LEZIONE 15

Lisozima - Lysozyme
➢Lisozima (1,4-β-N-acetilmuramidasi) è un enzima che svolge un ruolo importante nella prevenzione delle
infezioni batteriche attaccando il peptidoglicano, una componente specifica di alcune pareti batteriche, lo
scindendo/idrolizza così facendo la cellula batterica esplode e muore. Questa attività catalitica di scissione
è di tipo glicolitico, scinde dei legami glicosidici all’interno della struttura del peptidoglicano.

➢ Il peptidoglicano della parete batterica è costituito da sequenze polisaccaridiche di amminozuccheri

(catene polisaccaridiche) collegate tra loro da ponti peptidici e contenenti unità disaccaridiche ripetitive di
N-acetilglucosammina (NAG) e acido N-acetilmuramico (NAM) il quale è una sorta di N-acetilglucosammina
dove però è legato un residuo di acido lattico (lattato). Queste catene polisaccaridiche sono unite tra loro
tramite dei linker pentapetidici, piccoli pentapeptidi che legano tra loro i residui di acido N-acetilmuramico.
In questo modo c’è una intelaiatura complessa, una membrana di peptidi e glicosidi che viene chiamata
peptidoglicano il quale racchiude la cellula dei batteri GRAM positivi.

➢ Il lisozima idrolizza (scinde) i legami glicosidici del peptidoglicano tra il C-1 del NAM e il C-4 della NAG,
incrementa la permeabilità della parete batterica e ne causa la distruzione

➢Il lisozima è ampiamente distribuito nelle piante e negli animali: il lisozima umano è espresso nelle
mucose della cavità nasale e dei dotti lacrimali, si trova anche nella saliva, nelle lacrime, nel latte, nel muco
cervicale, nei leucociti e nel tessuto renale

➢ Il lisozima fu scoperto da Alexander Fleming nel 1921, quando dimostrò che il suo muco nasale aveva la
capacità di inibire la crescita di un certo ceppo di batteri in coltura. Questa scoperta fu del tutto casuale,
(utilizzava le capsule di Petri per le sue colture, caddero delle gocce di muco nasale). Si rese conto che ciò
era in gran parte dovuto all'azione di una proteina all'interno del muco che causava la lisi o la rottura delle
cellule batteriche. Per questo motivo denominò la proteina lisozima. In una pubblicazione del 1922, riferì
la sua attività nell'albume delle galline, nelle lacrime, nella saliva,
nell'espettorato e nelle secrezioni nasali. In uno studio successivo,
Fleming in collaborazione con V. D. Allison rilevò la presenza di lisozima
nel siero del sangue umano, nella saliva, nel latte e in un'ampia varietà
di altri fluidi.

➢Nonostante l'attività antimicrobica del lisozima verso batteri innocui

presenti nell'aria, esso si è dimostrato inefficace contro batteri
patogeni. Ciò convinse Fleming a passare ad altri studi sugli antisettici
chimici. Tuttavia, il suo lavoro sul lisozima stimolò l'interesse di Fleming
per gli agenti antimicrobici, che, come universalmente noto, portò alla
scoperta della penicillina nel 1928 (Premio Nobel in Fisiologia o
Medicina 1945)
➢La maggior parte del lisozima utilizzato nella ricerca è isolato e purificato dagli albumi d'uovo di gallina,
ottenuto in buone quantità per poterlo studiare. Esso consta di 129 residui e presenta quattro ponti
disolfuro.
➢ Nel 1966, David Chilton Phillips, utilizzando la cristallografia a raggi X, determinò la struttura
tridimensionale del lisozima, la prima mai risolta per un enzima.
➢Da questo lavoro, Phillips è stato in grado di spiegare il meccanismo dell'attività catalitica dell'enzima.
➢In condizioni fisiologiche, il lisozima è ripiegato in una struttura compatta e globulare con una lunga
fessura sulla superficie della proteina, è importante perché in questa regione c’è il sito attivo dell’enzima
dove viene accolto la porzione di peptidoglicano che poi sarà soggetto dell’attività catalitica di idrolisi del
legame glicosidico. Ci sono due residui uno di acido aspartico e uno di acido glutammico, che sono i
principali attori dell’attività catalitica dell’enzima, tagliando il legame glicosidico.
➢Questa fessura è il sito attivo coinvolto nel legame con la catena polisaccaridica della parete batterica e
nella sua successiva scissione

Il sito di scissione del lisozima

➢ Il lisozima idrolizza il legame glicosidico β(1→4) tra il C1 di NAM e il C4 di NAG, e non influenza i legami
tra il C-1 di NAG e il C-4 di NAM.

