Dipartimento di Scienze degli Alimenti e del Farmaco

C. di S. Magistrale in: Scienze e Tecnologie Alimentari

A.A. 2020-2021 - 2° anno – 1° semestre
insegnamento: Metodologie di progettazione dei processi alimentari
6 CFU (42 ore)
docente: Prof. Massimiliano Rinaldi

• Materiale didattico fornito dal docente

3.3 – Validazione di confezionatrici asettiche

Validazione confezionatrici asettiche

“PROCESS VALIDATION is defined as the collection and evaluation of data, from the
process design stage through production, which establishes scientific evidence that a
process is capable of consistently delivering quality product.”
“PROCESS VALIDATION involves a series of activities taking place over the lifecycle
of the product and process.”

Validazione confezionatrici asettiche

Validazione confezionatrici asettiche
 Building and Capturing Process Knowledge and Understanding

Validazione confezionatrici asettiche

 Stage 2 ― Process Qualification

Validazione confezionatrici asettiche

 Stage 3 ― Continued Process Verification

Validazione confezionatrici asettiche

 Documentation and Analytical Methodology

Validazione confezionatrici asettiche

 Obblighi US FDA per LACF confezionati asetticamente

Validazione confezionatrici asettiche

 U. S. Food and Drug Administration
Center for Food Safety and Applied Nutrition

Aseptic Packaging System Supplement

to
What You Need to Know about Establishment Registration
and Process Filing for Acidified and Low-acid Canned Foods
2001

Vedere: 33.1 - FDA Instructions Aseptic LACF

Validazione confezionatrici asettiche

 Esempi di documentazione supplementare
allestita per esportare negli USA
prodotti trattati e confezionati asetticamente

Validazione confezionatrici asettiche

 Modalità di validazione secondo US FDA

Validazione confezionatrici asettiche

 Esempio di rapporto di validazione

Validazione confezionatrici asettiche

Validazione di una riempitrice asettica secondo EHEDG

Le linee guida EHEDG Doc. 3 “Microbiologically safe aseptic packing of food

products” - 1993, come pure il più generale Doc. 11 “Hygienic packing of food
poroduct” - 1993, hanno carattere metodologico e non sono utilizzabili per una
certificazione di conformità.
Una riempitrice asettica può essere certificata in conformità alla linea guida EHEDG più
generale Doc. 8 "Hygienic equipment design criteria" - second edition 2004. A tale fine,
peraltro, devono essere rispettati tutti i requisiti previsti. Fino ad ora non sono state
rilasciate certificazioni per macchine riempitici asettiche complesse.
Quando vi sono dubbi sulla effettiva igienicità progettuale e costruttiva, in genera si ricorre
ai test di pulibilità, oltre che a quelli di presterilizzabilità e di mantenimento dell’asepsi.
La linea guida metodologica specifica EHEDG, Doc. 21 “Challenge tests for the
evaluation of of the hygienic characteristics of packing machines for liquid and
semi-liquid products” - 2000, richiama le prove standardizzate utilizzabili per accertare
l’adeguatezza della macchina ai seguenti requisiti:

Validazione confezionatrici asettiche

• Pulibilità di una testa di riempimento: EHEDG Doc. 15 "A method for the assessment of in-
place cleanability of moderately-sized food processing equipment”, 1997. Il test non è
applicabile a circuiti di riempimento di grandi dimensioni (tanto meno è applicabile l’EHEDG
Doc. 2 "A method for the assessment of in-place cleanability of food processing
equipment“, third edition 2004, che prevede la termostatazione a 55°C dell’attrezzatura
esaminata).
• Pulibilità di una camera di riempimento: ELOPAK – Assessment of filler cleanability by CIP
(Buttermilk Test).
• Presterilizzazione a vapore di una testata di riempimento: EHEDG Doc. 5 “A method for the
assessment of in-line steam sterilisation”, 2004. Il test non è applicabile a circuiti di
riempimento di grandi dimensioni.

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• Presterilizzazione di una camera di riempimento con perossidi: test della BOSCH.
• Presterilizzazione del contenitore con perossidi: il test descritto in letteratura da Cerny (G.
Cerny. Testing of Aseptic Machines for Efficiency of Sterilization of Packaging Materials by
Means of Hydrogen Peroxide. Packaging Technology and Science (1992) Vol 5 p. 77-81). Il
test prevede la verifica di sterilizzazione della superficie interna.
• Mantenimento dell’asepsi all’interno della testate di riempimento: EHEDG Doc. 7 “A method
for the assessment of bacteria tightness of food-processing equipment” - 2004. Il test
non è applicabile a circuiti di riempimento di grandi dimensioni.
• Sterilizzazione dell’aria con cartucce filtranti: EHEDG Doc 19 “A method for assessing the
bacterial retention ability of hydrofobic membrane filters”, 2000. E’ il fornitore di tali filtri
che li certifica.

Validazione confezionatrici asettiche

 Esempio di procedura di validazione

Si ipotizza di avere una macchina per il confezionamento asettico di un prodotto

pompabile in buste presterilizzate a raggi g.

