Storia della penicillina

(tratto dal Corso di storia ed epistemologia delle scienze - Specializzando: Paola

Causone)
La storia della penicillina costituisce un passaggio fondamentale nella comprensione del
cambiamento di approccio che scienziati e studiosi hanno tenuto nell'affrontare il problema
delle malattie infettive e del loro controllo. La scoperta che la causa di molte malattie
infettive era da attribuirsi a diversi microrganismi aveva spostato l'attenzione di molti
scienziati sull'immunit acquisita e sulla prevenzione come mezzo migliore di protezione
da queste. L'interesse si incentr, quindi, sul controllo di tali malattie attraverso lo sviluppo
e l'utilizzo di vaccini e antisieri. Il primo a dare un approccio molto diverso alla ricerca sulle
malattie infettive fu Paul Ehrlich (1854-1915). Egli propose che si potesse usare la
chemioterapia (termine coniato dallo stesso scienziato) per combattere queste malattie,
ossia che si potessero curare con l'utilizzo di un farmaco preciso, tossico per il
microrganismo patogeno. La necessit di incrementare gli studi in campo immunologico e
batteriologico fu resa sempre pi forte dallo scoppio del primo conflitto mondiale e, quindi,
dalla necessit di curare le infezioni diffuse tra i soldati in guerra. Tra gli scienziati che
parteciparono attivamente a queste ricerche vi fu anche Alexander Fleming (18811955).Egli, infatti, negli anni antecedenti il conflitto mondiale, aveva lavorato nei laboratori
batteriologici del St.Mary a Londra e quando lo staff si trasfer in Francia e istitu laboratori
in ospedali da campo, per curare le infezioni dei soldati ,anche lui prese parte all'iniziativa.
In tali circostanze venne a contatto con infezioni cos gravi che lo spinsero a cercare dei
composti chimici, seguendo la strada degli studi di Ehrlich, che permettessero di curarle.
Ritornato dalla guerra, continu i suoi studi alla ricerca di un antisettico. Nel 1921 scopr il
lisozima, un enzima presente in molti liquidi corporei che presenta forti effetti antibatterici
ma che non funziona in modo efficace contro le infezioni pi gravi: La scoperta, che
avvalorava per l'idea che le infezioni potessero essere curate attraverso sostanze
endogene prodotte dal corpo e, quindi, attraverso una risposta immunitaria del corpo
stesso, aument il suo interesse verso gli agenti antimicrobici. Fu durante tali studi che,
casualmente, scopr nel 1928 una sostanza che presentava effetti antibatterici e che arriv
pi tardi a chiamare penicillina. Egli, infatti, mentre era intento a pulire nel suo laboratorio,
fu incuriosito da una piastra di petri con Stafilococchi che era stata inquinata da una muffa.
Le colonie di questa muffa, che egli stabil essere di Penicillium notatum, avevano causato
una zona di inibizione della crescita degli Stafilococchi che stavano nelle vicinanze delle
stesse. Fleming ipotizz che la muffa avesse prodotto una sostanza letale per gli
Stafilococchi, che era, appunto, la penicillina. Egli present il suo lavoro su questa
scoperta nel 1929, pubblicando anche un articolo sul British Journal of Experimental
Pathology ma le sue ricerche riscossero scarso successo. Tuttavia egli continu a lavorare
su questo particolare tipo di muffa per alcuni anni ma non svilupp mai quello che poteva
essere l'uso clinico della penicillina anche perch non era un chimico ma un batteriologo
e, quindi, non fu in grado di arrivare alla sua purificazione. Il suo contributo alla scienza
con la scoperta, seppur frutto del caso, di quello che sarebbe diventato un antibiotico di
enorme utilit e i suoi studi successivi a riguardo trovarono riconoscimento nel 1945
quando fu insignito del premio Nobel insieme con Ernst Chain e Howard Florey. A
trasformare, infatti, quella che per Fleming era rimasta una semplice curiosit
batteriologica in uno strumento clinico di importanza immensa e ad aprire la strada per la
produzione industriale della penicillina furono due ricercatori che lavoravano all'Universit
di Oxford. Qui gli studi sulla penicillina ripresero casualmente nei laboratori di patologia
pochi anni dopo la sua scoperta. I due ricercatori erano l'australiano Howard Florey
(1898-1968) e il tedesco Ernst Chain (1906-1979) che si interessarono di portare avanti,

