via chimica per la sintesi dell’acido penicillanico,
la conversione enzimatica era più economica del processo chimico e anche della produzione
fermentativa.
La produzione di ampicillina per via enzimatica avviene in tre stadi. Nel primo stadio la penicillina
G amidasi, viene prodotta in alte rese dall’appropriato microrganismo. L’enzima viene quindi
attaccato ad un polimero epossi arilico di nome Eupergit C.

O Enzima
H2N
O

Eupergit

Enzima
O NH

OH

L’enzima immobilizzato in questo modo è altamente attivo e molto stabile tanto da catalizzare 500
cicli mantenendo il 90% della sua attività.
Il secondo stadio prevede la sintesi della catena laterale: nel caso dell’ampicillina si tratta di D-
fenilglicina. Gli amminoacidi D,L si generano abbastanza facilmente per via chimica, poi la miscela
racemica viene risolta in modo poco costoso per via enzimatica
 4

NH2

NH2
amminopeptidasi

O Pseudomonas putida

D,L-fenilglicinammide

H NH2 H2N H

OH NH2

O O

L-fenilglicina D-fenilglicinammide

H2N H

OH

D-fenilglicina (resa > 90%)

Inizialmente la amminopeptidasi microbica catalizza selettivamente la rottura del legame ammidico

nella L-fenilglicinammide per dare L-fenilglicina e la D-fenilglicina ammide. Quest’ultima è
separata mediante formazione di una base di Shiff insolubile con la benzaldeide. Da questo
composto per idrolisi acida si ottiene la D-fenilglicina senza avere il fenomeno della
racemizzazione.
 5

Il terzo stadio è l’accoppiamento della catena laterale sul nucleo dell’acido 6-

amminopenicillanico.Questo passaggio si può fare per via chimica oppure per via enzimatica. A pH
4.5-5.5 le penicillina G acilasi ottenute da E. coli, Bacillus circulans e B. megaterium sono state
usate per la sintesi di ampicillina.
H H
H2N H
H2N S
OCH3

N
O
O
COOH

pencillina
G acilasi

H2N H H H
H
N S

O N
Ampicillina
O
COOH

Nella stessa maniera è stata prodotta l’amoxicillina che prevede come catena laterale la D-p-
idrossifenilglicina.
H2N H

OCH3

O
HO

Gli steroidi derivati dalle piante e dagli animali sono molecole molto importanti dal punto di vista
biologico per esempio come antiinfiammatori (cortisone).
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Le ossidazioni e le riduzioni che i microrganismi effettuano sugli steroidi e sugli steroli sono un
esempio molto significativo di biotrasformazioni regioselettive e stereospecifiche e dimostrano
l’abilità degli enzimi a promuovere reazioni su centri non attivati di catene idrocarburiche.

18 20 21
12
17
11
19 13 16
C D
1 9

2 14
15
1 8
A 0 B
3 7
5 6
4

β α
L’attività biologica degli steroidi dipende dall’orientazione dei gruppi legati all’anello. Come
mostrato in figura i gruppi che si trovano sopra il piano medio degli anelli condensati sono chiamati
β, mentre quelli che si proiettano sotto il piano sono detti α.
Virtualmente ogni posizione dello scheletro steroidico può essere idrossilata stereospecificamente
dagli enzimi presenti in alcuni microrganismi: le steroidi idrossilasi sono chiamate a seconda della
posizione di attacco sull’anello o sulla catena laterale. Ci sono tre atomi di carbonio primari
(C18,C19 e C21). Un enzima che catalizzi l’idrossilazione della posizione C21 viene chiamato 21-
idrossilasi. Ci sono 18 atomi di carbonio secondari a cui i gruppi idrossilici si possono attaccare in
posizione α o β e per ognuna di queste posizioni esiste un enzima specifico. Oltre all’idrossilazione
certi enzimi microbici possono aromatizzare l’anello A, ridurre i doppi legami nell’anello o ridurre
gruppi chetonici specifici presenti come sostituenti. La trasformazione microbica di steroidi e steroli
ha abbassato notevolmente i costi di produzione di alcuni ormoni steroidei.
Facciamo un esempio.
Nel 1930 Kendall isolò per la prima volta il cortisone. Nel 1949 Hench scoprì che il cortisone aveva
effetti recessivi sull’artrite reumatoide. La grande domanda di questo ormone diede una grande
spinta alla sintesi chimica ma questo metodo si dimostrò molto laborioso in quanto richiedeva 31
passaggi e la resa finale era estremamente bassa (615 Kg di acido desossicolico estratto dalla bile
bovina forniva1 Kg di cortisone sotto forma di acetato con un costo di 200$ per grammo).
La maggiore complicazione nel sintetizzare il cortisone dall’acido desossicolico era spostare
l’idrossile in posizione C12 alla posizione C11. Questo processo per via chimica richiedeva 9
passaggi.
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OH

