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Nuovo allergene da
Rhizopus oryzae
Caratteristiche molecolari ed immunologiche
Funghi ed allergie
Alfredo Brocca
Rhizopus oryzae
Fungo filamentoso ubiquitario (diffuso a livello
mondiale):
• Patogeno opportunista Mucormicosi rinocerebrale
e polmonare (in soggetti immuno-compromessi)
• Importante fonte di allergeni inalabili per la
popolazione atopica (componenti maggioritari delle
aero-spore fungine, causa sensibilizzazione con
insorgenza di asma bronchiale, riniti o dermatiti
allergiche)
Studio immunoproteomico
Evidenze cliniche di (2012) lo stesso gruppo di
allergenicità di questa muffa ma ricerca ha identificato 14
nessuna caratterizzazione delle allergeni (RO)
molecole allergeniche
Aspartato endopeptidasi
Alfredo Brocca (44 Kda) la più allergenica
FASE I
PURIFICAZIONE
DETERMINAZION IDENTIFICAZION
ALLERGENE
E SEQUENZA AA E cDNA e
(tecniche
(PMF) CLONAGGIO
cromatografiche)
VALUTAZIONE
SAGGI ATTIVITÀ
ENZIMATICI ALLERGENICA
Reattività Rilascio
IgE istamina
Alfredo Brocca
FASE 2
STUDIO CROSS-
REATTIVITÀ
MAPPATURA EPITOPI
CONFORMAZIONALI
CROSS-RETTIVI
Alfredo Brocca
Caratteristiche cliniche dei pazienti allergici a RO scelti per lo studio
Alfredo Brocca
Estrazione proteine
• Coltura pura di RO in terreno
liquido (mantenuta sub-
colturando ogni 15 gg)
• Liofilizzazione – Deffating –
Omogeneizzazione in N
liquido
Alfredo Brocca
Purificazione Rhi o 1 nativo
Fr:3 eluita con un gradiente di
Fr:3B presenta Fr:3BII picco
NaCl 80% è quella contenente
ancora netto.
l’allergene di 44kDa
eterogeneità
Allergene al
90% omogeneo
Alfredo Brocca
Sequenza banca dati
Porzione N-
terminale
sequenziata con
Degradazione di
Edman
=
La proteina
inizia da qui
primi 20 aa
rappresentano
un peptide
full length cDNA e seq aa segnale
Alfredo Brocca
Clonaggio cDNA ed espressione rRhi o 1
ORF matura (senza introni) amplificata
mediante PCR da libreria di cDNA
CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ
PROTEINA RICOMBINANTE
PURIFICATA
Alfredo Brocca
rRhi e la sua allergenicità
IgE - WESTERN BLOT
(test di immuno-reattività)
rRhi o 1 è riconosciuta da
IgE specifiche presenti nel
siero di tutti i 10 pazienti
positivi
SAGGIO RILASCIO DI
ISTAMINA
30 ng di rRhi o 1 induce il
rilascio di istamina da parte
di basofili sensibilizzati
passivamente con il siero
dei 10 pazienti
Alfredo Brocca
Caratterizzazione Rhi o 1 come aspartato proteasi
Nel gel piccole aree non L’attività enzimatica di aspartil proteasi è
colorate compaiono proprio dimostrata dalla sua abilità di catalizzare la
in corrispondenza di 44 kDa degradazione di BSA con un conseguente
(come atteso) incremento di A280 del sovranatante di
reazione
nRhi rRhi
ZIMOGRAFIA IN SOL
(in gel) (con BSA)
Alfredo Brocca
Blattella germanica
3 aspartato proteasi sono già state identificate come maggiori allergeni
- Bla g 2 (Blattella germanica) molto studiata a livello molecolare
e strutturale
- Per a 2 (Periplaneta americana)
- Asp f (Aspergillus fumigatus)
Considerevole omologia di
sequenza ma nessuno studio
di cross-reattività in vitro
Alfredo Brocca
MSA 4 ASPARTATO PROTEASI ALLERGENICHE
Possibile presenza di
determinanti antigenici
comuni
Alfredo Brocca
Cross-reattività tra Rhi o 1 e Bla g 2
IgE ELISA
Test reattività IgE dei 10 sieri
verso rBla g 2
Alfredo Brocca
Verso l’identificazione di un epitopo conformazionale su Rhi o
1
IgE – immunoblot
inhibition IgE – Dot Blot
Realizzazione modello 3D
per omologia usando come
templato aspartato proteasi
di lievito (61% identità)
Allineamento delle
coordinate atomiche tra Bla
g 2 e Rhi o 1
Rhi o 1 regione
strutturalmente molto
simile all’epitopo
conformazionale 4C3 di
Struttura bilobata tipica delle aspartato proteasi e Bla g 2
due residui di Asp conservati nel sito catalitico
Alfredo Brocca
RISULTATI
Alfredo Brocca
RISULTATI II
• Nonostante differenze nelle proprietà catalitiche Rhi o 1
mostra cross-reattività con Bla g 2. Ciò è dovuto ad un
epitopo conformazionale (mAb4C3) comune alle due
molecole