Studi Strutturali su Substrati Analoghi

➢ I substrati naturali vengono subito scissi e non rimangono stabilmente nel sito attivo, impedendo la
realizzazione di studi strutturali con il substrato naturale.
 ➢  Possono però essere utilizzati alcuni analoghi strutturali, come ad esempio il trimero (NAG)3.
Tre residui di N-acetilglucosammina legati tramite legame glicosidico Beta-1,4’, il trimero entra
all’interno del sito attivo e interagisce con esso, questo consente lo studio di questo meccanismo di
idrolisi.
 ➢  Un aspetto importante, che si verifica quando la sequenza zuccherina entra all’interno del sito
attivo, è un effetto di distorsione dello zucchero in corrispondenza del sito in cui avviene la catalisi
che porta alla scissione glicolitica L’inserimento del NAG nel sito D richiede una distorsione degli
zuccheri. Questo suggerisce la struttura nello stato di transizione dello stato di idrolisi attraverso
destabilizzazione del substrato (distorsione e tensione). L’enzima abbassa l’energia dello stato di
transizione, esercita l’effetto catalitico, in vari modi come distorcere, sulla base delle interazioni
molecolari, la struttura del substrato per
avvicinarla a quello dello stato di transizione.
Questo ha portato a pensare che esiste una
stabilizzazione dello stato di transizione attraverso
questa opera di distorsione e tensione del substrato per adattarla alla struttura del substrato nello stato di
transizione.

Viene distorto il quarto zucchero che si ritrova in una sequenza esasaccaridica. Quando la sequenza
saccaridica del peptoglicano va a depositarsi all’interno della fessura del lisozima (nel sito catalitico)
entrano 6 unità monosaccaridiche in sequenza, di queste 6 la quarta è un’unita di acido N-acetilmuramico
ed è quella su cui avviene la scissione del legame glicosidico. Questa posizione viene chiamata “the D ring”
ovvero l’anello del subsito D di questo enzima dove alloggia questo anello di acido N-acetilmuramico, e la
distorsione comporta il passaggio da una conformazione a sedia ad una a semisedia o mezzasedia. Quindi
nella Half-chair conformation C1,C2,C5 e O5 diventano coplanari tra di loro.

Chair and half-chair conformation

➢ The lysozyme distorts the fourth sugar in hexasaccharide (the D ring) into a half-chair conformation.
➢ In this stressed state, the glycosidic bond is easily broken.
Distortion of D ring, Saccharide unit 4
=> C1, C2, C5 , and O5 are coplanar Stabilization through H bridges and ionic interactions

RIPETIZIONE CHIMICA ORGANICA:COME SI SCINDE UN LEGAME GLICOSIDICO?

Attraverso un’idrolisi acida. In soluzione acquosa acida, l’acido attacca l’atomo di ossigeno del legame
glicosidico, rompe il legame una volta che l’ossigeno è protonato, esce lo zucchero, il legame si rompe e la
coppia di elettroni va a legare il protone quindi si genera sul C1 una carica positiva la quale viene
stabilizzata dalla coppia di elettroni dell’ossigeno che mette in comune al coppia di elettroni e si genera il
carbocatione intermedio che è un ione ossocarbenio, rappresentato con due strutture di risonanza una con
un carbonio trivalente che ha una lacuna elettronica e una carica positiva oppure dove viene messa in
comune la coppia di elettroni. Si usa di solito la struttura più stabile termodinamicamente ovvero quella in
cui la coppia di elettroni è condivisa.
La distorsione del substrato che favorisce la formazione di questa struttura a mezza sedia abbassa l’energia
dello stato di transizione, favorendo l’attività catalitica. Successivamente si ha l’ingresso del nucleofilo.
Nella figura c’è un OH- ma dato che siamo in ambiente acido è più corretto dire che entra l’acqua e poi
perde un protone. Quindi in sostanza avviene l’accatto acido sull’ossigeno del legame glicosidico, scissione
del legame, ingresso del nucleofilo sullo ione ossocarbenio, che rappresenta bene lo stato di transizione,
liberazione dello zucchero.