La macchina comprenda le seguenti sezioni:

- camera di aspersione con H2O2 della superficie esterna di buste chiuse ermeticamente e
con pareti interne presterilizzate;
- camera di attivazione e decomposizione dell’H2O2 con aria calda;
- camera di apertura-riempimento-chiusura delle buste, presterilizzata a vapore saturo in
pressione e mantenuta sterile con aria sterile in leggera sovrapressione.

La validazione consiste nell’accertamento dell’effettiva capacità di garantire il

confezionamento asettico anche per prodotti a bassa acidità, effettuando challenge test di
pulibilità, di sterilizzabilità e di mantenimento dell’asepsi.

Validazione confezionatrici asettiche

La valutazione preliminare di conformità igienica è effettuata in base ai disegni costruttivi,
sulla macchina non funzionante e sulle sue singole parti smontate.

Per le prove di validazione, la confezionatrice deve essere collegata:

- al suo specifico impianto di CIP (Cleaning In Place);
- ad un sistema di alimentazione del prodotto per flussare, con falso-contenitore, il
prodotto stesso alla portata prevista;
- ad una linea di alimentazione di vapore saturo per flussare, con falso-contenitore, il
vapore stesso alla temperatura prevista, controllando questa nel punto più freddo;
- al suo specifico impianto di alimentazione della soluzione di perossido e di aria calda;
- ad una linea di alimentazione di aria compressa che permetta di alimentare il gruppo di
filtrazione sterilizzante con il flusso previsto.

Validazione confezionatrici asettiche

 1 - Valutazione preliminare di conformità ai requisiti
fondamentali di progettazione e costruzione igienica

1.1 - Valutazione di conformità dei materiali destinati al contatto con il prodotto alimentare
Per il giudizio di idoneità dei materiali destinati al contatto diretto con il prodotto
alimentare, si fa riferimento ai requisiti di legge italiani (1) ed europei (2), alle Guidelines
europee per i metalli e le leghe (3) ed alle EHEDG Guidelines (4).
Per l’esportazione negli USA, si fa riferimento al recente standard specifico NSF-ANSI (5).

(1) D.M. Sanità 21 marzo 1973, con successive modifiche.

(2) Regulation (EC) No 1935/2004 on materials and articles intended to come into contact with
food, con le corrispondenti Direttive specifiche. Regulation (EC) No 2023/2006 on good
manufacturing practice for materials and articles intended to come into contact with food.
(3) Council of Europe. Policy Statement concerning metals and alloys. Technical Document Guidelines
on metals and alloys used as food contact materials. (09.03.2001).
(4) EHEDG Guidelines: Doc 18 Passivation of stainless steel. Doc 23 Production and use of food-
grade lubricants. Doc 32 Materials of Construction_for equipment in contact with food.
(5) NSF International Standard/American National Standard 51 - 2007 Food equipment materials.

Validazione confezionatrici asettiche

 1.2 - Valutazione di conformità ai requisiti fondamentali di progettazione e
costruzione igienica.

La valutazione è effettuata esaminando tutte le singole parti dell’impianto direttamente

accessibili o smontabili e, per quelle non smontabili, esaminando i disegni costruttivi
particolareggiati. Per il giudizio di idoneità delle superfici a contatto diretto con il prodotto
alimentare, di quelle a contatto indiretto e di tutte le altre parti, si fa riferimento ai requisiti di
legge europei (1) (2), alle corrispondenti norme volontarie armonizzate (3) (4), alle
corrispondenti EHEDG Guidelines (5) ed ai VDMA Documents (6).
(1) Regulation (EC) No 852/2004 on the hygiene of foodstuffs, Annex II General Hygiene Requirements for
all Food Business Operators, Chapter V Equipment requirements.
(2) Directive 98/37/EC on the approximation of the laws of the Member States relating to machinery.
Directive 2006/42/EC on machinery, and amending Directive 95/16/EC (recast).
(3) UNI EN 1672-2:1997 Concetti di base — Parte 2: Requisiti igienici
(4) EN ISO 14159:2002 - Safety of machinery – Hygiene requirements for the design of machinery (5)
EHEDG Guidelines: Doc. 3 Microbiologically safe aseptic packing of food products, 1993. Doc. 8
Hygienic equipment design criteria, second edition 2004; Doc. 9 Welding stainless steel to meet hygienic
requirements, 1993; Doc. 10 Hygienic design of closed equipment for the processing of liquid food,
1993; Doc. 11 Hygienic packing of food products, 1993; Doc. 14 Hygienic design of valves for food
processing, 2004; Doc. 16 Hygienic pipe couplings, 1997; Doc. 25 Design of mechanical seals for
hygienic and aseptic applications, 2002.
(6) Verband Deutscher Maschinenund Anlagenbau e.V. (German Engineering Federation). Food Processing
Machinery and Packaging Machinery. Document No. 4/2002 (English edition: May 2003) Aseptic
Production Lines: Unsterility Risks in Product and Feed Lines - Planning and Installation Faults

Validazione confezionatrici asettiche

A livello internazionale, si fa riferimento ai punti pertinenti del Codex Alimentarius (7) e,
eventualmente, ai requisiti di legge contenuti nel Code of Federal Regulations
statunitense (8) ed anche ai 3A Snitary Standards (9), che sono specifici per il settore
lattiero-caseario ma hanno in pratica una applicazione generalizzata.

