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Rhi o 1

Nuovo allergene da
Rhizopus oryzae
Caratteristiche molecolari ed immunologiche
Funghi ed allergie

La diffusione di allergie respiratorie causate da funghi colpisce dal 20


al 30 % degli individui atopici (predisposti alle allergie) e fino al 6%
della popolazione mondiale

Corretta identificazione e caratterizzazione


molecolare degli allergeni

Accurattezza della Immunoterapia allergene


diagnosi basata sull’uso specifica (ipoallergene
di allergeni purificati modificato)

Alfredo Brocca
Rhizopus oryzae
Fungo filamentoso ubiquitario (diffuso a livello
mondiale):
• Patogeno opportunista  Mucormicosi rinocerebrale
e polmonare (in soggetti immuno-compromessi)
• Importante fonte di allergeni inalabili per la
popolazione atopica (componenti maggioritari delle
aero-spore fungine, causa sensibilizzazione con
insorgenza di asma bronchiale, riniti o dermatiti
allergiche)

Studio immunoproteomico
Evidenze cliniche di (2012) lo stesso gruppo di
allergenicità di questa muffa ma ricerca ha identificato 14
nessuna caratterizzazione delle allergeni (RO)
molecole allergeniche
Aspartato endopeptidasi
Alfredo Brocca (44 Kda) la più allergenica
FASE I

PURIFICAZIONE
DETERMINAZION IDENTIFICAZION
ALLERGENE
E SEQUENZA AA E cDNA e
(tecniche
(PMF) CLONAGGIO
cromatografiche)

VALUTAZIONE
SAGGI ATTIVITÀ
ENZIMATICI ALLERGENICA

Reattività Rilascio
IgE istamina

Alfredo Brocca
FASE 2

STUDIO CROSS-
REATTIVITÀ

MAPPATURA EPITOPI
CONFORMAZIONALI
CROSS-RETTIVI

Alfredo Brocca
Caratteristiche cliniche dei pazienti allergici a RO scelti per lo studio

Alfredo Brocca
Estrazione proteine
• Coltura pura di RO in terreno
liquido (mantenuta sub-
colturando ogni 15 gg)

• Raccolta micelio densamente


sporulato

• Liofilizzazione – Deffating –
Omogeneizzazione in N
liquido

• Pricipitazione delle proteine


totali con solfato d’ammonio

MIX ETEROGENEO DI PROTEINE


Alfredo Brocca
3 STEP DI
FRAZIONAMENTO
dell’estratto proteico
1. Cromatografia a scambio
anionico
(separazione in base alla
diversa affinità per la fase
stazionaria)

2. Cromatografia per gel


filtrazione (x2)
(separazione in base alle
dimensioni)
gelrange dimensionale
3-70KDa

Alfredo Brocca
Purificazione Rhi o 1 nativo
Fr:3 eluita con un gradiente di
Fr:3B presenta Fr:3BII picco
NaCl 80% è quella contenente
ancora netto.
l’allergene di 44kDa
eterogeneità
Allergene al
90% omogeneo

IgE ELISA P/N


SDS-PAGE e Western Blot
(Ogni frazione con siero di native Rhi o 1 mostra una
pazienti RO-positivi) significativa reattività verso IgE
Alfredo Brocca
Determinazione sequenza aa
PMF
SPETTROMETRIA DI
IDENTIFICAZIONE
MASSA
GEL BIDIMENSIONALE Digestione BIOINFORMATICA
enzimatica
Separazione dei
pI=4.6 Digestione virtuale
frammenti peptidici m/z
delle proteine della
Misura della massa di specie presenti nel
ogni frammento database e confronto

L’allergene identificato è una Endopeptidasi di RO (401 aa)

Alfredo Brocca
Sequenza banca dati
Porzione N-
terminale
sequenziata con
Degradazione di
Edman
=
La proteina
inizia da qui
primi 20 aa
rappresentano
un peptide
full length cDNA e seq aa segnale

Alfredo Brocca
Clonaggio cDNA ed espressione rRhi o 1
ORF matura (senza introni) amplificata
mediante PCR da libreria di cDNA

CLONAGGIO in E.coli mediante vettore


d’espressione (con tag peptidico)

ESPRESSIONE proteina ricombinante


(indotta con IPTG)

CROMATOGRAFIA DI AFFINITÀ

PROTEINA RICOMBINANTE
PURIFICATA
Alfredo Brocca
rRhi e la sua allergenicità
IgE - WESTERN BLOT
(test di immuno-reattività)

rRhi o 1 è riconosciuta da
IgE specifiche presenti nel
siero di tutti i 10 pazienti
positivi

