LEZIONE 17

Biocatalisi
Biocatalisi può essere definita come l’utilizzo di catalizzatori naturali, gli enzimi, per portare a termine
trasformazioni, di laboratorio o industriale, a carico di composti organici.
Possono essere usati per tale scopo sia gli enzimi che sono stati isolati, purificati e conservati in forma
attiva, cioè senza denaturarsi, perché altrimenti perderebbero la loro attività catalitica, da vari tessuti,
questo prevede metodi che non ne danneggi la struttura terziaria e quaternaria; sia quelli ancora presenti
all’interno di cellule viventi possono essere usati per tale scopo.
C’è interesse nei riguardi di questa biocatalisi poiché possono essere utilizzati dei catalizzatori naturali che
sono stati sviluppati attraverso un’evoluzione che è andata avanti per milioni di anni.
•La natura ha sviluppato gli enzimi per 3x109 anni come catalizzatori con elevata selettività e
biodegradabili.
•Gli enzimi sono catalizzatori efficienti con velocità di reazione fino a 1012 volte più alte; questo avviene in
condizioni ambiente, condizioni compatibili con aspetti di assoluto rispetto dell’ambiente, altamente
interessante dal pdv di una serie di problematiche legate a sviluppo di sottoprodotti, processi di
contaminazione ecc…
•Ci sono equivalenti enzimatici per quasi ogni tipo di reazione. (Eccezione di reazioni che richiedono
situazioni drastiche non compatibili con l’uso di enzimi: Grignard, Diels-Alder, etc.)
•Catalizzano reazioni enantioselettive agiscono selettivamente su determinati enantiomeri o ne
generano solo alcuni in determinate situazioni.
•Molti processi economicamente vantaggiosi basati su catalisi enzimatiche sono sfruttati industrialmente.

Date importanti nella scienza e tecnologia enzimatiche alla fine dell’ottocento viene definita per la prima
volta la funzione dei catalizzatori, abbiamo poi le osservazioni di Fisher che studia e spiega le proprietà e
selettività delle glicosidasi, che scindono selettivamente alcuni legami glicosidici (alfa, beta glicosidasi
legami glicosidici di tipo alfa o beta).
 1883 Ostwald: Definition of catalysts
 1894 Fischer: Lock and key concept to explain the selectivity of glycosidases
 1900 Kastle and Loevenhardt: Pancreas lipase acts reversible; hence, it is a catalyst
 1903 Dakin: Enantioselective hydrolysis of ethyl mandelate by lipase
 1936 Sym: lipase catalysis in organic solvents viene sviluppato un approccio sulle lipasi da
usare in numerose reazioni organiche, soprattutto nei solventi organici, sono ampiamente
utilizzate in molti processi.
 1954 Synthesis of enantiomerically pure L-amino acids using aminoacylase sviluppo della
sintesi di sostadiamminoacidi in forma enantiomericamente pura usando le amminocilcasi.
 1969 Tanabe: full scale production of L-amino acids, using immobilised aminoacylase
 1960 Penicillin acylase identified by four research groups independently
 1988 Enzymatic hydrolysis of penicillin G and V outperforms the chemical process, which is
subsequently swept from the market  impiego di enzimi in molte forme di penicilline, importante
nello sviluppo, nella produzione industriale e nel marketing di questi antibiotici.
 1985 Klibanov: Use of enzymes in organic media rediscovered riscoperta e studio nell’impiego
degli enzimi in solventi organici.
 1994 Reetz: Lipase-catalysed enantioselective amine acylation in anhydrous medium ulteriori
sviluppi delle lipasi
 2002 BASF: 1000 ton/a amine resolution plant started up (present capacity: 3500 t/a) 
produzione di potenti impianti industriali con importunate produttività.