O
OH

O OH

COOH

HO O

acido desossicolico cortisone

Nel 1952 fu scoperto da alcuni ricercatori che una muffa aerobica, Rhizopus arrhizus, poteva
idrossilare il progesterone nella posizione C11 ed altri ricercatori trovarono che un’altra muffa molto
comune, Aspergillus niger, faceva la stessa cosa. Questa scoperta permise di ridurre i 31 passaggi
a solo 11. Questo portò immediatamente un vantaggio economico in quanto la reazione
microbiologica veniva fatta a 37°C in soluzione acquosa. Il prezzo del cortisone scese così a 6$ per
grammo.
O O

HO

idrossilazione

microbiologica
O O

progesterone 11α-OH-progesterone

Ulteriori riduzione dei costi si ottennero utilizzando steroli a buon mercato al posto del
desossicolato come il sitosterolo e lo stigmasterolo prodotti in grande quantità come sottoprodotti
dell’olio di soia. Un terzo prodotto di partenza a basso costo è la diosgenina estratta dalle radici di
una pianta messicana.
Per ottenere steroidi da questi steroli è necessario eliminare la catena laterale. Questo si può fare per
via chimica ma è molto più economico l’utilizzo di micobatteri, eubatteri aerobi Gram-positivi, che
utilizzano gli steroli come fonte di carbonio. per evitare che questi micobatteri distruggano
completamente lo sterolo di partenza sono stati sviluppati dei ceppi mutanti che degradano lo
sterolo fino alla molecola voluta. Questo processo ha ulteriormente diminuito il prezzo del cortisone
a 46 cents per grammo. (Circa 400 volte meno del prezzo iniziale).
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Dal 1960 si sono cominciati ad usare anche enzimi parzialmente purificati come quelli in grado di
idrolizzare le proteine (proteasi batteriche) che vennero utilizzati nell’industria alimentare, tessile e
fotografica.
L’uso degli enzimi ormai è ben consolidato ed utilizzato soprattutto nella produzione di prodotti
chimici otticamente attivi come gli amminoacidi.

Il Presente

Nel portare avanti i loro processi metabolici i microrganismi trasformano diversi composti organici.
Queste biotrasformazioni avvengono con alta specificità ed efficienza perché sono catalizzate da
enzimi. Il sito attivo di un enzima, dove il substrato si lega ed avviene la catalisi, è una superficie
asimmetrica la cui speciale geometria spesso garantisce che la reazione catalizzata dall’enzima darà
un particolare stereoisomero come unico prodotto.
Una tale specificità o enantioselettività è difficile se non impossibile ottenerla con i normali metodi
chimici.
Anche quando un composto organico può essere sintetizzato chimicamente, il processo può
richiedere parecchi passaggi mentre una singola reazione catalizzata da un enzima può portare allo
stesso risultato.
Inoltre gli enzimi possono catalizzare reazioni in condizioni blande di temperatura e di pH, un
vantaggio non trascurabile quando il prodotto è piuttosto decomponibile.
Infine gli enzimi possono aumentare la velocità di reazione da un fattore di 108 a 1012. Per tutte
queste ragioni le biotrasformazioni mediante microrganismi o enzimi purificati da microrganismi
sono molto utili in chimica organica preparativa.
Certi svantaggi limitano l’uso degli enzimi nei processi chimici, ma queste limitazioni sono spesso
degli ostacoli sormontabili piuttosto che delle barriere invalicabili. Un problema è che l’enzima
mostra scarsa o nessuna attività in solvente organico ed è denaturato sia dalle alte temperature che
da mezzi fortemente acidi o basici.
Queste difficoltà possono essere superate dall’immobilizzazione degli enzimi su un supporto inerte
o facendo avvenire la reazione in un sistema bifasico.
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Tabella 1. Confronto tra reazione enzimatica e chimica

Parametri di reazione Reazione enzimatica Reazione chimica
temperatura ambiente generalmente alta
pressione atmosferica generalmente alta
solvente acqua solventi organici, acqua
specificità alta bassa
stereospecificità alta bassa
regiospecificità alta bassa
concentrazione bassa alta