(7) CAC/RCP 40-1993 – Code of Hygienic Practice for Aseptically Processed and Packaged Low-Acid
Foods. 4.5 Equipment and Utensils. 4.5.2 Sanitary design, construction and installation. 7.6.1
Equipment design.
(8) 21 CFR 110 (Current Good Manufacturing Practice in Manufacturing, Packing, or Holding Human
Food), Subpart C-Equipment, § 110.40 Equipment and utensils.
(9) 3-A Sanitary Standards: 17-10 Formers, Fillers, and Sealers of Containers for Fluid Products
(11/2002); 23-05 Equipment for Packaging Viscous Products (10/2006); 33-01 Polished Metal
Tubing (11/1994); 63-03 Sanitary Fittings (11/2002); Oltre a quelli di volta in volta applicabili ai tipi di
valvole installate.

Validazione confezionatrici asettiche

 1.3 -Valutazione di conformità ai requisiti di tenuta sotto controllo del processo.

La valutazione è effettuata con le seguenti modalità:

a) Esame dei disegni costruttivi particolareggiati, identificando per ciascuno dei parametri di
processo critici le corrispondenti modalità di controllo previste.
b) Verifica di corrispondenza ai disegni dei sistemi di controllo installati sull’impianto.
c) Verifica di funzionalità dei sistemi di controllo in corrispondenza di deviazioni appositamente
indotte per ciascuno dei parametri di processo critici.
d) Per il giudizio di idoneità si fa riferimento, oltre che agli obblighi di legge europei (1),
peraltro molto generici, alle EHEDG Guidelines (2), ai VDMA Documents (3) ed alle Buone
Pratiche del Codex Alimentarius (4).

(1) Regulation (EC) No 852/2004 on the hygiene of foodstuffs (fà fede unicamente il testo in lingua inglese),
Annex II General Hygiene Requirements for all Food Business Operators, Chapter V Equipment
requirements: “2. Where necessary, equipment is to be fitted with any appropriate control device to
guarantee fulfilment of this Regulation’s objectives”
(2) EHEDG Guidelines: Doc. 3 Microbiologically safe aseptic packing of food products; Doc. 11
Hygienic packing of food products, 1993.
(3) Verband Deutscher Maschinenund Anlagenbau e.V. (German Engineering Federation). Food Processing
Machinery and Packaging Machinery. Document No. 5/2002 (English edition: May 2003) Signal
exchange for aseptic filling machines - Minimum requirements for safe operation.
(4) CAC/RCP 40-1993 – Code of Hygienic Practice for Aseptically Processed and Packaged Low-Acid Foods.
7.5.2.3.2 Packaging equipment. 7.5.2.3.3 Monitoring sterilization and maintenance. 7.6.2 Instruments
and controls for aseptic systems. 8.1 Processing and Production Records.
Validazione confezionatrici asettiche
E’ utile fare riferimento anche agli obblighi statunitensi specifici per il confezionamento
asettico (5) e, in particolare, alle informazioni che devono essere comunicate al Center
for Food Safety and Applied Nutrition della Food and Drug Administration statunitense
per poter immettere sul mercato statunitense prodotti alimentari confezionati
asetticamente (6).

(5) 21 CFR Part 113 - Thermally Processed Low-Acid Foods Packaged in Hermetically Sealed
Containers. Subpart C Equipment, 113.40 Equipment and procedures, (g) Aseptic processing and
packaging systems, (2) Container sterilizing, filling, and closing operation.
(6) US FDA/CSFAN Aseptic Packaging System Supplement to What You Need to Know about
Establishment Registration and Process Filing for Acidified and Low-acid Canned Foods, 2001.

Validazione confezionatrici asettiche

 2 - Prove di pulibilità delle parti a contatto sistematico o
occasionale con il prodotto alimentare
2.1 - Pulibilità del circuito di dosaggio
Si applica la seguente procedura:
a) Smontare tutte le parti, pulirle e sgrassarle accuratamente, rimontarle.
b) Riempire il circuito di dosaggio e farvi ricircolare per 24 ore a temperatura ambiente, con
intervallate 3 soste della durata di 10 minuti, un prodotto caratterizzato da adesività verso
l’acciaio e colore tale da rendere facilmente visibili i residui (1). Si propone di impiegare
panna pastorizzata con contenuto di grasso superiore al 20%, colorata con una adatta
concentrazione di un pigmento naturale liposolubile (b-carotene, licopene, E110 giallo
tramonto).
c) Applicare il normale ciclo previsto di svuotamento, lavaggio, detergenza e risciacquo.
d) Smontare e ispezionare visivamente le singole parti, per evidenziare l’eventuale presenza
di residui di prodotto (2).
(1) Nel EHEDG Doc. 15 A method for the assessment of in-place cleanability of moderately-sized food
processing equipment, 1997, è previsto l’impiego di una emulsione di grassi spalmabile, con contenuto di
acqua compreso tra 40 e 80% e viscosità ≤ 60 mPa*s, stabilizzata con lo 0,2% di sorbato di potassio e
colorata con 0,04% di olio alimentare contenente il 30% di b-carotene. La temperatura di applicazione è
ambiente (20-25°C) e la durata non è determinata.
(2) La valutazione di pulibilità è assoluta, non utilizzando la soluzione standard a moderato potere detergente
ed il tratto di tubazione standard in serie previsti dal metodo EHEDG Doc. 15 A method for the assessment
of in-place cleanability of moderately-sized food processing equipment, 1997.

