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q ·E = f ·v
q
v= —·E
f
v q
mobilità elettroforetica : = — = —
E f
Applicando un campo elettrico si può avere effetto Joule:
V=RI
W = R I2
Operare a I costante
su carta su gel
Gel di agarosio – Elettroforesi orizzontale
Formazione di un gel di poliacrilammide
CH2
• Acrilamide, bisacrilamide monomeri
• Ione perossodisolfato iniziatore
• TEMED catalizzatore
Se q L, in
assenza di gel e’
pressoché
indipendente dalle
dimensioni
molecolari
Migrazione
di proteine
e DNA in
gel di varia
porosita’
Visualizzazione del DNA: etidio bromuro
luce UV
Poiché il DNA sottoposto ad un campo elettrico migra ad una velocità
proporzionale all’inverso del log10 del peso molecolare, facendo
migrare il campione in esame insieme ad uno standard di pesi
molecolari di dimensione nota è possibile estrapolare il peso
molecolare del campione ignoto
1 pozzetti
-20
-10 2
-7.0
3
8
Utilizzando una serie di frammenti di DNA a peso molecolare noto è possibile costruire
una curva di taratura. Ogni banda corrisponde ad un punto le cui coordinate sono
costituite, in ascissa, dalla distanza in cm dal pozzetto e, in ordinata, dal Log 10 del peso
molecolare. Congiungendo tutti i punti, riportati su un grafico semi-logarittimico, si
dovrebbe formare una linea approssimativamente retta, da cui, nota la distanza dal
pozzetto percorsa da una banda incognita, è possibile estrapolare il peso molecolare
approssimativo
kb Log kb
X=log10 0,54
20 1.30
10 1.00 100,54= Kb 3,46
7 0.80
5 0.69 X
4 0.60
3 0.47
2 0.30
1,6 0.20
1 0.00
0.7 -0.15
0,5 -0.3
0 1 2 3 4 5 6
Distanza in cm dal pozzetto
SDS-PAGE
(Sodium DodecylSulfate Poly-Acrylamide Gel Electrophoresis)
Permette la separazione delle proteine solo in base al peso molecolare
SDS-PAGE : elettroforesi discontinua
Le tre specie ioniche aggiustano la loro concentrazione in modo che [Cl –] >
[proteina-SDS] > [glicinato].
Poiché la quantità di proteina-SDS e’ molto piccola, questa specie si concentra
in una banda molto stretta fra la banda del glicinato e quella del Cl –.
Colorazione con Coomassie