L’utilizzo piu’ comune e’ quello nel mercato alimentare (food and drink) ed in particolar modo nella
produzione del vino, birra, formaggio, etc che sono dipendenti dall’effetto di microorganismi.
 La tecnologia enzimatica è attualmente stabile su larga scala nella manifattura di vari chemicals,
prodotti chimici, come Acrilamide
  Più recentemente l’interesse si è esteso nelle aree della sintesi organica, per la sua proprietà di
produrre prodotti enantiomericamente puri e soprattutto dei prodotti farmaceutici.
Gli enzimi mostrano tre tipi di selettivita’:
Chemoselettivita’: Poiche’ lo scopo di un enzima e’ di agire su di un singolo gruppo funzionale, altre
funzionalita’ sensibili, che normalmente reagirebbero in condizioni CHIMICO-ORGANICHE, vengono
completamente preservate. Come risultato, le reazioni biocatalizzate tendono ad essere ‘pulite’ ed il lavoro
di purificazione dei prodotti dalle impurita’ dovute a reazioni collaterali puo’ essere omesso o ridotto.
L’importanza di questa proprietà è proprio quella di poter distinguere selettivamente il gruppo funzionale
su cui reagire.
Regioselettivita’ e Diastereoselettivita’: In base alla loro complessa struttura 3D, gli enzimi posso
distinguere tra gruppi funzionali, anche uguali dal pdv chimico, che sono situati in diverse regioni delle
molecole di substrato se è una reazione di tipo ossidativo del gruppo OH, possono esserci più gruppi OH
all’interno della molecola, ma l’enzima andrà a reagire selettivamente, o quasi selettivamente, su un
singolo gruppo presente in una determinata posizione, ovviamente questo deve essere studiato e messo a
punto in base all’obiettivo che si intende raggiungere.
Enantioselettivita’: Poiche’ tutti gli enzimi sono fatti da L-alfa-aminoacidi, essi sono catalizzatori chirali.
Come conseguenza, ciascun tipo di chiralita’ presente nel substrato e’ riconosciuta durante la formazione
del complesso enzima-substrato discriminare la chiralità del substrato durante la reazione. L’enzima
potrà essere più attivo su un substrato o su un altro, oppure, ad esempio, se su un substrato c’è un gruppo
pro-chirale, su cui interviene la catalisi enzimatica, l’enzima sarà in grado di discriminare nella posizione di
attacco quel gruppo pro-chirale e generare selettivamente un determinato enantiomero. Un substrato pro-
chirale, quindi, può essere trasformato in un prodotto otticamente attivo ed entrambi gli enantiomeri di un
substrato racemico possono reagire con diversa velocita’.

Pertanto l’interesse verso la biocatalisi e’ principalmente dovuto alla necessita’ di sintetizzare composti
enantiopuri o come prodotti finiti oppure come building blocks chirali che possono essere usati in ulteriori
processi di sintesi per la produzione di importanti molecole come farmaci e prodotti agrochimici.
Un altro vantaggio importante della biocatalisi e’ quello di essere vantaggiosa da un punto di vista
AMBIENTALE, in quanto gli enzimi possono essere completamente degradati senza problemi di
inquinamento. Le reazioni sono generalmente pulite con pochi prodotti secondari e pochi problemi di
inquinamento.
Inoltre, gli enzimi attivi agiscono in condizioni molto blande che minimizzano problemi di reazioni
collaterali come la decomposizione, l’isomerizzazione, la racemizzazione e i riarrangiamenti che sono
problemi importanti nelle metodologie tradizionali. Tuttavia questi enzimi sono molecole delicate che
richiedono processi di purificazione e preparazione complessi, devono essere conservati e mantenute in
condizioni che ne permettono l’utilizzo e ci sono dei limiti in relazione alle loro potenzialità di equilibrio. Un
altro limite problematico è quello che riguarda gli enzimi che hanno bisogno di cofattori. Il problema
principale è il costo del cofattore, il quale viene anche consumato, non sempre i processi di rigenerazione è
possibile, e questo comporta un aumento dei costi di produzione soprattutto in processi industriali
complessi che possono limitare l’uso di questi enzimi e di questi processi di biocatalisi. Una modalità molto
interessante di utilizzo di questi enzimi oggigiorno è quella di usare questi enzimi in maniera bloccata, gli
enzimi possono essere caricati, bloccati su delle resine all’interno di colonne o di reattori attraverso cui
vengono fatti passare i substrati in miscele e nel corso di questo flusso, sono infatti reattori a flusso in cui ci
sono gli enzimi ed eventualmente gli enzimi bloccati insieme a possibili cofattori, il substrato entra da una
parte e il prodotto esce dall’altra. Questi processi, quando vengono messi a punto in modo corretto, sono
estremamente importanti soprattutto dal pdv industriale perché comportano produzioni altamente
efficienti.
Abbiammo qui qualche grafico ilustrativo, ci
sono i valori in milioni di euro di sistemi
enzimatici utilizzati in numerosi campi.
Dall’industria farmaceutica a quella
alimentare. Vediamo le vendite di questi
enzimi nel corso degli anni, oggi a livelli
elevatissimi. Infine il grafico B riguarda la
forza-lavoro impiegata in industrie che
utilizzano tecniche di biocatalisi, ci si rende
conto del forte incremento, a testimonianza
sempre della sua importanza.
Ad esempio l’aspartame, dolcificante
sintetico, viene utilizzato grazie alla termo
lisina in forma imbolizzata attraverso colonne
o reattori, in cui l’enzima viene bloccato
all’interno di resine e attraverso cui si fa
passare la miscela di reagenti e substrato e
alla fine si ottiene il prodotto finale. Oppure la
produzione di amminoacidi in forma
enantiomericamente pura in cui si utilizzano
le amminoacilasi in forma libera. Le
compagnie che utilizzano questa biocatalisi
sono varie.
Esempi in cui queste tecnologie sono
utilizzate.