Validazione confezionatrici asettiche

 2.2 - Pulibilità della camera di riempimento

Si applica la seguente procedura:

a) Pulire e sgrassare accuratamente tutte le superfici interessate alla prova, smontando
le parti smontabili.
b) Riempire il circuito di dosaggio con lo stesso prodotto del punto precedente e
sporcare la camera simulando un malfunzionamento della valvola di dosaggio e lo
sganciamento di una busta riempita ma non ancora chiusa. Flussaggio della camera
con aria per 4 ore.
c) Applicare il normale ciclo previsto di lavaggio, detergenza e risciacquo.
d) Smontare e ispezionare visivamente le singole parti, per evidenziare l’eventuale
presenza di residui di prodotto (1).

(1) La valutazione di pulibilità è assoluta, non utilizzando la soluzione standard a moderato potere
detergente ed il tratto di tubazione standard in serie previsti dal metodo EHEDG Doc. 15 A method for
the assessment of in-place cleanability of moderately-sized food processing equipment, 1997.

Validazione confezionatrici asettiche

3 - Prove di sterilizzabilità con vapore saturo pressurizzato delle parti a
contatto sistematico o occasionale con il prodotto alimentare

Per effettuare i challenge test relativi all’efficacia di sistemi di sterilizzazione basati

sull’impiego del calore umido (vapore saturo o acqua), tutte le fonti tecnico-scientifiche
internazionali concordano nell’assumere come indicatore biologico elettivo le spore di
Geobacillus stearothermophilus (già Bacillus stearothermophilus), con particolare
riferimento al ceppo ATCC 7953 o 12980; ovvero NCTC 10003 o 10007; ovvero DSM
494 o 22 o 5934; ovvero CIP 52.81 (1) (2). Tali spore sono caratterizzate da una
termoresistenza molto maggiore (D121 ≥ 1 min.) rispetto alle spore più termoresistenti di
C. botulinum (D121 ≤ 0,25 min.), cosicché 3-D subite da un inoculo di G.
stearothermophilus corrispondono almeno a 12-D per il C. botulinum (Fo = 3); ovvero il
“Botulinum Cook” generalmente accettato come adeguato dalla US-FDA ed
esplicitamente indicato dal Food Safety and Inspection Service del US Department of
Agriculture (3) e, recentemente, anche dall’EFSA (4).

(1) Bernard D.T. et al., in “Principles of Aseptic Processing and Packaging”, Philip E. Nelson,
James V. Champers, Judy H. Rodriguez. Editors. Food Processors Inst; 2nd edition, 1993
(2) Ito K.A. and Stevenson K.E. Sterilization of packaging materials using aseptic systems. Food
Technology 1984, 38 (3): 60-62.
(3) Federal Register: February 27, 2001 (Volume 66, Number 39) Proposed Rules.
(4) The EFSA Journal (2005) 199, 1-65, “Clostridium spp in foodstuffs”

Validazione confezionatrici asettiche

La termoresistenza delle spore batteriche può variare molto in funzione delle condizioni
di sporificazione e di conservazione delle spore stesse e per G. stearothermophilus sono
riportati valori di D121 anche dell’ordine di 4 minuti. Pertanto, nelle prove di validazione è
necessario conoscere preventivamente l’effettiva termoresistenza delle spore utilizzate,
che possono essere acquistate in sospensione pronta per l’uso o allo stato disidratato
(Allegato I).
Qualora non siano disponibili sospensioni di spore con termoresistenza certificata dal
fornitore, è necessario effettuare prove dirette di termoresistenza. A tale fine, si possono
utilizzare capillari di vetro riempiti con una sospensione di spore di adatta
concentrazione, chiusi alla fiamma e sottoposti a trattamenti per quanto possibile
isotermici in ultratermostato a temperature e per tempi variabili, con successivo
raffreddamento in un bagno di acqua e ghiaccio. Da ciascuna serie di capillari sottoposti
ad un trattamento termico e da corrispondenti capillari non trattati, si recupera la
sospensione sporale e, mediante apposite diluizioni, semina in adatto terreno colturale
(4) e termostatazione a 55°C per 3 giorni (72 ore), se ne determina il numero più
probabile di spore ancora vitali, calcolando infine il numero di riduzioni decimali applicate.

(4) Nutrient agar (Oxoid, Basingstoke, UK), oppure DTA (Dextrose Tryptone Agar), oppure TSB
(Tryptone Soya Broth, Biomerieux).