Ci sono due distinti meccanismi che possono verificarsi e che si verificano a seconda degli enzimi glicolitici
che catalizzano questa scissione.
PRIMO MECCANISMO
È un meccanismo acido base assistito con un meccanismo single displacement (di singola sostituzione), un
meccanismo concertato. Nel sito catalitico dobbiamo avere un residuo carbossilico acido (catalisi acida) e
dall’altra parte dobbiamo avere un residuo carbossilico basico, in forma deprotonata che fa da base. Il
residuo acido protona l’ossigeno e favorisce la scissione del legame, esce uno zucchero; dall’altra parte una
base rimuove un protone ed entra il nucleofilo dal basso. In soluzione l’intermedio è libero quindi può
essere attaccato da entrambe le posizioni mentre nel sito catalitico dell’enzima tutto è regiospecifico: il
protone e l’acqua arrivano da due posizioni opposte e la base rimuove dal basso.

SECONDO MECCANISMO
È sempre un meccanismo assistito acido base ma questa volta un double displacement mechanism (con
doppia sostituzione). Ci sono due reazioni distinte di sostituzione. Abbiamo nel sito catalitico i due residui
di carbossilici uno acido che esercita la catalisi acida e l’altro basico che esercita una catalisi nucleofilo. Nel
primo stadio c’è la protonazione dell’ossigeno del legame glicosidico, la scissione del legame, un attacco
nucleofilo e la formazione di un legame covalente. Questo passaggio può essere rappresentato a due
livelli, ci può essere la effettiva realizzazione di un legame estereo oppure ci può essere un’ interazione di
tipo elettrostatica tra il carbossilato negativo e la carica positiva dello ione ossocarbenio che viene
stabilizzato attraverso l’interazione elettrostatica. Il secondo passaggio è molto chiaro, l’acqua interagisce
con il carbossilato (quello che prima era acido poi è stato deprotonato facendolo diventare basico), la base
rimuove il protone, l’OH- attacca e scinde il legame estereo oppure scinde l’interazione elettrostatica
ritornando nella sua posizione originale nativa.
Una sostanziale diversità tra il meccanismo doppio e quello singolo è che in questo caso la configurazione
del legame glicosidico corrisponde a quello dello zucchero che viene rilasciato perché la regioselettività e
la stereochimica della reazione è tale che l’acqua deve entrare dalla stessa parte in cui si è scisso il legame
glicosidico mentre nel meccanismo precedente si ha un’inversione di configurazione perché in questo caso
l’acqua (il nucleofilo) entra dalla parte opposta da cui si è rotto il legame glicosidico.
Questi meccanismi sono comuni in quasi tutti gli enzimi che scindono i legami glicosidici detti “glicosidasi”,
enzimi che catalizzano la reazione di scissione con uno dei due meccanismi appena descritti. Questo
meccanismo non è solo di scissione del legame glicosidico ma è anche di inversione della configurazione
del carbonio anomerico proprio perché cambia configurazione a causa dell’attacco del nucleofilo dalla
parte opposta rispetto alla scissione del legame glicosidico.

Meccanismo del Lisozima

➢ Studi condotti su analoghi del substrato in scissioni enzimatiche con il lisozima, in presenza di acqua
marcata con 18O, hanno dimostrato che il legame C1-O viene rotto, sul substrato, tra i siti D ed E. A livello
del D side , della posizione quarta, nella sequenza esosaccaridica entrava 18O. Si dimostrò che era a livello
dell’acido N-acetilmuramico
➢ E’ quindi lo zucchero che si trova nel sito D ad incorporare 18O a livello del C1
Si dimostrò in particolare che due aa sono fondamentali per le proprietà catalitiche:
➢ Glu35 agisce come acido generale, protonando l’ossigeno del gruppo uscente
➢ Asp52 stabilizza l’intermedio carbocationico (l’ossorcarbenio), entra l’acqua dall’alto e scinde il legame,
formando il prodotto finale
A double displacement mechanism

Glu35 and Asp52 are lysozyme’s catalytic acid-base residues costituiscono la diade catalitica dei
residui acido base del lisozima

Entriamo ancora più nel dettaglio:

nella fessura del sito attivo si deposita una sequenza di 6 zuccheri (sono sempre coppie NAG/NAM
NAG/NAM, NAG/NAM). Diamo ad ogni zucchero una lettera da A ad F, osserviamo il sito D con il residuo di
acido N-acetilmuramico che subisce la deformazione conformazionale a mezza sedia , in modo da
adattarlo alla formazione dello stato di transizione. Il glutammico 35 forma acida protona l’ossigeno del
legame glicosidico che si deve rompere, l’aspartato 52 va a stabilizzare l’ossocarbenio (lo ione che si
forma) e poi successivamente entrerà l’acqua e si realizzerà la scissione del legame.