Processo aspartame: acido

aspartico + miscela di D e L
estere metilico della
fenilalanina vengono fatti
reagire in un processo a
flusso con enzima
immobilizzato, l’aspartico
è protetto sul gruppo alfa-
amminico. La termolisina
fa avvenire la formazione
del legame peptidico tra il
gruppo carbossilico
dell’aspartato e il gruppo
amminico della
fenilalanina esterificata.
Qui non è necessario
proteggere la funzione carbossilica perché l’enzima è regioselettivo e reagisce selettivamente con il gruppo
carbossilico. Si forma il legame peptidico e, inoltre, l’enzima è specifico verso la forma naturale L
dell’estere della fenilalanina e si forma il dipeptide L-aspartcio-L-fenilalanina, mentre la forma D resta
naturale. È, dunque, possibile lavorare su un prodotto racemico o sulla forma enantiomericamente pura. La
forma D può essere racemizzata e si riutilizza il racemato in un altro ciclo, cosicchè possiamo utilizzare tutta
la forma racemica, perché attraverso la rigenerazione della forma racemica si ottiene sempre anche la
forma L utilizzata dall’enzima. Il prodotto di reazione, l’aspartame, viene liberato dal gruppo protettore e
anche l’estere può essere eventualmente idrolizzato, ma non è questo il caso, poiché l’aspartame è la
forma estera di questo dipeptide.

• Ossidoreduttasi: produzione di alcoli chirali e idrossiacidi (ADH). La rigenerazione dei cofattori

rappresenta il costo principale, a meno di non fare la reazione in un sistema cellulare.

Questo è un esempio di reduttasi isolata

dal batterio Rhodococcus ruber, in grado di
produrre selettivamente alcoli chirali. Si
riduce un chetone con l’impiego cellulare
di questo batterio e si ottiene
esculsivamente un enantiomero puro. Si
può usare sia la forma cellulare che
l’enzima isolato. È richiesto un cofattore, il
NADH, e quindi il limite applicativo è il
consumo del NADH che, come abbiamo
detto prima, è costoso, e quindi se si
vogliono abbattere i costi, deve essere in
qualche modo rigenerato attraverso una
reazione, ad esempio, con un alcol
isopropilico che si ossida ad acetone e chetone e rigenera il NADH.

Esempi
Nitrile idratasi: due applicazioni commerciali: Acrilamide e nicotinamide

Anche qui vediamo altri enzimi o sistemi

celullari di Rhodococcus, Rhodocruis. Viene
utilizzato un nitrile idratasi di questo
batterio per cnvertire un nitrile in ammide.
Usato per la produzione industriale
dell’acrilammide.a partire dall’acrilonitrile
oppure della nicotinammide a partire dalla
3-cianopiridina.

Esempi
Esempi di enzimi usati in una serie di biotrasformazioni di beta lattami e I loro substrati primari.
 Questi enzimi sono usati poi
anche nel campo delle
penicilline cefalosporine. Qui
sono tutti esempi di enzimi
che vengono utilizzati in una
serie di biotrasformazioni per
la produzione di beta lattami.
Si può agevolmente
modificare il gruppo acilico
che lega l’NH della penicillina
o cefalosporina facendo reagire con determinati substrati che vanno a sostituire o funzionalizzare questa
posizione. Questi sono gli enzimi che sono stati studiati, isolati, purificati e che vengono ampiamente
utilizzati nel settore farmaceutico per produrre una serie di penicilline e cefalosporine. Sono tutti processi
biocatalici.