Validazione confezionatrici asettiche

Ad esempio, se il trattamento termico da validare è condotto a 120°C, si possono
effettuare trattamenti isotermici a 115, 120 e 125°C (il valore z delle spore è circa 10°C),
ciascuno dei quali per almeno 3 tempi, così da poter calcolare i valori effettivi di z e di D121.
La concentrazione di spore deve essere tale che, in base ai valori orientativi di z e DT,
ciascun singolo trattamento applicato permetta di calcolare il numero di riduzioni decimali
applicato (persistenza di spore vitali contabili) e possa essere considerato sostanzialmente
“isotermico” (tempi di salita e di discesa della temperatura all’interno dei capillari non
superiori al 10% del tempo di mantenimento nel bagno termostatico).

Validazione confezionatrici asettiche

 3.1 - Presterilizzazione del circuito di dosaggio

Si applica la seguente procedura:

a) Smontare tutte le parti, pulirle e sgrassarle accuratamente. Nelle parti di dimensioni
rilevanti, individuare i “punti critici” dal punto di vista del loro flussaggio con il vapore ed
evidenziarvi con pennarello indelebile una superficie di circa 1 cm2.
b) Aspergere mediante tampone le singole parti a contatto con il prodotto alimentare
(comprese le guarnizioni e le loro sedi), su tutta la superficie delle parti piccole e su
quella dei “punti critici” delle parti grandi, con una sospensione idroalcolica (40-70% di
etanolo) di circa 106 ufc/ml spore di Geobacillus stearothermophilus (già Bacillus
stearothermophilus) (Allegato I) a termoresistenza nota (1), dosandola con micropipetta
Eppendorf in maniera tale da avere circa 105 ufc sulla superficie a contatto di ciascun
singolo componente (0,1 ml di sospensione sporale per 1 cm2 di superficie).
c) Lasciare asciugare completamente le parti per almeno 2 ore.
d) Rimontare il circuito di dosaggio e fare trascorrere almeno 16 ore.
e) Smontare tutte le parti e, per ciascuna di esse, aspergere la superficie a contatto
inoculata con un tampone imbevuto di soluzione di Ringer con aggiunto 1% di Tween 20
(polisorbato, tensioattivo non ionico) (Allegato II). Strizzare il tampone prima
dell’aspersione e standardizzare la modalità di aspersione (direzione, forza applicata,
numero di ripassi, ecc.).
(1) Per determinare il numero di riduzioni decimali effettivamente corrispondente alle 12D del C.
botulinum (botulinum cook: Fo = 3 min).

Validazione confezionatrici asettiche

f) Rompere e inserire ciascun tampone in un contenitore opportunamente codificato
contenente soluzione di Ringer e agitare in vortex per 2 minuti ad alta velocità.
g) Diluire serialmente con soluzione di Ringer, piastrare con tre repliche con adatto
terreno nutritivo (2) e termostatare a 55°C per 3 giorni (72 ore). Determinare il
numero più probabile di spore risultate attive e calcolare la percentuale di recupero
dell’inoculo.
h) Ripetere le operazioni da a) a d), effettuare il previsto ciclo di sterilizzazione con
vapore saturo, omettendo l’operazione di sterilizzazione, quindi ripetere le
operazioni da e) a g). Calcolare il numero di riduzioni decimali applicate con il
trattamento di sterilizzazione, tenendo conto della percentuale di recupero
dell’inoculo.
i) Espressione dei risultati come n-D ottenute per ciascuna parte del circuito di dosaggio
e confronto con il valore minimo accettabile (1).

Il test completo deve essere ripetuto almeno 2 volte (con ulteriori ripetizioni se i risultati
si discostano significativamente).

(2) Nutrient agar (Oxoid, Basingstoke, UK), oppure DTA (Dextrose Tryptone Agar), oppure TSB
(Tryptone Soya Broth, Biomerieux).

Validazione confezionatrici asettiche

 3.2 - Presterilizzazione della camera di riempimento

Si applica la seguente procedura:

a) Individuare 10 “punti critici” della camera di riempimento, in funzione della flussabilità da
parte del vapore. Prendere nota della loro posizione e della possibilità di applicarvi
provini di acciaio rettangolari 5 x 20 mm, ovvero di altra forma con stessa area.
b) Ritagliare da un foglio sottile di acciaio inossidabile 15 provini rettangolari 5 x 20 mm,
ovvero di altra forma con stessa area. Applicare su una faccia dei provini un pezzo di
nastro bi-adesivo lasciato protetto sul lato esterno.
c) Utilizzando una micropipetta Eppendorf, inoculare la faccia libera di 12 provini con 0,1 ml
di una sospensione idroalcolica (etanolo 40-70%) di circa 106 ufc/ml spore di
Geobacillus stearothermophilus (già Bacillus stearothermophilus) (Allegato I) a
termoresistenza nota (1), in maniera tale da avere circa 105 ufc sulla superficie di
ciascun provino. Marcare con pennarello indelebile i 2 provini non trattati.
d) Lasciare asciugare completamente i provini inoculati e conservarli, insieme ai 2 provini
non inoculati, dentro piastre aperte all’interno di un essiccatoio per almeno 16 ore prima
di utilizzarli. Estrarre i provini da utilizzare chiudendo e codificando le rispettive piastre.

