spettroscopia di

assorbimento e fluorescenza

laura d’alfonso @ Unimib

assorbimento e colori
assorbimento molecolare
una molecola può assorbire
una radiazione (λ) solo se nella molecola
esiste una transizione di corrispondente energia

hc
E = hν =
λ
c = 3x108 m/sec
h = 6.63x10-34 Jsec
la radiazione elettromagnetica
pigmenti naturali
 la legge di Beer - Lambert
I
I0 1.4
I trasmittanza T =
I0
sostanza
1.2
concentrazione c
1.0
I
assorbanza

cammino ottico l A = - logT = − log  = εcl

0.8  I0 
deviazioni:
0.6
• variazioni dei coefficienti di assorbimento ad alte concentrazioni (>10mM)
a causa delle
0.4 interazioni elettrostatiche tra molecole vicine;

• scattering di luce (torbidità, particelle in sospensione, ~ 1/λ4);

0.2
• contributi di fluorescenza o fosforescenza;
• variazioni di
0.0 indice di rifrazione ad alta concentrazione;
250 300 350 400 450 500
• spostamento degli equilibri chimici in funzione della concentrazione;
lunghezza
• contributi non monocromaticità d'onda
(più affidabile il massimo della banda);
• luce di fondo.
strumentazione

Assorbanza (A)
A = log10 (I0/I)

A=3 I0 = 1000 I
A=2 I0 = 100 I
A=1 I0 = 10 I

% Transmission (%T)
%T = I/Io
A = log10 (1/T)
 significato fisico
I0 Iz I-dI I N = c NAV /1000 = molecole/cm3
A r = raggio molecole
P = probabilità assorbimento luce incidente
z dz σ = Pπr2 = sezione d’urto
l

dI
dI = −Iz σ N dz = − σ N dz
I
I dI l
∫I0 I = ∫0− σ N dz ln I − ln I0 = − σ N l

I I
− ln  = σ N l = σ (NAV /1000) c l - log  = A = ε c l
 I0  I I  I0 
− ln  = - 2.303log 
 I0   I0 
I
- log  = σ (NAV /1000)/2.303 c l ε = σ (NAV /1000)/2.303
 I0 
 significato fisico
I0 Iz I-dI I N = c NAV /1000 = molecole/cm3
A σ = sezione d’urto

dI = −I σ N dx
z dx
l
ln I − ln I0 = − σ N l
I
− ln  = σ N l = σ (NAV /1000) c l
 I0  I
- log  = A = ε c l
I  I0 
- log  = σ (NAV /1000)/2.303 c l
 I0  σ ε
(cm2) (M-1cm-1)
assorbimento atomi 10-12 3x108
ε = σ (NAV /1000)/2.303
molecole 10-16 3x104
infrarosso 10-19 3x10
I I scattering Raman 10-29 3x109
− ln  = - 2.303log 
 I0   I0 
 assorbimento multi-fotoni
σ2 ÷ σ1 ∆x ∆t

∆x ≈ σ1 ≈ 10-17–10-16 cm2
∆t ≈ 10-16 sec

σn ÷ σ1n ∆tn-1

10-84 cm6sec2
1 GM = 10-50 cm4sec
www.drbio.cornell.edu/MPE
 sonde convenzionali
alcune sezioni d’urto
a 2 fotonisezione d’urto a due fotoni

indicatori del calcio

il picco di assorbimento si trova .. e spesso no!
spesso ad una λ doppia rispetto al
picco a singolo fotone.. es.: rodamina

es.: cumarina
assorbimento
singolo fotone
(asse x per 2)
proteine fluorescenti
probabilità
assorbimento
2 fotoni
 responsabili assorbimento nelle proteine..