Un settore ampiamente utilizzato è quello delle lipasi.

• Lipasi: sono gli enzimi più frequentemente utilizzati in chimica organica perché:
 Sono di facile reperibilità e facilmente utilizzabili, ce ne sono di molti tipi;
 Sono molto attive anche in ambienti non acquosi un altro limite dei fattori enzimatici è quello di
poterli utilizzare anche in ambienti acquosi e questo per le lipasi è possibile solventi organici o
misto=> solvente organico e acqua;
 Eccellente stereoselettività;
 Azione su diversi substrati esterei ampia versatilità di queste reazioni;
 Possibilità di utilizzo di altri nucleofili in reazione (al posto dell’acqua) si possono far reagire esteri
anche con altri nucleofili e quindi ottenere reazioni e prodotti diversi;
 Utili nelle risoluzioni cinetiche.

DOVE VENGONO UTILIZZATE?

Queste lipasi vengono utilizzate in un’enorme varietà di reazioni: in campo alimentare, campo della sintesi
chimica di vari prodotti, quali
esteri, detergenti,
emulsificanti, polimeri. Sono
utilizzate anche per la
produzione del Biofuels,
biodiesel; trovano svariate
applicazioni in campo medico
e farmaceutico per la
separazione di enantiomeri
nella miscela racemica; in
campo amientale; carta,
tessile, pelli ecc..
Esempi di biocatalisi asimmetrica
Vediamo alcuni aspetti che riguardano l’utilizzo di processi di biocatalici per l’ottenimento di composti
enantiopuri.
L’uso della biocatalisi per ottenere composti enantiopuri puo’ essere divisa in due diversi metodi:
1. Risoluzione cinetica o enzimatica di una miscela racemica.
2. Sintesi asimmetrica diretta biocatalizzata.
Nella risoluzione cinetica o enzimatica di una miscela racemica, la presenza di un enzima chirale (agisce
selettvamente solo su uno dei due enantiomeri) converte uno degli enantiomeri nel prodotto con una
velocita’ maggiore dell’altro enantiomero. Si chiama cinetica perché la selettività è legata alla velocità di
reazione, quindi la velocità di trasformazione del substrato è maggiore per un enantiomero rispetto
all’altro. Quindi la miscela racemica e’ trasformata in una miscela di 2 diversi prodotti, uno su cui ha agito
l’enzima e uno su cui l’enzima non ha agito o non ha agito abbastanza. I due prodotti non sono più
enantiomeri, sono completamente diversi e possono essere facilmente separati secondo le normali
metodologie (cromatografia, distillazione, cristallizzazione ecc…). La massima resa teorica e’ del 50%
(teorica siamo riusciti a separare selettivamente un enantiomero dall’altro) poichè una resa maggiore
del 50% significa che anche l’isomero sbagliato ha reagito dando luogo ad un basso eccesso enantiomerico.
Di solito non si raggiunge mai questa vetta teorica perché se si spinge troppo il processo si può arrivare a
convertire anche una parte dell’altro enantiomero, poiché la selettività di solito non è quasi mai al 100%
dell’enzima e questo genera delle impurità nel prodotto.
Tali reazioni devono quindi essere terminate prima che
sia raggiunto l’equilibrio.

