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Il gene o la sequenza genica isolata deve essere inserita allinterno di un vettore che permette lamplificazione (aumento del numero di copie) della sequenza stessa, in modo che il gene diventi manipolabile
VETTORE PLASMIDICO
-si replica autonomamente rispetto al cromosoma batterico -possiede un polylinker -possiede un marcatore di selezione
Vettore despressione
BAC
cromosomi batterici artificiali
-ogni vettore porta un c-DNA, quindi un trascritto genico, e tutti i vettori insieme rappresentano tutto il trascrittoma
Poiche conosco le sequenze a monte e a valle del pezzo di genoma clonato, mi posso costruire dei primers che permettono di amplificre e sequenziare linserto
Caso 2: se e nota la sequenza del gene posso costruire una sonda di DNA / RNA che andra ad ibridare con la sequenza genica Caso 3: non conosco la sequenza genica ma conosco la sequenza aminoacidica anche qui costruisco una sonda a DNA/RNA, tenendo conto della degenerazione del codice genetico
LIMPIEGO DI SONDE BASATE SU ACIDI NUCLEICI E UNO STRUMENTO FONDAMENTALE PER LA GENETICA MOLECOLARE
SI SFRUTTA LA CAPACITA DELLE MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO FILAMENTO DI FORMARE MOLECOLE A DOPPIO FILAMENTO
IBRIDAZIONE
I SAGGI PIU COMUNI DI IBRIDAZIONE PREVEDONO LUSO DI SONDE SONDE:MOLECOLE DI ACIDO NUCLEICO A SINGOLO O DOPPIO FILAMENTO MARCATE
- PER INDIVIDUARE LA PRESENZA DEL GENE CHE SI STA CERCANDO - PER OSSERVARE LA PRESENZA DI UN TRANSGENE INSERITO NEI CROMOSOMI (PRESENZA O ASSENZA) - PER OSSERVARE TRASLOCAZIONI CROMOSOMICHE - PER OSSERVARE LE DIMENSIONI DEL TARGET (NON OSSERVABILI CON ALTRE TECNICHE) - PER OSSERVARE LA COLLOCAZIONE SUBCROMOSOMICA O NEL TESSUTO O NELLA CELLULA DEL TARGET
COLONY-BLOT
Chromosome walking
Il risultato dello screening di una libreria di cDNA ma, specialmente di una libreria genomica quasi sempre un clone che non comprende lintero gene. Per isolare il gene intero si utilizza una tecnica chiamata chromosome walking. Questa tecnica presuppone che la libreria sia formata da cloni parzialmente sovrapposti tra loro. La tecnica consiste nellutilizzare il cDNA isolato come sonda con cui si sonda una nuova libreria (di solito genomica) Il risultato di questo screening dovrebbe dare dei nuovi cloni una parte dei quali si estender ulteriormente verso il 5, il 3 o entrambe le direzioni. I cloni pi esterni saranno nuovamente utilizzati come sonde per isolare nuovi cloni che si estendono al 5 o al 3 ecos via fino ad isolare lintero gene.