Gli anticorpi (Abbas capitolo3)

A Kabat si deve il merito di avere scoperto in quale frazione sierica risiede la funzione anticorpale.
Egli condusse un esperimento: prese un coniglio e lo immunizzò (immunizzare vuol dire induzione
deliberata di una risposta immunitaria) con un antigene (che rappresenta qualsiasi sostanza estranea
con cui veniamo in contatto; le sue due caratteristiche principali sono:
1) l’immunogenicità, ovvero la capacità di allestire una risposta immunitaria; questa
caratteristica necessita di una serie di qualità come: estraneità, peso molecolare,
eterogenicità chimica, degradabilità
2) l’antigenicità, cioè la capacità che hanno le nostre difese di reagire contro l’antigene.
Dopo avere immunizzato il coniglio, quindi, prelevò un po’ del suo sangue, lo centrifugò, prese il
siero e lo mise da parte. Successivamente prese un coniglio della stessa specie, NON immunizzato
questa volta, e ancora una volta prelevò il sangue, centrifugò e tolse via il siero. Allora sottopose
questo siero all’analisi dell’elettroforesi (che rappresenta la migrazione delle proteine nel campo
elettrico) e separò le frazioni proteiche in α, β e γ globuline.
Confrontando le elettroforesi del siero immunizzato (cioè il siero del coniglio che era stato
precedentemente stimolato con l’antigene) con quello preimmune (fig.1 quaderno), si accorse di una
cosa sorprendente: la frazione anticorpale risiedeva nelle γ globuline in quante esse presentavano
una concentrazione anticorpale molto alta. Per controprova precipitò gli anticorpi del siero con
solfato di ammonio e attraverso l’elettroforesi notò che la frazione γ era esattamente uguale a quella
del siero preimmune. Quindi con il termine di anticorpo, che possiamo anche chiamare con termini
diversi quali “γ-globuline” o più in generale “immunoglobuline” (visto che nella porzione γ sono
presenti diverse proteine), si intende quelle glicoproteine plasmatiche la cui sintesi può essere
indotta dall’introduzione di un antigene che è in grado di stimolare le difese immunitarie a dare una
risposta specifica. Gli anticorpi sono dotati della proprietà fondamentale di reagire specificamente
con l’argento. Il merito di avere individuato la struttura della nostra molecola anticorpale si deve a
Porter e ad Edelmann i quali utilizzarono due procedimenti, uno un procedimento enzimatico ed
l’altro un procedimento chimico: entrambi arrivarono allo stesso risultato. Presero la frazione delle
γ-globuline, la sottoposero a ultracentrifugazione ed ottennero due frazioni: una a basso peso
molecolare con costante di sedimentazione 7-8 S, l’altra ad alto peso molecolare con costante di
sedimentazione 19 S. Per i loro studi presero la frazione più piccola e la chiamarono con il nome
IgG (ovvero immunoglobulina della porzione γ). Porter si avvalse del procedimento enzimatico ed
utilizzò la papaina che è un enzima protelitico. Questa agì sopra il ponte disolfuro tagliando la
nostra molecola anticorpale in tre parti: due frammenti Fab (Fragmente, antigen bindin perché
reagisce legando l’antigene) ed un frammento Fc (Fragment cristallizable perché cristallizza a
basse temperature). La prima volta l’esperimento fallì in quanto tenne la frazione γ troppo a lungo
con la papaina e questa digerì tutto… Un altro enzima da utilizzare al posto della papaina è la
pepsina che agisce invece al di sotto del ponte disolfuro: con questo metodo, però, si ottiene un
grosso frammento chiamato Fab2 (poiché due Fab sono uniti dal ponte disolfuro) e la porzione Fc
viene ridotta in tanti piccoli frammenti.
Edelmann, invece, si avvalse di procedimenti chimici: denaturò questa porzione piccola a basso
peso molecolare con il β-mercaptoetanolo dopodiché la fece correre in un gel di acrinamide ed
ottenne la distensione della molecola. Porter ripetè l’esperimento di Edelmann con il β-
mercaptoetanolo, alchilò la molecola con lo iodioacetamide (per impedire che si ricompattassero i
legami disolfuro) e poi sottopose questa frazione della molecola anticorpale a cromatografia su
colonna. Questo test separò la molecola anticorpale in catene, in base al peso molecolare: due
catene leggere e due catene pesanti.

Che relazione c’è fra l’esperimento fatto prima da Porter e quello fatto poi da Edelmann?