(1) Per determinare il numero di riduzioni decimali effettivamente corrispondente alle 12-D del C.
botulinum (botulinum cook: Fo = 3 min).

Validazione confezionatrici asettiche

e) Senza toccare la faccia inoculata, fissare con il nastro bi-adesivo 10 provini inoculati sui
“punti critici” della camera di riempimento ed anche i 3 provini non inoculati, prendendo
nota per ciascuno di essi della corrispondenza tra il codice segnato sulla piastra nella
quale era contenuto e il “punto critico” sul quale è applicato. Attivare il ciclo di
sterilizzazione a vapore previsto. Al termine della sterilizzazione attivare il flusso di aria
per raffreddare rapidamente la camera. Recuperare i provini, senza toccare la faccia
inoculata, e racchiuderli nelle piastre con il codice corrispondente.
f) Aspergere la superficie inoculata di ciascuno dei 12 provini sottoposto a sterilizzazione, e
quella dei 2 provini inoculati ma non trattati, con un tampone imbevuto di soluzione di
Ringer con aggiunto 1% di Tween 20 (polisorbato, tensioattivo non ionico) (Allegato II).
Strizzare il tampone prima dell’aspersione e standardizzare la modalità di aspersione
(direzione, forza applicata, numero di ripassi, ecc.).

Validazione confezionatrici asettiche

g) Rompere e inserire ciascun tampone in un contenitore opportunamente codificato
contenente soluzione di Ringer e agitare in vortex per 2 minuti ad alta velocità.
h) Diluire serialmente con soluzione di Ringer, piastrare con tre repliche con adatto terreno
nutritivo (2) e termostatare a 55°C per 3 giorni (72 ore). Determinare il numero più
probabile di spore risultate attive nei provini non trattati e in quelli trattati.
i) Esprimere i risultati come n-D ottenute per ciascun “punto critico” della camera di
riempimento e confronto con il valore minimo accettabile.
Il test completo deve essere ripetuto almeno 2 volte (con ulteriori ripetizioni se i risultati si
discostano significativamente).
(2) Nutrient agar (Oxoid, Basingstoke, UK), oppure DTA (Dextrose Tryptone Agar), oppure TSB (Tryptone
Soya Broth, Biomerieux).

Validazione confezionatrici asettiche

 4) Sterilizzazione della superficie esterna delle buste.

Per la sterilizzazione con perossidi, è stato proposto l’impiego di spore dei seguenti ceppi
di Bacilli:

Bacillus subtilis var. globigii (NCIB 8058; ATCC 9372; NCA 7552): in H2O2 30% a 30°C
è molto più resistente di altri Bacilli (1). In H2O2 25,8%, D = 2 minuti a 24°C, 0,92 minuti a
40°C e, sulla base di un “valore z” calcolato di 40°C, 5,5 secondi a 80°C (2) Nel ELOPAK
method n° 644, 95-08-11, Filler Sterility Test (3), sono ritenute accettabili almeno 5-D.

(FDA) Bacillus cereus per sterilizzazione con ac. Peracetico (4)

(1) Ito K.A., Denny C.B., Brown C.K., Yao M., and Seeger M.L. Resistance of Bacterial Spores to
Hydrogen Peroxide. Food Technology (1973) 27 (11): 58-66.
(2) Toledo, R.T., F.E. Escher, and J.C. Ayres. Sporicidal properties of hydrogen peroxide against
food spoilage organisms. Appl. Microbiol. 1973. 26:592-597.
(3) EHEDH Doc. 21 “Challenge tests for the evaluation of the hygienic characteristics of packing
machines for liquid and semi-liquid products”, 2000.
(4) Blakistone, B. R. Chuyate, D. Kautter, jr., J. Charbonneau, and K. Suit. Efficacy of Oxonia Active
against selected spore formers. J. Food Protect. (1999) 62: 262-7.

Validazione confezionatrici asettiche

Bacillus subtilis SA22 (NCA 72-52; ATCC DSM 4181): in H2O2 25,8% a 24°C, D = 7,3 minuti,
rispetto a 2 minuti per B. subtilis var. globigii e 1,5 minuti per B. stearothermophilus (2). In
H2O2 29,5% a 65°C D = 0,05 minuti (4). Il Doc. 21 EHEDG (3), per validare la sterilizzazione
della superficie interna di contenitori, raccomanda il metodo di G. Cerny (5), che ritiene
accettabile l’applicazione di almeno 4-D. La VDMA 2006/N. 14 (6), per sterilizzazione esterna
dei contenitori con H2O2, ritiene accettabili almeno 3-D (media logaritmica per ciascuna
sezione inoculata di almeno 25 contenitori). Mentre la VDMA 2003/N. 8 (7), per pre-
sterilizzazione con H2O2 della camera di confezionamento, ritiene accettabili almeno 4-D in
tutte le zone critiche.