INGRANDIMENTO DELLA PORZIONE D ED E COME AVVIENE LA SCISSIONE

L’ anello del MurNAc cambia conformazione da sedia a semisedia, 5 atomi sono sullo stesso piano è stato
già adattato alla struttura dello stato di transizione, si è abbassata l’energia di attivazione.
Il carbossile di Glu-35 (pKa 6,0) è in una tasca relativamente idrofobica ed è in forma indissociata a pH 5 
il residuo di acido glutammico ha un pKa di 6 è protonato
Il carbossile di Asp-52 (pKa 3,5) è in una zona relativamente polare ed è dissociato a pH 5  è deprotonato
e fa da base

Glu-35 dona il protone all’ossigeno del legame glicosidico, provocando la rottura del legame e la
formazione di un carbocatione sul C1 del MurNAc stabilizzato dall’ossigeno.
Asp-52 stabilizza il carbocatione (stato di transizione), si ipotizza un’interazione elettrostatica tra
l’aspartato e lo stato di transizione, importante perché stabilizzandolo si abbassa ancora di più l’energia di
attivazione del processo.
Entra l’acqua
Glu-35, in forma basica, strappa un protone ad una molecola di acqua, l’OH- attacca, si scinde il legame,
fuoriesce lo zucchero generando un ossidrile che neutralizza il carbocatione sul C1 del NAM
Passiamo adesso ad un secondo meccanismo enzimatico
Carbossipeptidasi A(CPA)
 ➢  Una esopeptidasi secreta come precursore nel succo pancreatico, che idrolizza il legame
peptidico al C-terminale di una sequenza peptidica scinde l’ultimo amminoacido C terminale della
sequenza peptidica.
 ➢ Questo enzima esibisce una elevate specificità riguardo alla posizione del legame peptidico, ma
non discrimina in base all’identità del residuo amminoacidico C-terminale, ma discrimina in base
alla posizione dell’amminoacido C-terminale.
 ➢ Scinde il legame con qualunque residuo C-terminale, ad eccezione di arginina (Arg), lisina (Lys),
due amminoacidi prettamente basici, o prolina (Pro), con il suo caratteristico sistema ciclico.
Ci sono, inoltre, delle efficaci distinte:
 ➢ La carbossipeptidasi A è comunque più efficace nella rimozione di residui terminali con grandi
catene laterali alifatiche o aromatiche, in genere catene laterali non cariche. (Tyr, Trp, Phe, Leu, Ile)
 ➢ La struttura tridimensionale della carbossipeptidasi A è stata elucidate da William Lipscomb ad
Harvard nel 1967, tempi relativamente recenti.
 ➢ E’ una proteina globulare compatta, caratterizzata da una singola catena polipeptidica di 307
amminoacidi ed è un metalloenzima con un catione Zn essenziale per l’attività enzimatica.

Il sito attivo della CPA

➢ Il catione Zn2+ è collocato in una tasca vicino alla superficie dell’enzima ed è tetracoordinato con due
residui di istidina (His 69 e His 196), quindi, con l’azoto delle due istidine, con il carbossilato di un residuo di
glutammato (Glu 72) e una molecola d’acqua.

