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miRNA

I miRNA sono piccole molecole di RNA, scoperte dal Genome Institute di Singapore, a singolo filamento di 20-22 nucleotidi che svolgono diverse funzioni, la pi nota attualmente una regolazione post-trascrizionale. Essi si dividono in tre classi: Short interfering RNA (siRNA), MicroRNA (miRNA), Piwi RNA (piRNA). Le prime due molecole sono ampiamente presenti in natura e derivano da precursori a doppio filamento, i PiwiRna sono molto presenti negli animali e sembrano derivare da precursori a singolo filamento, anche se per questi si hanno poche informazioni. Biogenesi dei miRNA

I siRNA possono derivare da trascritti di dsRNA come: RNA virali, RNA hairpin, trasposoni, centromeri, trascritti antisenso pi trascritti senso di geni affini. I miRNA derivano da trascritti di sequenze specifiche, i quali si presentano come sequenze di dsRNA con struttura secondaria (stem-loop) chiamate pri-miRNA, generati dalla trascrizione di alcuni geni ad opera del RNA polimerasi II.

I pri-miRNA sono molecole grandi anche migliaia di nucleotidi che subiscono poliadenilazione, capping e presumibilmente splicing degli introni, poi vengono processati da apposite RNAsi di tipo III chiamate Drosha (negli animali e Dcl1 nelle piante) e Pasha ed in questo modo si generano molecole lunghe 70-80 nucleotidi con struttura a forcina, senza estremit libere solo con porzioni 3' protrundenti, definite pre-miRNA. I pre-miRNA vengono esportati nel citoplasma grazie all'esportina 5 (proteina localizzata sulla membrana nucleare), che media la sua traslocazione nel citoplasma per la recisione dell'ansa (Bartel, 2004) e quindi per la maturazione. Nelle piante invece i due tagli avvengono entrambi nel nucleo. Nel citoplasma i pre-miRNA subiscono un processamento ulteriore ad opera di Dicer (endonucleasi RNasi III) che crea molecole a singolo filamento lunghe circa 21 nucleotidi, ovvero i miRNA. Ciascun miRNA si lega al complesso proteico RISC e lo guida verso l'mRNA target. Nelle piante, si visto che il complesso costituito da RISC e miRNA si associa per complementariet perfetta alla CDS degli mRNA target causando il taglio dell'mRNA. Negli animali invece, si visto che il complesso costituito da RISC e miRNA si associa per complementariet imperfetta alla 3'UTR dell'mRNA target, causando in questo modo il blocco della traduzione di quell'mRNA come conseguenza ad uno svolgimento impossibile dello stesso da parte di elicasi associate al ribosoma e alla sua catalisi. Si visto che un mRNA pu essere riconosciuto e legato da diversi complessi miRNA-RISC, inoltre ciascun tipo di complesso miRNA-RISC pu legarsi ad mRNA target diversi. Studi attuali stanno dimostrando che in alcuni tipi di cancro i livelli di alcuni miRNA sono bassi: questo potrebbe evidenziare che i miRNA hanno in quei casi, essenzialmente, una funzione di difesa dal cancro. I miRNA sono piccole catene acide ribonucleiche, lunghe ~22 nucleotidi. Si scoperto che sono implicati nella crescita cellulare e nell'apoptosi, nello sviluppo embrionale, nella plasticit e nel rimodellamento neuronale, e addirittura nella secrezione dell'insulina. Una sovrabbondanza di miRNA stata rivelata nei casi di ritardo mentale dovuto a X fragile, mentre si scoperto che alcuni cancri sono sottoregolati dai geni di miRNA.