1. alfa elica (pH 11, 25°C)

2. random (pH 6, 25°C)
3. beta sheet (pH 11, 52°C)
E x 10-
4

Wavelength (nm)
Wavelength (Å)
.. e negli acidi nucleici
 analisi della reattivita’ dei gruppi SH via DTNB
5,5-Dithiobis(2-nitrobenzoic acid)
mioglobina

TNB carbossilato ε420 = 190 mM-1 cm-1

neuroglobina umana TNB anione ε412 =13.6 mM-1 cm-1
citoglobina umana
citoglobina zebrafish TNBS-STNB+SCys Æ STNB+TNBS-SCys

D. Hamdane et al, J. BIOL. CHEM Vol. 278, No. 51, pp. 51713–51721, 2003
fluorescenza di biomolecole
fotone

fotone
molecola nello molecola nello
stato fondamentale stato eccitato

la luce puo’ indurre transizioni

tra gli stati elettronici di una molecola
 diagramma di Jablonski
assorbimento 10-15 s
fluorescenza 10-12-10-7 s
fosforescenza 10-2-101 s

kR kR
φ= =
kR + kic + kci + kq (Q) kR + kNR
 Stokes shift
l’emissione avviene sempre dal più basso
stato vibrazionale di S1 (conversione interna)
regola dello specchio

lo spettro di emissione
è un’immagine speculare
dello spettro di assorbimento

i livelli S0 e S1 presentano
strutture vibrazionali simili
regola di Kasha

lo spettro di fluorescenza
è indipendente dalla
lunghezza d’onda di eccitazione
 …
kR τ
φ= = <1
kR + kNR τR
φ ⋅ f(λ) ⋅ d
kR
F(λ) ÷ Pabs ⋅ Pem

I0 − I

−2.303ε ( λ ab s ) Cl
I = I0 e
lineare
se εCl < 0.05 nella
concentrazione
I = I0 [1 − 2.303ε(λ ab s )Cl]

I0 − I = 2.303ε(λ ab s )ClI0

F(λ) = ε(λ abs ) ⋅ φ ⋅ f(λ) ⋅ C ⋅ I0 ⋅ K

non è una misura assoluta
strumentazione
 parametri sperimentali

lampada appropriata
per l’intervallo di lunghezze d’onda
di interesse

correzione per
lo spettro
della lampada
 parametri sperimentali

ampiezza fenditure monocromatore

risoluzione spettrale

scelta accurata dei filtri

di eccitazione ed emissione
proprietà misurabili con la fluorescenza

• spettri (effetti circondario)

• tempi di vita della fluorescenza

• polarizzazione (orientazione e dinamica)

• trasferimento eccitazione
(distanze -> dinamiche)
• localizzazione della fluorescenza
fluorofori: intrinseci o sintetici?
 fluorofori intrinseci
fenilalanina
tirosina
triptofano
studio del folding
1. apoazurin
2. ribonuclease T1
3. staphylococcal nuclease
4. glucagon

Eftink MR, Methods Biochem Anal, 1990.

 mutazioni tyr-trp

lactate dehydrogenase

Smith CJ et al., Biochemistry, 1991.

 trp
acidic residues
hydrophobic res

human antithrombin

PGW Gettings, Univ Illinois

Mehager JL et al., J Biol Chem, 1998.

fluorofori estrinseci
eccitazione 1 vs 2 fotoni

Xu C et al., PNAS USA, 1996.

eccitazione simultanea
Xu C et al., PNAS USA, 1996.
fluorofori sintetici
la famiglia “Alexa”..
..fluorofori per tutti i gusti!
la famiglia “Cy..”
titolazione raziometrica del calcio
 fluorofori sensibili al pH
sonda eccitazione emissione
riconoscere i componenti cellulari..

Alexa 488 - actin (Ar ion 488 line)

Texas Red-X - lectin ( green helium-neon 543 line)
Hoechst 33342 - nucleus. (violet diode 405 line)

Rat Diaphragm Smooth Muscle Tissue

 Alexa 568 - vimentin intermediate filament
Alexa 488 - glial fibrillary acidic protein
DRAQ5 - nucleus

Rat Brain Hippocampus Sagittal Thin (8-Micrometer) Section

 Alexa 568 - tubulin
SYTOX Green - nucleus
Alexa 350 - actin

Adherent Rat Thoracic Aorta Smooth Muscle Cell

Cy2 - cytokeratin
MitoTracker Red CMXRos - mitochondrial network
DAPI - nucleus

Adherent Rat Kangaroo Kidney Epithelial Cell

 Alexa Fluor 488 - actin
MitoTracker Red CMXRos - mitochondria
Hoechst 33342 - nucleus

Adherent Normal Tahr Ovary (HJ1.Ov) Epithelial Cell

proteine fluorescenti
Opossum Kidney Cortex Epithelial Cells (OK Line)
Human Cervical Adenocarcinoma Cells (HeLa Line)