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Per potere intuire dalla risposta questa domanda prese le frazioni Fab e le frazioni Fc ed immunizzò
la capra con esse. Ovviamente nella capra si sono andati a generare anticorpi anti-Fab ed anticorpi
anti-Fc e vide che gli anticorpi anti-Fab riconoscevano l’intera catena leggera e metà della catena
pesante, mentre gli anticorpi anti –Fc riconoscevano solo la parte finale della catena pesante. A
questo punto la struttura monomerica di tutte le immunoglobuline era pronta: quindi la molecola
anticorpale è costituita da due catene pesanti e due catene leggere; nell’ambito delle catene leggere
e delle catene pesanti distinguiamo la porzione Fab e la porzione Fc. A questo punto si cerco il sito
“binding” in cui l’antigene va a reagire con la nostra molecola anticorpale. La determinazione della
sequenza aminoacidica degli anticorpi non fu facile perché nel siero essi sono eterogenei e presenti
in numero elevatissimo. La cosa fu possibile, dopo qualche anno perché fu scoperto un tumore: il
mieloma multiplo. Il mieloma multiplo è il tumore della plasmacellula cioè della cellula
differenziativa del linfocita B. La plasmacellula va a produrre gli anticorpi. Le plasmacellule
tumorali, per distinguerle dalle plasmacellule normali, vengono chiamate cellule mielomatose.
Anche le cellule mielomatose producono delle proteine, che sarebbero gli anticorpi tumorali che
chiamiamo proteine mielomatose per distinguerle dagli anticorpi normali. Una proteina
mielomatosa è identica all’anticorpo solo che il mieloma produce tutte immunoglobuline uguali.
Il mieloma fu creato in laboratorio (plasmocitoma) nel topo introducendo nella cavità peritoneale
degli oli minerali ed immunizzando il topino con un antigene A noto al ricercatore. A questo punto
conosciamo la specificità e sappiamo che le proteine mielomatose sono specifiche per
quell’antigene A. Nelle persone affette da mieloma sono state trovate nelle urine delle catene
leggere che prendono il nome di catene di Beige-Johnes. Quindi abbiamo detto che costruendo il
plasmocitoma conosciamo la specificità: hanno costruito plasmocitoma indotto da antigene A, da
antigene B, da antigene C e da antigene D. In base all’antigene venivano poi prodotti vari anticorpi:
anticorpi anti-A, anti-B, anti-C, anti-D. Dallo studio studio dei plasmocitomi si è notata una cosa
sorprendente: i primi 110 aminoacidi delle catene leggere trovate nelle urine erano diversi, gli altri
110 aminoacidi, invece, erano tutti uguali (dunque riassumendo diciamo che nell’ambito delle
catene leggere metà della catena leggera presenta una sequenza aminoacidica diversa da catena a
catena mentre l’altra metà è identica in tutte le catene. Volendo fare una analogia con le parole:
psicologia, fisiologia, immunologia, patologia… queste sono parole con una matrice diversa ed una
uguale. Quello che ne consegue è che nell’ambito della catena leggera abbiamo una regione
variabile ed una regione costante.
Le catene leggere sono delle proteine formate da 220 amminoacidi e presentano una regione
variabile ed una regione costante. Studiando ancora le catene leggere si è vista ancora un’altra cosa:
nella porzione costante, che è identica cioè in tutte le catene, si sono evidenziate due tipi di catene κ
e λ. Per il 70% le nostre catene sono di tipo κ, per il 40% sono invece di tipo λ. Ancora nell’uomo
nell’ambito della catena leggera λ si sono riscontrati altri 4 sottotipi (pensate che queste catene si
distinguono tra loro soltanto per uno o due amminoacidi); i sottotipi della catena leggera λ sono: λ1,
λ2, λ3, λ4. È importante notare che non esistono catene leggere ibride cioè del tipo κ λ ma devono
essere entrambe di tipo κ o di tipo λ. Quindi in seguito alla stimolazione antigenica nei confronti
dell’antigene A si sviluppa il clone-1 che produrrà anticorpi anti-A e svilupperà delle catene leggere
per esempio di tipo κ e gli anticorpi prodotti da questo clone sono identici. Se noi immunizziamo
con l’antigene B si sviluppa il clone-2 che produrrà anticorpi anti-B; chiaramente gli anticorpi anti-
B si differenziano dagli anticorpi anti-A in quanto la regione variabile sarà diversa mentre la
regione costante resterà uguale (primi 110 aminoacidi saranno diversi, ma la parte costante, la
porzione Fc, sarà uguale).