PROTOCOLLO DI ESTRAZIONE 1. Contare le cellule, poi pellettare 102-107 cellule a bassa velocit e scartare il mezzo di coltura. Lavare le cellule risospendendole in circa 1 ml di PBS e ripellettare. Mettere le cellule in ghiaccio. 2. Rimuovere il PBS e aggiungere 300-600 l di Lysis/Binding Solution per 100-107 cellule. Le cellule si liseranno immediatamente dopo lesposizione alla Lysis/Binding Solution. Usare 300 l per un basso numero di cellule (centinaia) e 600 l quando si isola RNA da un maggior numero di cellule (migliaia-milioni). 3. Vortexare o pipettare vigorosamente per lisare completamente le cellule e ottenere un lisato omogeneo. Pellet cellulari congelati con elevato numero di cellule (pi di 107 cellule) possono necessitare di essere ridotti in polvere 4. Aggiungere 1/10 del volume di miRNA Homogenate Additive alle cellule o al tessuto lisato (o omogenato) e mescolare bene vortexando o invertendo la provetta diverse volte. Per esempio, se il volume del lisato di 300 l, aggiungere 10 l di miRNA Homogenate Additive 5. Lasciare la mistura in ghiaccio per 10 minuti 6. Aggiungere un volume di Acido-Fenolo:Cloroformio che uguale al volume del lisato prima dellaggiunta del miRNA Homogenate Additive. Per esempio, se il volume di lisato originario era 300l, aggiungere 300l di Acido Fenolo:Cloroformio. Assicurarsi di prelevare la soluzione dalla fase inferiore della bottiglia poich la parte superiore costituita da un buffer acquoso 7. Vortexare per 30-60 secondi 8. Centrifugare per 5 minuti alla massima velocit a temperatura ambiente per separare la fase acquosa da quella organica. Dopo centrifugazione, linterfase dovrebbe essere compatta; se non lo , ripetere la centrifugazione 9. Rimuovere con cautela la fase acquosa (parte superiore) senza disturbare la fase inferiore e trasferire in una nuova provetta. Annotare il volume rimosso. Final RNA Isolation 1. Pre-riscaldare la Elution Solution o lacqua nuclease-free a 95C per eluire lRNA dal filtro alla fine della procedura 2. Se letanolo al 100% che si pensa di utilizzare conservato a basse temperature, bisogna che sia portato a temperatura ambiente prima di iniziare lisolamento finale di RNA 3. Procedure diverse sono fornite per isolare lRNA totale o per isolare RNA che sia ricco di RNA pi piccoli di 200 basi. 4. Per isolare RNA per miRNA expression profiling usando miRNA arrays, si raccomanda di seguire la procedura per lisolamento di RNA totale, non la procedura per piccoli RNA. Questo rende possibile valutare criticamente la qualit dellRNA per verificare che sia utilizzabile per lanalisi degli array e quantificare lRNA. Total RNA Isolation Procedure Prima di iniziare, assicurarsi che siano stati aggiunti 21 ml di etanolo al 100% alla miRNA Wash Solution 1 e 40 ml di etanolo alla Wash Solution 2/3 1. Aggiungere 1.25 volumi di etanolo al 100% a temperatura ambiente alla fase acquosa (esempio, se si hanno 300 l, aggiungere 375 l di etanolo) 2. Per ciascun campione, mettere un Filter Cartridge in un collection tube fornito dal kit

3. Pipettare la mistura lisato/etanolo nel filtro Cartridge. Fino a 700 l possono essere pipettati nel filtro Cartridge in una sola volta. Per volumi maggiori fare pipettate successive 4. Centrifugare per circa 15 secondi per far passare la soluzione attraverso il filtro. Centrifugare a 10000 rpm. Centrifugare a una maggior velocit potrebbe danneggiare i filtri 5. Scartare leluato e continuare a centrifugare finch tutto il lisato/etanolo non sar passato attraverso il filtro. Riutilizzare il collection tube per gli step di lavaggio 6. Pipettare 700 l di miRNA Wash Solution 1 al filtro Cartridge e centrifugare per 5-10 secondi o utilizzare il vuoto per spingere la soluzione attraverso il filtro. Scartare leluato e rimettere il filtro nello stesso collection tube 7. Pipettare 500l di Wash Solution 2/3 e centrifugare per 5-10 secondi 8. Ripetere il passaggio precedente con una seconda aliquota di Wash Solution 2/3 9. Dopo aver scartato leluato, rimettere il filtro nello stesso collection tube e centrifugare per 1 minuto per rimuovere il fluido residuo dal filtro 10. Trasferire il filtro in un nuovo collection tube. Pipettare 100l di Elution Solution preriscaldata o acqua nuclease-free al centro del filtro e chiudere il tappo. Centrifugare per 2030 secondi alla massima velocit per recuperare lRNA. 11. Recuperare leluato (che contiene RNA) e conservare a -20C o meno.