a partire da met degli anni trenta, delle ricerche sull'importanza dei meccanismi di difesa
dell'organismo contro particolari tipi di infiammazioni batteriche. Nel corso di questi studi si
punt di nuovo l'attenzione sul lisozima e si arriv a purificarlo e a determinarne la natura
del substrato. Proseguendo su questa strada Florey inizi una ricerca sistematica sulle
propriet biologiche e chimiche di alcune sostanze antibatteriche, prodotte dai batteri e
dalle muffe. Scopr che alcune sostanze naturali funzionavano come efficaci antidoti
contro i batteri, portando avanti il concetto di antibiosi, gi sviluppato da altri ricercatori
come Pasteur. Egli insieme ai suoi collaboratori scelse cos di lavorare su questi prodotti
nelle ricerche che doveva iniziare nel 1938. Durante tali ricerche, Chain, uno dei suoi
collaboratori, ritrov su vecchi articoli la sorprendente scoperta di Fleming e convinse
Florey a permettergli di fare ulteriori studi sulla penicillina. I lavori dei laboratori di Oxford si
concentrarono, quindi, su questo antibiotico e divennero famosi. Infatti i ricercatori
riuscirono, per la prima volta, a produrre e a estrarre abbastanza sostanza, anche se
ancora grezza ma gi abbastanza concentrata, dal brodo di coltura della muffa. Questo
permise di fare degli esperimenti di tipo farmacologico e tossicologico su topi e animali da
laboratorio, nei quali era stata iniettata una dose letale di batteri. Si scopr cos il grande
potere antibatterico della penicillina. Pi tardi si arriv a definire che la penicillina aveva
una "tossicit differenziale" ossia, che, se somministrata in concentrazioni non dannose
per l'organismo, era in grado di distruggere i batteri che infettavano quest'ultimo senza che
esso subisse dei danni. Si apriva cos la strada agli studi per l'applicazione di tale
sostanza nell'ambito clinico e, quindi sull'uomo. Ma l'utilizzo di tale antibiotico
sull'organismo umano richiedeva di avere a disposizione notevoli quantitativi di sostanza
attiva che fosse anche sufficientemente pura. Per questo, dopo la scoperta dell'enorme
potere chemioterapico della penicillina, in molti laboratori della Gran Bretagna e degli Stati
Uniti si intensificarono le ricerche. L'impulso a incrementare le ricerche su questo farmaco
venne anche dallo scoppio di un altro conflitto mondiale. Infatti, nel 1942, vista l'immediata
utilit che la penicillina poteva avere per la cura delle infezioni in guerra, due gruppi di
ricercatori, uno, quello di Oxford, in cui vi erano, appunto, H.Florey, R. Robimson, W
Baker e E.Chain, e uno all'Imperial College di Londra, rappresentato da I. Heilbron e A.
H. Cook, ripresero le ricerche sui metodi di purificazione dell'antibiotico. A tali ricerche si
interessarono anche industrie chimiche e case farmaceutiche. Tali lavori permisero, nel
giro di un anno, di arrivare alla prima formula di struttura che fu proposta nel 1943, di
scoprire che, sebbene sia presente una porzione centrale comune, tuttavia sono
numerose le varianti di penicillina dovute alla presenza di catene laterali attaccate al
nucleo comune e di precisare la struttura con la diffrazione ai raggi X. Chain e Florey,
infatti, provarono che la penicillina era un composto chimico con una ben determinata
struttura, la quale fu poi dimostrata attraverso le analisi cristallografiche di Dorothy
Hodgkin (1910-1994). Ella, dopo quattro anni di duro lavoro riusc, a determinare la
struttura precisa della molecola di penicillina nel 1946. Questa grande scoperta apr la
strada alle successive ricerche sulla sintesi delle penicilline. Vanno ricordati, di questa
originale ricercatrice, anche la risoluzione della struttura della vitamina B 12 e la
determinazione, nel 1969, della struttura dell'insulina.
Furono poi Florey e Chain i primi ad ottenere la penicillina in forma pura. I loro lavori
sull'antibiotico vennero pubblicati per la prima volta nel 1940 e poi in un libro Antibiotics
nel 1949. Il metodo adottato per ottenere il composto chimico puro consistette nel coltivare
la muffa in uno speciale liquido nutritivo ed estrarre la penicillina, sotto forma di acido, con
dei solventi organici anzich con acqua, dove essa, come gi accennato, sembrava
perdere i suoi poteri antibatterici. Quindi la penicillina si purific attraverso un processo di
ripartizione tra solventi organici diversi, all'inizio associata a diverse forme di
cromatografia, scoperte alcuni anni prima da A.J. Martin e Synge. La purificazione fu,