Le catene pesanti sono delle glicoproteine e sono dette “pesanti” perché hanno il doppio degli
amminoacidi rispetto alle catene leggere e quindi 440 amminoacidi. Nell’ambito delle catene
pesanti abbiamo 5 classi: α, γ, δ, ε, μ. Queste contraddistinguono le classi anticorpali e
rispettivamente: IgA, IgG, IgD, IgE ed IgM ognuna portante una diversa catena. Queste classi si
contraddistinguono per un bel numero di amminoacidi. In queste classi si distinguono anche delle
sottoclassi: due per le IgA (IgA 1 e IgA2) e quattro per le IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4). Le catene

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pesanti, come abbiamo detto sono delle glicoproteine e presentano dei radicali carboidratici. Questi
radicali svolgono ben 4 funzioni:
1) mantengono la molecola anticorpale nella giusta conformazione;
2) proteggono alcuni classi anticorpali dall’azione degli enzimi proteolitici;
3) favoriscono la sintesi dell’anticorpo;
4) favoriscono il catabolismo della molecola anticorpale da parte di cellule epatiche che
presentano dei recettori per l’Fc.
Nell’ambito delle catene aminoacidiche, sia delle catene leggere sia delle catene pesanti, sono state
viste delle particolari regioni dotate di autonomia, tanto che sono state chiamate domini.
Nelle catene leggere troviamo un dominio Variabile ed un dominio Costante; nelle catene pesanti
distinguiamo un dominio Variabile e quattro domini Constanti; ognuno di questi domini ha una
funzione ben precisa.La catena pesante con la catena leggera sono tenute insieme da legami
disolfuro intracatena. Ogni dominio è costituito da 100-110 amminoacidi e in una determinata
posizione ogni dominio presenta residui di cisteina distanziati da 60 amminoacidi. Tra i due residui
di cisteina si stabilisce un legame disolfuro intracatena. Ciò permette di dare origine al loop
(conformazione ad anello).
L’analisi cristallografica del dominio ha rivelato una situazione molta complicata: ogni dominio è
formato da due foglietti β-planari antiparalleli; in questi foglietti c’è un’alternanza di amminoacidi
idrofobici (che si trovano all’interno) ed idrofilici (che si trovano all’esterno). Questi due foglietti
sono stabilizzati da diverse interazioni idrofobiche e da un unico legame disolfuro. Se facciamo un
analogia con il tramezzino possiamo dire che i due foglietti β sono le due fette di pancarrè, il
condimento rappresenta le interazioni idrofobiche e lo stuzzicadenti rappresenta invece il ponte
disolfuro.
Come più volte si è ripetuto nel corso del documento, nell’immunoglobulina abbiamo individuato
una regione costante ed una regione variabile. La variabilità non è segregata all’intera regione
variabile ma nell’ambito del dominio variabile, sia della catena pesante, sia della catena leggera,
sono presenti delle regioni relativamente variabili, chiamate “frame wall” (che in italiano vuol dire
cornice), che rappresentano lo scheletro del dominio variabile (le frame wall sono 4). Ancora
nell’ambito delle catene pesanti e leggere sono presenti 3 regioni altamente variabili, regioni
“Ipervariabili”, le quali trovano perfetta complementarietà con gli epitopi antigenici e prendono il
nome di CDR. Il significato di tutto ciò è che nella regione variabile esiste il sito combinatorio dove
l’antigene si va a collocare. Il CDR3 è quello più variabile di tutti!
Il primo dominio costante della catena leggera (CL1) e il primo dominio costante della catena
pesante (CH1) hanno la funzione di allargare le braccia della molecola anticorpale per favorire una
migliore interazione con l’antigene. Tra il dominio C H1 e il dominio CH2 si nota una struttura strana
chiamata “regione cerniera”. Questa regione cerniera è formata a seconda della classe anticorpale da
un numero di amminoacidi che varia da 10 a 60 ed è ricca di residui di prolina. Questi residui
conferiscono all’anticorpo una certa mobilità. Dobbiamo pensare quindi che un lato della molecola
anticorpale si è responsabile del riconoscimento dell’anticorpo mentre l’altro lato è responsabile
delle funzioni dell’anticorpo: la porzione Fc è responsabile della funzione effettrice dell’anticorpo.
Le regioni variabili, vedremo, si possono associare a diverse porzioni Fc. Il dominio C H2 delle IgA,
delle IgG e delle IgD ha la funzione di attivare il complemento; l’IgM e le IgE mancano della
regione cerniera ma hanno un dominio aggiuntivo (solo esse hanno 4 domini costanti mentre IgA,
IgG, IgD hanno 3 domini costanti): il dominio CH2 svolge la funzione della regione cerniera e il
dominio CH3 (nelle IgM e nelle IgE) ha funzione di attivare il complemento. Il dominio CH3 nelle
IgA, IgG e nelle IgD ha la funzione, invece, ha la funzione di potenziare la fagocitosi. Il dominio
CH4 nelle IgM e nelle IgE svolge la funzione di potenziare la fagocitosi.