Gli studi di Lipscomb hanno richiesto

l’identificazione di strutture con varie
metodologie basate su molecole che
simulavano il substrato, ma erano più
semplici come dipeptidi. Sono state
studiate infatti varie molecole
dipeptidiche e il loro inserimento, la
loro interazione all’interno del sito
attivo dell’enzima.
In questa foto vediamo un esempio di
dipeptide nel sito attivo dell’enzima,
sulla base del modello
rappresentativo di Lipscomb.
Vediamo una tirosina e una glicina. La
tirosina ha il residuo C-terminale e il
secondo amminoacido è legato ad
esso tramite legame peptidico, oltre questo secondo amminoacido, ovviamente, la catena peptidica
potrebbe continuare. Quello che viene scisso è il legame sul C-terminale della tirosina.
Vediamo quindi come si dispone il residuo che subisce la scissione nel sito catalitico. La catena laterale
dell’amminoacido riconosce efficientemente alcuni tipi di amminoacidi, si va a depositare la catena
aromatica all’interno della tasca apolare della regione del sito attivo. Qui è molto importante la presenza di
un’arginina 145, che interagisce con un’interazione elettrostatica con il carbossile C-terminale. È
importante perché la scissione avviene sempre sull’amminoacido terminale. Lo zinco 2+ nel sito attivo è
coordinato con le due molecole di istidina, con il glutammato, ma anche con il carbonile del legame
peptidico che deve essere scisso. Anche la tirosina 248 è importante in quanto forma un legame a H con il
gruppo amminico del legame peptidico che deve essere idrolizzato, mentre il glutammato coordina la
molecola d’acqua che poi va ad interagire con il gruppo amminico della glicina, che in questo caso è libero,
ma in un polipeptide il gruppo amminico sarà all’interno di una sequenza di amminoacidi.
Nel processo di idrolisi, la tirosina 248 forma un legame a idrogeno e subisce una rotazione, si sposta e
induce il movimento di altri due residui, creando una sorta di adattamento indotto al livello del substrato
nei confronti del sito attivo dell’enzima. Una volta che è avvenuto questo adattamento, la cavità del sito
attivo si chiude ed espelle 4 molecole di acqua.

Vediamo adesso come avviene il processo catalitico, prendendo come spunto un tripeptide, la
benzoilglicilfenilalanina.
Il primo in alto è
all’amminoacido C-terminale
legato all’arginina con
un’interazione elettrostatica,
con l’OH della tirosina. Abbiamo
poi la molecola d’acqua
coordinata con lo zinco 2+, che
coordina anche gli altri due
residui amminoacidici, ed è
pronta ad interagire con il C=O
del legame peptidico che deve
essere scisso. Il glutammato
stacca il protone dall’acqua,
agevolmente, perché l’ossigeno
è coordinato con lo zinco, quindi
l’acidità del protone è
accentuata. Si genera un
nucleofilo OH- che va ad
attaccare il C acilico del legame
peptidico che deve essere scisso. Si forma, dunque, un intermedio tetraedrico, lo zinco complessa sempre
sia l’acqua che l’ossigeno carbonilico, la coppia di e- torna a ricostituire il gruppo acilico, mentre il residuo
acido del glutammico 270 va a protonare l’azoto, va a captare il legame che viene scisso. A questo punto è
fuoriuscito l’amminoacido terminale e resta la porzione di peptide in cui si è rotto il legame peptidico con
l’amminoacido C-terminale. Perché questo meccanismo catalitico possa funzionare sono necessari almeno
2 legami peptidici; se non ci fosse uno dei due mancherebbero delle interazioni. È dunque un meccanismo
che presiede sempre alla scissione di un polipeptide sull’amminoacido C-terminale. Si tratta, infatti, di un
enzima MOLTO SELETTIVO SULLA POSIZIONE, ma poco selettivo rispetto al tipo di amminoacido terminale,
pur avendo delle importanti preferenze.

Un altro meccanismo catalitico che studieremo è quello dell’alcol deidrogenasi. Un meccanismo che
abbiamo già visto dal pdv del coenzima NAD+/NADH e abbiamo visto come sia fondamentale il ruolo del
coenzima sul trasferimento di idruro tra questo coenzima, appunto, e il substrato, dando, quindi, un
processo di ossidazione e/o riduzione.
Etanolo in presenza del NAD+, all’interno del sito attivo dell’enzima alcol deidrogenasi, trasferisce
l’idruro NADH + H+, si forma l’acetaldeide, che può essere ulteriormente ossidata ad acetato attraverso
un’aldeide deidrogenasi che utilizza ancora la coppia NAD+/NADH.

➢ L’Alcol Deidrogenasi (ADH) appartiene alla famiglia enzimatica delle ossidoreduttasi.