quindi, dal punto di vista chimico un processo decisamente delicato dato che la sostanza
perdeva la sua attivit in soluzioni estremamente acide o alcaline ed era facilmente
alterabile dai metalli pesanti .Infatti, le cause dell'insuccesso di precedenti tentativi di
purificazione da parte di altri scienziati erano proprio state la forte instabilit delle sue
molecole in molti solventi e soprattutto la facilit della sostanza a perdere la sua attivit
antibatterica.
Da un articolo, dello stesso Chain, uscito sul Ann. Rev. Biochem al termine del conflitto
mondiale, che raccoglie tutte le scoperte sulla chimica della penicillina fino a quel tempo,
risulta, infatti, che i metodi di purificazione conosciuti e utilizzati per ottenere la penicillina
come composto puro erano:

Distribuzione tra acqua e solventi organici. Questo processo sar la base dei
metodi di purificazione usati per al produzione commerciale della penicillina. Si
basa sul fatto che, essendo la penicillina un acido, pi solubile se presente in tale
forma in solventi organici mentre se si trova come sale pi solubile in acqua ed
cos possibile estrarre l'antibiotico da una soluzione acquosa acidificata in una
soluzione di solventi organici. I solventi pi usati per l'estrazione della penicillina
dalla soluzione acquosa sono l'amilacetato, il butilacetato e il cloroformio.
Quest'ultimo che non pu essere usato per per l'estrazione della pidrossibenzilpenicillina perch essa ha un coefficiente di ripartizione tra il
cloroformio e l'acqua troppo piccolo. La penicillina pu anche essere estratta da
una soluzione acquosa neutra con l'n-butanolo e, in tale caso, la sua solubilit in
acqua viene diminuita saturando la soluzione con solfato di ammonio.
Cromatografia su colonna di allumina.
Cromatografia di ripartizione su gel di silice
Precipitazione della penicillina come sale attraverso l'aggiunta di basi organiche e
ammoniaca ad una soluzione del suo acido in solventi organici.

Il fatto di essere riusciti a purificare la penicillina rappresent un grande passo avanti per i
suoi utilizzi terapeutici, reso ancora pi importante dal momento che la guerra in corso
richiedeva grandi quantitativi di antibiotici per curare molteplici infezioni. Il suo uso iniziale
sui pazienti fu accompagnato da numerosi effetti secondari tanto da suscitare dei dubbi sui
suoi utilizzi come antibiotico. In realt si scopr che tali effetti non erano altro che la
conseguenza di alcune impurit, ancora presenti nella sostanza, che scomparivano con
una sufficiente purificazione.
Molti risultati dei lavori compiuti negli anni trenta e quaranta in Gran Bretagna e negli Stati
Uniti, furono pubblicati solo al termine della guerra, a causa delle restrizioni date dai
governi dei due Paesi. Gli scienziati inglesi, infatti, avevano formato un comitato,
consistente di rappresentanti di diversi gruppi di ricerca, e datarono progressivamente gli
scritti sulle varie scoperte circa la penicillina, definiti come serie "PEN". Questi invece di
essere normalmente pubblicati furono spediti alla segreteria del comitato stesso. Verso la
fine del 1943 il Medical Research Council prese il controllo dei lavori sull'antibiotico e
diede origine al Comitato per la sintesi della penicillina che rimpiazz quello precedente.
Gli scienziati americani comunicavano, invece, i loro risultati al Committee on Medical
Research of the Office of Scientific Research and Developement. A mano a mano che le
ricerche procedevano diventava per sempre pi evidente che sarebbe stata necessaria
una collaborazione tra Stati Uniti e Gran Bretagna dato che una conclusione favorevole
delle ricerche avrebbe avuto esiti positivi anche sul piano bellico. Inizi, quindi, un periodo
di intensa collaborazione tra i comitati di ricerca dei due paesi che dur dal 1943 al 1945.