Un’altra limitazione è che gli enzimi possono essere inibiti dal substrato o dal prodotto e quindi la
reazione deve essere condotta a basse concentrazioni di substrato e/o prodotto per avere una
velocità di reazione buona. Oggi ci sono sistemi molto sofisticati che permettono di mantenere il
substrato alla concentrazione voluta e di allontanare in modo continuo il prodotto che si forma. Ci
sono anche sistemi ingegnosi che permettono di rigenerare gli eventuali cofattori quando questi
sono molto costosi.
I batteri e i funghi virtualmente sono in grado di colonizzare ogni nicchia ecologica. Ciascuno di
questi microrganismi produce gli enzimi necessari alla sopravvivenza in quel particolare ambiente e
da utilizzare con i nutrienti presenti. Collettivamente perciò gli enzimi presenti nei microrganismi
catalizzano una enorme varietà di reazioni chimiche trasformando sia i prodotti naturali che quelli
prodotti dall’uomo.
Questa immensa fonte di nuovi enzimi rimane largamente inutilizzata, ma la tecnologia del DNA
ricombinante ci da la possibilità di acquisire qualsiasi enzima presente negli organismi viventi e
produrlo su larga scala all’interno di cellule microbiche. Conseguentemente il numero di enzimi
disponibili sta enormemente crescendo.
Quello che un ricercatore alle prime armi in queste tecnologie deve inizialmente risolvere è il
seguente dilemma: usare un enzima parzialmente purificato o le cellule come tali.
Ci sono vari pro e contro a questa questione che sono riassunti nella seguente tabella.
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Tabella 2. Vantaggi e svantaggi nell’utilizzo di cellule ed enzimi.

Sistema di biotrasformazione Vantaggi
Cellule intere Economiche
Enzimi e cofattori presenti
Enzimi isolati Apparecchiature semplici
Processo facile da controllare
Separazione semplice
Alta stereospecificità
Cosolventi tollerati meglio
Svantaggi
Sono richieste esperienza
microbiologica e
apparecchiature di
fermentazione
Rimozione delle cellule e
separazione dei prodotti lunghe
e tediose
Possibilità di reazioni collaterali
Utilizzo di cosolventi organici
per il trasporto dei substrati e/o
prodotti dentro e fuori dalle
cellule
Costosi
Aggiunta dei cofattori
Riciclo dei cofattori per
processi su larga scala

Una volta ottenuto il microrganismo come una sospensione in acqua si deve aggiungere il prodotto.
Quando la reazione è finita le cellule possono essere rimosse per filtrazione o meglio per
centrifugazione. L’uso di cellule ovviamente richiede una grande quantità di acqua, quindi i prodotti
finali solubili in acqua sono difficilmente estraibili mentre i reagenti se non sono solubili in acqua
hanno difficoltà a raggiungere la cellula. I microrganismi catalizzano un grande numero di reazioni
quindi é possibile che la biotrasformazione non si fermi al prodotto desiderato ma questo venga
ulteriormente elaborato. Questi svantaggi nell’uso delle cellule sono controbilanciata da alcuni
vantaggi quali il basso costo dei microrganismi stessi e il fatto che tutto quanto è necessario alla
biotrasformazione è presente nella cellula stessa (enzimi, cofattori, ioni metallici, ecc.).
L’uso degli enzimi isolati può essere un’alternativa.
Gli enzimi prendono il nome del tipo di reazione che catalizzano.
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- Ossidoreduttasi: rimuovono un atomo di idrogeno da una molecola donatore (ossidazione) e

contemporaneamente addizionano un atomo di idrogeno ad una molecola accettore (riduzione).
- Transferasi: catalizzano il trasferimento di gruppi (acile o fosforile) da una molecola ad un’altra.
- Idrolasi: rompono un legame aggiungendo gli atomi di una molecola d’acqua. Questi enzimi
idrolizzano i legami di un’anidride nei biopolimeri come le proteine (legami ammidici),
polisaccaridi (legami glicosidici) e lipidi (legami esterei).
- Liasi: rimuovono un gruppo di atomi (come CO o HOH) da un substrato lasciando un doppio
legame al suo posto; possono anche sommare un gruppo di atomi, ad un doppio legame. Questi
enzimi possono addizionare (o rimuovere) un gruppo HX (quando X è un sostituente diverso da
OH) attraverso un alchene, un’immina o legami carbossilici.
- Isomerasi: cambiano la configurazione degli atomi all’interno di una molecola. Tali enzimi
possono dare epimerizzazione, racemizzazione e altre interconversioni di stereoisomeri.
- Ligasi (sintetasi): catalizzano l’unione di due molecole a spese di una rottura di un legame
pirofosfato nell’ATP. Tali enzimi catalizzano la formazione di legami C-O, C-N, C-S e C-C.

Oltre 2000 enzimi sono stati identificati e circa il 15% sono disponibili commercialmente come
proteine parzialmente purificate.