(4) S. Leaper. Comparison of the resistance to hydrogen peroxide of wet and dry spores of Bacillus
subtilis SA22. Joumul oj’Fond Technology (1984) 19: 695-702
(5) G. Cerny, Testing of Aseptic Machines for Efficiency of Sterilization of Packaging Materials by
Means of Hydrogen Peroxide. Packaging Technology and Science, 1992, 5: 77-81.
(6) Verband Deutscher Maschinenund Anlagenbau e.V. (German Engineering Federation). Food Processing
Machinery and Packaging Machinery. Document 2006 No. 14 (English revised edition: July 2007) Code of
Practice. Testing Hygienic Dilling Machines of VDMA Class V (Aseptic Filling Machines). External
Sterilization of Packaging Materials.
(7) Verband Deutscher Maschinenund Anlagenbau e.V. (German Engineering Federation). Food Processing
Machinery and Packaging Machinery. Document 2003 No. 8 (English edition: March 2004) Code of
Practice. Testing Aseptic Plants: Sterilizing the Sterile Zone in Machine Interior.

Validazione confezionatrici asettiche

Bacillus subtilis A: consigliato per trattamenti con H2O2 e UV (8); ed anche nel caso di
miscele H2O2 e acido peracetico (9). Nella BOSCH Machine Pre-sterilization Procedure (2),
si utilizzano provini inoculati con 104, 105 e 106 spore (si desume l’accettabilità di almeno 5-
D).

Geobacillus stearothermophilus (già Bacillus stearothermophilus) (ATCC 7953/12980;

NCTC 10003/10007; DSM 494/22/5934; CIP 52.81): in H2O2 30% a 30°C ha resistenza
molto inferiore a B. subtilis var. globigii e inferiore anche a B. subtilis A; mentre a 87,8°C ha
termoresistenza leggermente inferiore a B. subtilis var. globigii e maggiore di B. subtilis A
(1). In H2O2 28,5% a 24°C ha resistenza inferiore a B. subtilis SA22 e poco inferiore a B.
subtilis var. globigii (2). In oxonia® a temperatura ambiente ha resistenza inferiore a B.
subtilis A e paragonabile a B. subtilis var. globigii (9). In H2O2 vapore, invece, ha la
resistenza più elevata (10).

(8) Reidmiller J.S. Baldeck J.D. Rutherford G.C. Marquis R.E. Characterization of UV-Peroxide Killing
of Bacterial Spores. Journal of Food Protection, 66 (7) July 2003:1233-1240.
(9) Blakistone B., Chuyate R., Kautter D. Jr., Charbonneau J., and Suit K. Efficacy of Oxonia Active
Against Selected Spore Formers. J. Food Prot. 1999. Vol. 62(3) : 262-267
(10) McDonnell G., Grignol G., Antloga K.. Vapour phase hydrogen peroxide decontamination of food
contact surfaces. Dairy Food Environ. Sanit. )2002) 22, 868– 873.

Validazione confezionatrici asettiche

Considerazioni:
Non sono disponibili le spore dei Bacilli utilizzati come indicatori biologici con certificato di
resistenza al trattamento con H2O2. La resistenza dipende, oltre che dal ceppo, dalle
condizioni operative che possono essere varie (immersione o riempimento, aspersione,
nebulizzazione e condensazione, per H2O2 a diversa concentrazione e temperatura, e con
successivo risciacquo sterile o trattamento con aria calda a diversa temperatura).
I dati disponibili sulla resistenza al trattamento con H2O2 delle spore di C. botulinum sono
molto scarsi e per lo più relativi a trattamenti di semplice immersione a temperatura
ambiente. Le uniche prove con post-trattamento ad aria calda permettono un raffronto diretto
con le spore di G. stearothermophilus, che risultano almeno 3,3 volte più resistenti di quelle
del ceppo più resistente di C. botulinum (1). Utilizzando come sporicida H2O2 + aria 55-
85°C, 4-D applicate alle spore di G. stearothermophilus corrispondono a più di 12-D per le
spore più resistenti di C. botulinum.
In oxonia a freddo (immersione), le spore di G. stearothermophilus hanno resistenza almeno
4,5 volte maggiore di quella delle spore più resistenti di C. botulinum (2).
Attualmente, le spore di G. stearothermophilus sono l’indicatore biologico correntemente
impiegato per validare lì efficacia sterilizzante di H2O2 in fase vapore (3).
(1) Ito, K.A., Denny, C.B., Brown, C.K., Yao, M. & Seeger, M.L.. Resistance of bacterial spores to
hydrogen peroxide. Food Technology, 1973, 27 (11), 58-66
(2) Blakistone B.A, Chuyate R., Charbonneau J., Suit K., and Kautter D. Jr. Efficacy of Oxonia Active
Against Selected Spore Formers. Journal of Food Protection: 1999, Vol. 62, No. 3, pp. 262–267
(3) Kokubo M, Inoue T, Akers J. Resistance of common environmental spores of the genus Bacillus
to vapor hydrogen peroxide. J Pharm Sci Technol 1998;52:228-231