Se è possibile condurre tale risoluzione in condizioni in

cui i due substrati possono essere racemizzati in
continuo (come abbiamo visto prima nella produzione
dell’aspartato), tutto il substrato potrebbe in teoria
essere convertito in un prodotto enantiomericamente
puro. Se il prodotto di substrato riproduce una parte di
miscela racemica, questa può essere risolta
successivamente e il processo, in teoria, può continuare
fino alla completa conversione del prodotto
enantiomericamente puro.
Questa strategia è chiamata risoluzione dinamica.
Risoluzione Enzimatica
➢ Gli Enzimi catalizzano selettivamente l’idrolisi delle ammidi o degli esteri di un L- amminoacido
(configurazione S).
Questo è un esempio di come si risolve una miscela racemica di un R,S o D,L di amminoacido. Si fa reagire
con anidride acetica, si acetila il gruppo amminico, si fa reagire con della carbossi peptidasi, enzima
proteolico, che scinde i legami peptidici. Questo enzima, infatti, scinde il legame O=C-NH selettivamente o
più rapidamente per l’amminoacido naturale, quindi S o L, mentre l’altro resta acilato. A questo punto
possono essere agevolmente separati e si ottengono due prodotti enantiomericamente puri al 50%. Il
secondo esempio è un analogo del primo. Cambia, però, l’enzima, che in questo caso è un’amminoacilasi
da rene di maiale, enzima che scinde legami peptidici. Questo stesso processo può essere fatto con delle
lipasi, in cui si fa reagire il carbossile invece di bloccare NH, si ottengono degli esteri degli amminoacidi che
si fanno reagire con questi enzimi per ottenere sempre gli stessi prodotti di reazione.

Nella sintesi asimmetrica biocatalizzata, una unità/substrato achirale viene trasformata in chirale in modo
che i diversi enantiomeri siano formati in quantita’ differente. In questo caso vale la selettività dell’enzima
nel generare con velocità/cinetiche diverse le due forme enantiomerche. In alcuni casi questa selettività
può essere eccessivamente elevata e generare in maniera quasi esclusiva, con un elevato eccesso
enantiomerico, solo uno dei due enantiomeri. La chiralita’ e’ introdotta ovviamente dal catalizzatore.
•I lieviti, ad esempio, sono dei biocatlizzatori
enantioselettivi per la riduzione dei chetoni ad
alcoli.
Qui vediamo un betachetoestere che viene ridotto
con lieviti in un solvente organico e produce
esclusivamente una forma enantiomerica con un
eccesso enantiomerico del 94%, una resa enantiomerica eccellente.

•In un lavoro scientifico recentemente pubblicato, un mutante del batterio Candida antarctica e’ stato
trovato come un efficiente catalizzatore per l’addizione di Michael dell’acroleina con l’acetilacetone a 20°C
in assenza di solventi addizionali. (un altro esempio applicativo)

•Un altro studio ha dimostrato come la nicotina racemica prodotta da una sintesi organica non selettiva
(una miscela degli enantiomeri R e S riportati nello schema) puo’ essere de-racemizzata mediante una
procedura ‘one-pot’ che coinvolge la mono-ammina ossidasi isolata dal batterio Aspergillus niger che e’
capace di ossidare solo la ammina dell’enantiomero S alla corrispondente immina (2). Lascia quasi
intoccata la forma R, e coinvolgendo una coppia riducente ammoniaca/borano, puo’ ridurre l’immina ad
entrambe le ammine ( R e S).
•In questo modo, l’enantiomero S sara’ costantemente consumato dall’enzima mentre l’enantiomero R si
accumula e può essere isolato alla fine.
Enzimi e Solventi Organici
È utile ed importante utilizzare questi enzimi in solventi organici, questo facilità la solubilità di alcuni
substrato e aiuta anche a prevenire reazioni collaterali idrolitiche portate dall’acqua.
 Prevenzione di side-reactions idrolitiche escludendo l’acqua;
 Solubilità migliore di reagenti idrofobici e prodotti.
 L’anidricità del mezzo è un requisito essenziale in reazioni non-idrolitiche in presenza di lipasi.
 Comuni solventi organici utili per molti tipi di reazioni enzimatiche, come eptano, toluene, TBME,
tert-butil alcohol, ..... non sembrano interagire molto con gli enzimi.
 DMSO, DMF interagiscono fortemente e rompono legami tra proteine intermolecoleri, provocando
la dissoluzione, ma interferendo con i legami intramolecolari, risultando in denaturazione e
disattivazione;
 Gli enzimi sembrano non tollerare forti interazioni con nulla, eccetto che con l’acqua.
Conclusioni
 La biocatalisi ha una lunga tradizione
 Le tecnologie attuali bio-ingegneristiche stanno alimentando l’interesse in campo organo-
farmaceutico.
 Tecnologie ricombinanti: low cost possono contribuire a questi processi di biocatalisi abbattendo
i costi produttivi.
 Uso con solventi non acquosi
 Nuovi approcci nascono continuamente con uso di sistemi cellulari interi o sistemi enzimatici
supportati anche con utilizzo di sistemi a flusso.