➢ Si trova in alte concentrazioni nel fegato umano e nei reni.
➢ Il ruolo primario della ADH negli uomini è detossificare l’etanolo ingerito convertendolo in acetaldeide,
una reazione che richiede NAD+ come coenzima
➢L’acetaldeide formata, una molecola più tossica dell’etanolo, viene velocemente convertita in acetato e
altre molecole facilmente utilizzabili dalla cellula

 Gli esseri umani hanno almeno 9 forme conosciute di ADH

 ADH esiste come forma monomerica o dimerica, come omo- o etero-dimero, poichè esistono 2
differenti tipi di monomeri
 I due tipi sono E (etanolo) and S (steroidi), attive rispettivamente per etanolo e steroidi. Sebbene
abbiano differenti specificità, sono quasi identiche (374 residui)
 Quindi, i possibili tipi di ADH sono: EE, SS, e ES ibridi.
 EE (omodimerica) è la forma più comune rappresenta il 40-60% delle ADH presenti nel corpo
umano;
 EE ADH ha un peso molecolare di circa 80.000
 Nella sua struttura terziaria sono presenti 8 catene, 60 eliche, e 74 beta strands nell’ADH
 Ogni monomero del dimero ha 2 subunità
 Ognuna delle due subunità ha un binding site per il cofattore: NAD+/NADH e due per lo ione Zn2+
 È attivata da cianato (NCO-) e inibita dai metalli pesanti e da agenti chelanti che bloccano gli ioni ZN
2+-
Qui vediamo alcune omologie tra specie diverse una EE di
ADH umana e una EE ADH equina. Ci sono delle grosse
similitudini strutturali e il meccanismo di funzionamento è
sostanzialmente analogo.

Un’elevata presenza è quella dell’Alcol deidrogenasi epatica (LAD) che svolge il meccanismo di
detossificazione.
 Appartiene alla famiglia degli Zinco metallo enzimi
Ogni subunità del dimero è divisa in due domini: uno lega il coenzima NAD+ e l’altro è il dominio
catalitico dove va a legarsi il substrato. Questi due domini, quindi, si avvicinano ed avviene il
meccanismo catalitico grazie anche alla reazione redox catalizzata dal NAD.
 Il NAD+ svolge questa funzione legandosi al dominio proprio con l’anello nicotinammidico proteso
verso il dominio catalitico
  La tasca del sito attivo che lega il substrato si trova tra i due domini ed è capiente e ricca di residui
idrofobici
 Solo le regioni che legano lo ione Zn, la porzione nicotinnamidica e la Ser48 sono regioni polari.
 Abbiamo detto che ci sono 2 atomi di zinco su ogni monomero che svolgono, però, funzioni diverse:
1 con funzione strutturale, genera una serie di interazioni elettrostatiche con residui amminoacidici
e contribuisce a generare la struttura tridimensionale dell’enzimma; l’altro, invece, si trova
all’interno del sito attivo dell’enzima e partecipa, quindi, allo svolgimento della funzione catalitica

❖ Interazione dei Monomeri:

 Due residui sono direttamente responsabili per l’appaiamento dei monomeri dell’ADH
 His-105 e Tyr-286 su ogni monomero interagiscono tra loro per “sigillare” la struttura, sono
responsabili dell’appaiamento tra i due monomeri.
 La catena laterale anellare dell’His-105 interagisce con la catena laterale della Tyr-286 dell’altro
monomero
 I monomeri sono allineati in maniera anti-paralella l’uno all’altro l’istidina 105 su un monomero
va ad interagire con la tirosina 286 sull’altro monomero, e viceversa.
Questa è, appunto, una rappresentazione del dimero.
Vediamo le due regioni in cui avviene l’interazione tra i
due monomeri, poste l’una di fronte all’altra (istidina 105
interagisce con una pi-greco-stacking con la tirosina
interazione degli elettroni dei due anelli aromatici). I due
beta-strend al centro, affacciati l’uno sull’altro in una
disposizione antiparallela, caratterizzano una fessura tra
le due unità monomeriche. (giallo e verde)

Questo è un altro tipo di

rappresentazione dell’enzima. Notiamo
i due beta strend al centro con
andamento antiparallelo, mentre,
all’interno di ogni subunità ci sono
diversi beta strend (foglietti beta)
paralleli tra loro.
Questi sono due monomeri uguali,
identici, ma appaiati tra loro in
maniera antiparallela.

