il pomodoro ricerca

Geni aucsia
Barbara Molesini, Giuseppe Leonardo Rotino

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ricerca

Geni Aucsia
Introduzione
La famiglia genica Aucsia (Auxin cum silencing action) è stata
recentemente identificata nel pomodoro ed è composta da due
membri, SlAucsia-1 e SlAucsia-2. Studi di genomica funzionale
hanno dimostrato che i geni Aucsia sono coinvolti nelle fasi iniziali
dello sviluppo del frutto e agiscono su diversi processi biologici
controllati dall’auxina.

Studio della funzione dei geni Aucsia nel pomodoro

mediante silenziamento genico
Il gene SlAucsia-1 è stato identificato per primo, nell’ambito di
uno studio condotto su piante di pomodoro non partenocarpi-
che e su piante partenocarpiche, transgeniche per DefH9-iaaM e
DefH9-RI-iaaM. L’analisi prevedeva di isolare la popolazione dei
trascritti presenti nelle gemme fiorali di controllo e di confrontarla
con quelle derivanti dai germogli fiorali delle piante partenocarpi-
che. Lo scopo dell’esperimento era quello di individuare geni dif-
ferenzialmente espressi nelle piante partenocarpiche rispetto alle
piante controllo che potessero essere implicati nelle fasi precoci
di sviluppo del frutto.

4
Livello di espressione relativa

3
dei geni SlAucsia

0
Gemma Impollinazione/ Crescita
fiorale fecondazione ovario/frutto

SlAucsia-1 SlAucsia-2
Espressione dei geni Aucsia in fasi iniziali di sviluppo del frutto. Gemma
fiorale raccolta prima dell’antesi, fiore aperto (2 giorni dopo l’antesi,
stadio in cui normalmente si ha l’impollinazione e/o la fecondazione),
crescita dell’ovario/frutto (4-5 giorni dopo l’antesi). Il livello di espressione
nelle gemme fiorali di SlAucsia-2 è circa 3 volte maggiore rispetto a quello
di SlAucsia-1. Si osserva in seguito all’impollinazione e alla fecondazione
del fiore una notevole diminuzione (97%) nell’espressione di entrambi
i trascritti genici

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 geni Aucsia

Schema del processo di RNA silencing

A Schema del processo di RNA

dsRNA silencing
• A) Il processo molecolare dell’RNA
DICER silencing viene innescato da una

molecola di RNA a doppio filamento
(dsRNA). Attraverso un enzima
siRNA chiamato Dicer, la sequenza di dsRNA
è tagliata in frammenti di lunghezza
minore (short interfering RNA
o siRNA). Il breve frammento di dsRNA
si associa a un complesso enzimatico
denominato RISC (RNA-interference
silencing complex). Il dsRNA viene
RISC srotolato (probabilmente per l’attività
dell’enzima elicasi) e reso a singolo
filamento, solo uno dei due filamenti
mRNA bersaglio resta associato a RISC (il filamento
antisenso). siRNA viene portato dal
RISC in corrispondenza dell’mRNA
bersaglio complementare. Un elemento
Degradazione dell’mRNA bersaglio
del RISC è in grado di operare un taglio
sull’mRNA che viene quindi degradato
• B) Costrutti genici in grado di generare
B
RNA silencing portano due sequenze
Spaziatore (braccio senso e braccio antisenso)
Promotore Terminatore poste in orientamento invertito e
separate da una sequenza spaziatrice.
Braccio Braccio
Il costrutto genico, una volta trascritto
senso antisenso
RNA a “forcina” nella pianta, genera una molecola
di RNA a forcina. Questo RNA a doppio
È importante ricordare che nelle piante non partenocarpiche filamento elicita il silenziamento del
l’allegagione e la crescita dell’ovario/frutto avvengono in segui- gene bersaglio
to all’impollinazione e alla fecondazione del fiore (fiore all’antesi
ovvero stadio di fiore aperto), mentre nelle piante partenocarpi-
che DefH9-iaaM e DefH9-RI-iaaM lo sviluppo dell’ovario/frutto è
anticipato a uno stadio che precede l’antesi, quando ancora la
gemma fiorale è chiusa.
Con queste analisi sono stati identificati 212 trascritti differenzial-
mente espressi, 65 di questi (31%) aventi funzione sconosciuta.
Nell’ambito di questa classe è stato identificato il trascritto ge-
nico SlAucsia-1, la cui espressione nelle piante partenocarpiche
era ridotta di circa un 60% rispetto alle piante controllo. L’analisi
mediante software dedicati ha permesso in seguito di identificare
all’interno del genoma di pomodoro un secondo gene, chiamato