SAGGIO RILASCIO DI
ISTAMINA
30 ng di rRhi o 1 induce il
rilascio di istamina da parte
di basofili sensibilizzati
passivamente con il siero
dei 10 pazienti

Alfredo Brocca
Caratterizzazione Rhi o 1 come aspartato proteasi
Nel gel piccole aree non L’attività enzimatica di aspartil proteasi è
colorate compaiono proprio dimostrata dalla sua abilità di catalizzare la
in corrispondenza di 44 kDa degradazione di BSA con un conseguente
(come atteso) incremento di A280 del sovranatante di
reazione
nRhi rRhi

ZIMOGRAFIA IN SOL
(in gel) (con BSA)
Alfredo Brocca
Blattella germanica
3 aspartato proteasi sono già state identificate come maggiori allergeni
- Bla g 2 (Blattella germanica)  molto studiata a livello molecolare
e strutturale
- Per a 2 (Periplaneta americana)
- Asp f (Aspergillus fumigatus)

Considerevole omologia di
sequenza ma nessuno studio
di cross-reattività in vitro

Alfredo Brocca
MSA 4 ASPARTATO PROTEASI ALLERGENICHE

29% identità con Asp f 10


27% identità con Bla g 2 e
Per a 2

Possibile presenza di
determinanti antigenici
comuni

Alfredo Brocca
Cross-reattività tra Rhi o 1 e Bla g 2

IgE ELISA
Test reattività IgE dei 10 sieri
verso rBla g 2

IgE ELISA inhibition

Sieri 8 pazienti mescolati e


preincubati con:
• rBla g 2 (inibitore)
• rRhi o 1 (auto-inibitore) +
• BSA (non inibitore) -
Alfredo Brocca
Cross-reattività tra Rhi o 1 e Bla g 2

Rilascio di istamina stimolata da rBla g 2


(basofili passivamente sensibilizzati
con IgE anti-Rhi o 1)

Dimostrazione che i due allergeni condividono “alcuni” epitopi responsabili della


loro allergenicità

Alfredo Brocca
Verso l’identificazione di un epitopo conformazionale su Rhi o
1
IgE – immunoblot
inhibition IgE – Dot Blot

rBla g 2 non inibisce il rRhi o 1 denaturato lega le


legame IgE–rRhi o 1 IgE quasi con la stessa
(condizioni efficienza rispetto a rRhi o
1 nativa
denaturanti)
Alfredo Brocca
Identificazione epitopo conformazionale cross-reattivo su rRhi
o1
Sandwich ELISA

Il fondo della piastra


ELISA saturata con rRhi o
1 trattata col calore

test inibizione (ELISA) mAb AC3 esercita


+ inibizione dose dipendente
del legame
-
+ (IgE sieriche – rRhi o 1)

Conferma di una sovrapposizione


tra l’epitopo riconosciuto da IgE e
quello riconosciuto da mAb4C3
Alfredo Brocca
Mappatura epitopo conformazionale cross-reattivo

Realizzazione modello 3D
per omologia usando come
templato aspartato proteasi
di lievito (61% identità)

Allineamento delle
coordinate atomiche tra Bla
g 2 e Rhi o 1

Rhi o 1 regione
strutturalmente molto
simile all’epitopo
conformazionale 4C3 di
Struttura bilobata tipica delle aspartato proteasi e Bla g 2
due residui di Asp conservati nel sito catalitico
Alfredo Brocca
RISULTATI

• Rhi o 1 purificata è stata identificata come una endopeptidasi


(aspartato proteasi)

• cDNA full length dell’allergene è stato espresso e purificato


(rRhi o 1). Allergenicità del tutto simile a nRhi o 1 (western
blot con siero di pazienti e capacotà di indurre il rilascio di
istamina)

• Sequenziamento N-terminale rivela la presenza di un peptide


segnale che suggerisce la natura non citosolica dell’allergene (si
conosco già casi di proteasi allergeniche extra-cellulari

Alfredo Brocca
RISULTATI II
• Nonostante differenze nelle proprietà catalitiche Rhi o 1
mostra cross-reattività con Bla g 2. Ciò è dovuto ad un
epitopo conformazionale (mAb4C3) comune alle due
molecole

• Studi in silico sulla struttura 3D hanno confermato un alto


grado di similarità strutturale tra i siti di legame 4C3 di
entrambi gli allergeni

• La presenza di certi epitopi lineari (riconosciuti dalle IgE)


che non cross reagiscono con Bla g 2
Alfredo Brocca
Alfredo Brocca