In questa immagine vediamo

simbolicamente rappresentati il sito
attivo e la regione importante della
serina 48 che interagisce con l’acqua
legata allo zinco che a sua volta è
coordinato con due cisteine (174 e
46) e con l’istidina 67.
Sulla destra notiamo un altro tipo di
rappresentazione. In alto abbiamo la
regione che lega il NADH, che è disposto spazialmente affacciato verso il substrato, il quale è a sua volta
coordinato con lo zinco 2+ del sito catalitico e lo zinco è coordinato con le due cisteine e l’istidina.
(Adesso ci riferiamo ai pallini nero e celeste indicati dalla freccia). Qui avviene la reazione: il NADH dona
l’idruro al carbonile dell’acetaldeide (pallino nero), accettore di idruro, fortemente attivato dal legame con
lo zinco 2+, riduzione. Nel caso opposto avremmo un alcol al posto dell’aldeide che interagisce con lo ione
zinco e il NAD+ al posto del NADH. L’alcol, in questo caso, trasferirebbe l’idruro all’anello del NAD+
generando NADH. La reazione, quindi, è reversibile e può andare in entrambe le direzioni.
Inoltre...
I due siti attivi sono situati in fessure tra il sito di binding del coenzima e i domini catalitici. L’Etanolo si lega
ad un core idrofobico formato da nove amino acidi, che avvolgono il substrato. NAD+ si lega ai residui 293-
298 e causa una modifica conformazionale del sito attivo con una rotazione di 10 gradi. Questa rotazione è
importante perchè porta la proteina dalla sua forma apo “aperta" a quella olo "chiusa": il dominio
catalitico che lega il substrato si avvicina al dominio di legame del coenzima, si restringe la fessura del sito
attivo e viene esclusa acqua, cosa vitale per l’attività dell’ADH. Ser 48 coopera nel trasferimento protonico.
Questa serina 48 si
coordina, forma un
legame ad H, con l’OH
dell’alcol legato allo
zinco 2+, avviene il
trasferimento di idruro
al NAD+ che diventa
NADH e
contemporaneamente
si forma un doppio
legame carbonio ossigeno (C=O), con l’ossigeno legato allo zinco, mentre il protone viene ceduto
all’ossigeno della serina 48. Abbiamo quindi la cessione di un idruro da un lato e di un protone dall’altro,
con sostanzialmente la perdita di un H2. Se lo leggiamo al contrario è un processo di riduzione, cioè la
serina 48 cede un protone all’ossigeno, mentre il NADH cede un idruro.

Scendiamo ancora un po’ più nel

dettaglio. Qui vediamo rappresentata
la tasca idrofobica in cui viene
alloggiato il substrato, costituita da
una serie di amminoacidi idrofobici.
Abbiamo poi, due zinco 2+, uno
strutturale (dietro) e uno catalitico,
abbiamo cisteine e istidina che
complessano lo zinco catalitico e
l’ossigeno coinvolto nell’intero
processo catalitico.

Andiamo adesso a rivedere in dettaglio il

meccanismo descritto prima. Lo zinco 2+
legato ai residui di cisteina e istidina
complessa l’ossigeno dell’etanolo,
facilitando il trasferimento del protone
verso il residuo della serina 48. C’è poi l’interazione della serina 48 con l’ossigeno dell’anello zuccherino del
NAD che a sua volta interagisce con l’istidina 51, alla fine abbiamo, quindi, un trasferimento di protne
abbastanza elaborato. Il protone della serina, infatti, va a sostituire quello dell’anello zuccherino del NAD,
mentre quello della serina viene ceduto all’istidina che resta nella sua forma protonata. Quello che è
importante è il passaggio con formazione del doppio legame C=O, trasferimento di idruro e spostamento
della coppia di elettroni verso l’azoto carico positivamente. Molto importante è l’interazione con lo ione
zinco perché abbassa notevolmente il pka del gruppo alcolico che, da un valore di circa 14/15, passa ad un
valore di 6 e questo agevola la rimozione del protone e tutto quello che viene di seguito.

Conclusioni
 L’alcol Deidrogenasi è l’offensiva del corpo umano contro la tossina alcolica ingerita.
 La specificità dell’ADH per il substrato è bassa, con molti alcoli potenziali target. Es: Metanolo →
Formaldeide tossica il metanolo è molto tossico e la formaldeide non può essere eliminata (dalla
grappa bisogna eliminare ogni forma di metanolo che potrebbe formarsi durante la sua produzione,
con un processo di distillazione, grazie al quale vengono eliminati anche alcoli con PM maggiore che
potrebbero avere gusti sgradevoli).
 Una volta legato allo zinco, comunque, una modifica conformazionale assicura un forte legame.