Tabella 3. Enzimi purificati e commerciali

ENZIMA Numero enzimi purificati Numero enzimi commerciali
ossidoreduttasi 650 90
transferasi 720 90
idrolasi 636 125
liasi 255 35
isomerasi 120 6
ligasi 80 5

Il costo degli enzimi disponibili commercialmente varia considerevolmente e dipende in larga parte
da quanto è usato per scopi commerciali (esempio le lipasi che sono relativamente a buon mercato a
causa del loro uso nei processi di transesterificazione dell’industria alimentare) e da quanto è
difficile isolarlo dalla fonte naturale.
L’uso di enzimi isolati ha un vantaggio importante rispetto all’uso delle cellule come tali nel fatto
che l’enzima scelto generalmente catalizza la reazione desiderata mentre le reazioni collaterali
sono evitate. L’uso di enzimi parzialmente purificati permette di condurre le reazioni in piccoli
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volumi di acqua o di solvente. La temperatura e il pH della soluzione sono facili da controllare e

cosolventi organici sono spesso ben tollerati. Inoltre alcuni enzimi tollerano la completa esclusione
dell’acqua dal mezzo di reazione. La lavorazione di una reazione catalizzata da enzimi è di solito
molto semplice ma diventa ancora più facile quando l’enzima è attaccato ad un supporto solido
(immobilizzazione).
L’immobilizzazione di un enzima di solito stabilizza l’enzima stesso e questo permette di utilizzarlo
per esempio ad alte temperature ed in sovente organico. Tipici supporti solidi per gli enzimi sono la
silice, il fluorisil, l’allumina neutra, la ceramica porosa ed i polimeri epossi-acrilici come Eupergit-
C che viene utilizzato nella sintesi di penicilline.
E’ da tenere presente che anche le cellule possono essere immobilizzate su polimeri come gli
alginati ma le tecniche utilizzate non sono così semplici.
Gli enzimi come le esterasi e le lipasi che necessitano solo della presenza di acqua per dare la
reazione di idrolisi sono molto facili da usare: il solo controllo necessario è il pH della soluzione in
quanto si forma un acido che diminuisce il pH del mezzo.
In altri casi come con le ossidoreduttasi sono richiesti invece cofattori come la nicotinammide
adenin dinucleotide (fosfato) NADH (NADPH) per avere la riduzione. Tali cofattori sono difficili
da ottenere e sono molto cari poiché ne è richiesto un equivalente molare per avere la reazione.

O OH
enzima

R1 R2 R1 R2
H

H H

CONH2 CONH2

N N

dinucleotide dinucleotide

NADH (NADPH) NAD (NADP )

Dati i costi quindi è necessario riciclare il cofattore secondo il seguente schema:

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Enzima 1
R1 CO R2 R1 CH(OH) R2

NADH NAD

X XH2
Enzima 2

L’enzima 1 e l’enzima 2 non necessariamente sono gli stessi. E’ da tenere presente che nessun
metodo di riciclo generale per questa reazione è stato ancora trovato.
Le biotrasformazioni sono le reazioni che coinvolgono l’uso di enzimi (con il riciclo del
cofattore) o le cellule come tali e sono processi in generale facili da fare e poco costosi.
Facciamo l’esempio dell’idrossilazione di un carbonio lontano da altre funzioni come avviene in
molte reazioni che coinvolgono gli steroidi, questa reazione può essere fatta usando le cellule di
alcuni microrganismi mentre la stessa reazione su sistemi aciclici è ben lontano dall’essere
prevedibile. Altri processi come la conversione del toluene nel corrispondente 3-metil-1,2-
diolcicloesano non possono essere assolutamente fatti per via chimica. Molte altre reazioni che
avvengono bene anche per via chimica come le condensazioni aldoliche stereocontrollate e la
formazione di epossidi otticamente attivi sono ugualmente studiate per via enzimatica e utilizzando
microrganismi data la semplicità di queste reazioni.
In poche parole noi studieremo:
1) esterasi, lipasi e amidasi che sono semplici da usare come catalizzatori per la preparazione di
alcoli, ammine ed acidi otticamente attivi.
2) deidrogenasi e microrganismi che vengono utilizzati nelle riduzioni enantio- e regioselettive di
chetoni per dare gli alcoli secondari corrispondenti;
3) una grande varietà di biotrasformazioni che usano enzimi e cellule: alcune di queste
trasformazioni non possono essere fatte con reagenti chimici.

Il futuro
Ovviamente il numero delle applicazioni di enzimi come l’esterasi, la lipasi e la deidrogenasi sta
crescendo in maniera vertiginosa.
Si sta focalizzando inoltre l’attenzione su quegli enzimi che catalizzano la formazione del legame
carbonio-carbonio come l’aldolasi.
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Sta crescendo anche l’uso di microrganismi manipolati per ottenere prodotti che normalmente
richiedono processi multistadi.
Solo recentemente si sta aprendo un nuovo campo per le biotrasformazioni che utilizza gli
anticorpi come catalizzatori.

Questo in sintesi è il futuro delle biotecnologie con le tecniche, fino ad oggi note, di sfruttamento
dei biocatalizzatori.