Validazione confezionatrici asettiche

Pertanto, si ritiene preferibile impiegare le spore di G. stearothermophilus, anziché quelle
di altri Bacilli, perché la sua termofilicità permette di inoculare e manipolare i provini senza
dover applicare condizioni nominalmente asettiche.
Si applica la seguente procedura:
a) Individuare 4 “punti critici” delle buste, in funzione della flussabilità da parte del H2O2 e
dell’aria calda. Verificata la possibilità di applicarvi provini di laminato plastico
rettangolari 5 x 70 mm e codificare la loro posizione come A, B, C e D.
b) Ritagliare da campioni di buste 50 provini, sotto forma di rettangoli 5 x 70 mm. Applicare
su una faccia dei provini un pezzo di nastro bi-adesivo lasciato protetto sul lato esterno.
Con pennarello indelebile suddividere l’altra faccia dei provini con segni verticali in
maniera tale da avere, partendo da sinistra, una area larga 10 mm, marcata e da
utilizzare per l’orientamento e per manipolare il provino con pinze, con 3 aree adiacenti
larghe 20 mm.
c) Utilizzando una micropipetta Eppendorf, inoculare sulla faccia libera di 42 provini le 3
arere da 20 mm con 0,1 ml di una sospensione idroalcolica (etanolo 40-70%) a tre
diverse diluizioni: circa 104, 105 e 106 ufc/ml spore di Geobacillus stearothermophilus
(già Bacillus stearothermophilus) (Allegato I).
d) Lasciare asciugare completamente i provini inoculati e conservarli posti dentro piastre
petri aperte all’interno di un essiccatoio per almeno 16 ore prima di utilizzarli. Estrarre i
provini da utilizzare chiudendo e codificando le rispettive piastre.

Validazione confezionatrici asettiche

e) Preparare 150 tubi sterili con adatto terreno nutritivo (1) e 200 EU/ml di catalasi (Allegato III).
f) Su 10 buste numerate fissare con il nastro bi-adesivo i provini inoculati sui 4 “punti critici”,
avendo cura di non toccare la superficie inoculata. Attivare il ciclo di sterilizzazione a H 2O2 e
aria calda, sottoporre le buste al trattamento. Distaccare i provini, avendo cura di non
toccare le superficie inoculata, tagliare le tre parti con inoculo differenziato e inserirle
ciascuna in un tubo codificato con il numero della busta, la lettera del “punto critico” ed il
livello di inoculo.
g) Ripetere le stesse operazioni del punto f) per altre 2 buste sui cui “punti critici” sono stati
incollati provini non inoculati. Inserire nei restanti 6 tubi le 3 porzioni a inoculo differenziato
dei 2 provini non sottoposti a sterilizzazione.
h) Termostatare le provette a 55°C per 3 giorni (72 ore).
i) Esprimere i risultati come massimo inoculo completamente inattivato per ciascun “punto
critico” di ciascuna busta. Il risultato è da ritenersi accettabile se per tutti i provini inoculati
c’è stata almeno la completa inattivazione di 104 ufc (2). I provini non inoculati e trattati
dovranno risultare negativi; mentre quelli inoculati e non trattati dovranno risultare positivi.
Il test completo deve essere ripetuto almeno 2 volte (con ulteriori ripetizioni se i risultati si
discostano significativamente).
(1) Nutrient agar (Oxoid, Basingstoke, UK), oppure DTA (Dextrose Tryptone Agar), oppure TSB (Tryptone
Soya Broth, Biomerieux).
(2) Essendo corrispondenti a più di 12-D delle spore di C. botulinum (botulinum cook: Fo = 3 min.

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 5) Mantenimento sterile della camera di riempimento

Procedura
Sotto cappa a flusso laminare, aprire almeno 4 buste, cospargere la superficie interna con
brodo di coltura TSB (trypticase soy 15gl-1) e richiuderle escludendo il più possibile l’aria
dall’interno.
Inoculare l’esterno della camera di riempimento aspergendo o nebulizzando e/o iniettando
nelle parti interstiziali una sospensione di Serratia marcescens (1) a 108 ufc/ml in TSB.
N.B. gli operatori devono indossare la mascherina protettiva su naso e bocca.
Introdurre una busta nella confezionatrice e, dopo l’introduzione nella camera di riempimento
flussata con aria sterile e l’apertura, mantenerla per 4 ore in posizione di riempimento,
ma con la valvola dosatrice chiusa, prima di effettuare la chiusura.
Dopo incubazione per a 30°C per 5 giorni, le buste sono aperte per verificare l’eventuale
accrescimento di Serratia marcescens. Incubare ed esaminare allo stesso modo anche 2
buste inoculate ma non trattate nella camera di riempimento.
Sono previste 2 prove. Dopo ciascuna prova, sterilizzare accuratamente l’esterno, oltre che
l’interno, della camera di riempimento.

(1) EHEDG Doc. 7 “A method for the assessment of bacteria tightness of food-processing
equipment” - 2004.

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 Conclusioni

Una procedura analoga a quella esemplificata, può essere stabilita, con gli opportuni
adattamenti, in funzione delle seguenti variabili:
- Tipo di macchina di riempimento
- Tipo di contenitore
- Mezzi e modalità di pre-sterilizzazione

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