Florey, visto la difficolt finanziaria della Gran Bretagna per continuare a sovvenzionare gli
studi e cercare di aumentare la produzione di penicillina, fu mandato nei laboratori del
Dipartimento dell'Agricoltura a Peoria nell'Illinois, presso il Centro di Ricerca Regionale del
Nord, per continuare le sue ricerche. In questo periodo i laboratori americani avevano gi
cominciato ad investigare la produzione di penicillina in colture in superficie e a Peonia la
produzione industriale dell'antibiotico divenne un progetto governativo di alta priorit. Le
industrie furono fornite di ceppi e sistemi di fermentazione e come terreno di coltura si
utilizz sempre di pi un insieme di amido idrolizzato, lattosio e acqua di macerazione del
mais; Kluyver e Perquin dimostrarono che era possibile coltivare muffe in colture
sommerse e i laboratori di Peonia adottarono questo metodo per la crescita del
Penicillium. In questi laboratori si riusc a isolare anche un nuovo ceppo di Penicillium
(Penicillium chrysogenum) che si rivel pi adatto in seguito per la produzione industriale
riguardo alla quale si cercarono di ottimizzare i metodi di produzione in modo da
incrementare i quantitativi prodotti. In stretta collaborazione universit e laboratori privati
risolsero i maggiori problemi legati alla fermentazione a al disegno dei fermentatori. La
collaborazione tra Stati Uniti e Gran Bretagna increment anche le loro potenzialit
mediche e port verso ricerche ancora attuali su nuovi tipi di antibiotici. Nel periodo
postbellico le industrie del campo (Merck, Lederle, Hoffmann-La Roche, Glaxo) ebbero
notevoli vantaggi dagli sforzi e dalle ricerche fatte durante il secondo conflitto mondiale.
Un caso particolare fu rappresentato dalla Koninklinke Nederlandsche Gisten
Spriritusfabriek (industria olandese) che prima della guerra produceva solo alcool, lieviti,
vitamine e che durante il conflitto vide la sua attivit di ricerca ridotta al minimo anche
perch molti dei suoi ricercatori si dedicarono alla pianificazione di attivit postbelliche. Nel
1943 questi scienziati vennero a conoscenza che una "medicina" di nome penicillina era
stata scoperta; dopo aver capito che essa aveva a che fare con la muffa Penicillium
cominciarono subito ad interessarsi e a cercare le pubblicazioni di Fleming. Avendo
accesso ai ceppi della muffa, che erano stati depositati da Fleming in precedenza al
Central Bureau Voor Schimmelcultures a Baarn in Olanda, cominciarono immediatamente
ricerche segrete sulla penicillina, senza avere alcun beneficio dalle ricerche che stavano
circolando all'estero e riuscirono presto a isolare l'antibiotico in forma pura. La quantit
ottenuta fu sufficiente a curare molti pazienti con successo. Nell'inverno del 1944
acquistarono una fiala di penicillina dagli alleati, con il contenuto della quale i ricercatori
olandesi provarono che avevano effettivamente isolato la penicillina e non un altro
antibiotico. Negli anni successivi al secondo conflitto mondiale ulteriori sforzi furono fatti
per quanto riguardava la produzione di nuovi tipi di penicillina operando sul tipo di ceppo
batterico, studiando il ruolo degli enzimi che intervengono nel processo di sintesi
dell'antibiotico e intervenendo sul processo biosintetico vero e proprio.