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ricerca
Frutti partenocarpici nelle piante silenziate
per i geni Aucsia. Frutti partenocarpici
obbligati in cui si nota l’umbonatura nella
parte basale del frutto. In basso è riportata
la sezione di un frutto partenocarpico
maturo in cui si notano i due loculi interni
vuoti per la totale assenza di semi
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SlAucsia-2, che mostrava, a livello del trascritto genico corrispon-
dente, un’identità di sequenza con SlAucsia-1 dell’85%.
I geni Aucsia sono espressi, sebbene con un diverso livello di
espressione (il trascritto genico di SlAucsia-2 è più abbondante
del trascritto genico di SlAucsia-1), in tutti i tessuti della pianta
ma, preferenzialmente, nelle gemme fiorali allo stadio di pre-an-
tesi, per poi diminuire quasi totalmente dopo che sono avvenute
l’impollinazione e la fecondazione del fiore (4-5 giorni dopo l’an-
tesi), stadio in cui il frutticino inizia a crescere.
I geni SlAucsia-1 e SlAucsia-2 codificano per mini proteine di 53
aminoacidi che sono conservate nella maggior parte delle piante
terrestri e in alcune alghe verdi unicellulari. Questo alto grado di
conservazione dei peptidi potrebbe indicare un ruolo funzionale
simile dei geni Aucsia in tutte le piante terrestri.
La regolazione dell’espressione dei geni Aucsia durante le prime
fasi di sviluppo del frutto di pomodoro ha suggerito una loro pro-
babile implicazione nella formazione del frutto stesso.
Per determinare il loro effettivo ruolo funzionale nel pomodoro, è
stato sviluppato un approccio di silenziamento genico detto an-
che RNA silencing. Silenziare (= spegnere) un gene di interesse
significa inattivare la sua espressione e questo può avvenire per
esempio per degradazione dell’mRNA corrispondente, impeden-
do conseguentemente che l’informazione in esso contenuta ven-
ga tradotta in proteina. Una diminuita sintesi o una totale assenza
di sintesi della proteina può portare nella pianta alla comparsa di
alterazioni fenotipiche, dalla cui osservazione si può risalire alla
funzione del gene bersaglio.
RNA a doppia elica di sequenza omologa al gene/i bersaglio che
si vogliono silenziare sono in grado di innescare l’RNA silencing.
Per produrre queste molecole innesco, si possono costruire geni
sintetici, costituiti da due sequenze omologhe al gene di interesse
poste in orientamento invertito, separate da uno spaziatore, che
una volta inseriti stabilmente nella pianta esprimono RNA a forci-
na (ovvero RNA a doppio filamento) che danno inizio al processo
di spegnimento del gene bersaglio.
Il costrutto genico messo a punto per silenziare i geni Aucsia por-
ta ripetuta e in orientamento invertito una sequenza lunga 200
bp del gene SlAucsia-1 e produce nella pianta la formazione di
una molecola a doppio filamento che serve da guida per la de-
gradazione dell’mRNA di SlAucsia-1. L’alto grado d’identità dei
trascritti genici di SlAucsia-1 e SlAucsia-2 ha permesso, con il
solo costrutto diretto verso il gene SlAucsia-1, di innescare anche
il silenziamento del gene SlAucsia-2.
È stato dimostrato che il silenziamento dei geni Aucsia di pomodo-
ro determina partenocarpia. Le gemme fiorali raccolte allo stadio
pre-antesi dalle piante silenziate nei geni Aucsia contengono 100
volte più auxina rispetto alle gemme fiorali controllo. Il fenotipo par-
tenocarpia può quindi essere spiegato come conseguenza dell’ele-
 geni Aucsia

vato contenuto di auxina a livello delle giovani gemme fiorali che,

mimando il segnale/i positivo/i che derivano normalmente dalla fe-
condazione del fiore, attiva il programma di sviluppo del frutto.

Partenocarpia ottenuta mediante silenziamento dei geni

Aucsia
I frutti partenocarpici, essendo in grado di svilupparsi in assenza
di fecondazione, sono privi di semi (frutti apireni). Come è noto la
partenocarpia può essere facoltativa oppure obbligatoria.
Nelle piante silenziate per i geni Aucsia sono stati osservati i due
tipi di partenocarpia. I frutti partenocarpici facoltativi presenta-
vano forma simile ai frutti controllo, mentre i frutti partenocarpici
obbligati erano spesso umbonati, una malformazione che solita-
mente si osserva in serra quando i fiori di pomodoro vengono
trattati con dosi eccessive di fitoregolatori alleganti.
La partenocarpia che deriva dalla soppressione dei geni Aucsia
è innovativa rispetto a quelle descritte precedentemente, poiché
è stata ottenuta seguendo un approccio di tipo intragenico e non
transgenico, ovvero senza introduzione nel genoma di pomodoro
di un gene esogeno (estraneo ovvero un transgene), ma attraver-
so la regolazione di un gene naturalmente presente nel genoma
della pianta stessa.
La scoperta dei geni Aucsia potrebbe essere il punto di partenza
per portare in futuro al conferimento di partenocarpia mediante
un approccio di tipo cisgenico. In tal caso il costrutto genico sarà
costituito in tutte le sue parti (promotore, regione codificante, ter-
minatore) da porzioni di geni che sono familiari alla pianta stessa,
in quanto derivati da una pianta donatrice dello stesso genere o
specie.
In questo modo, potrebbero essere superate tutte le problemati-
che di carattere etico legate all’inquinamento genico ovvero all’in-
troduzione di materiale estraneo in varietà o cultivar.

Importanza della scoperta della famiglia genica Aucsia

L’auxina regola la maggior parte dei processi di sviluppo della
pianta quali per esempio la risposta alla luce e alla gravità, lo svi-
luppo del frutto, la crescita delle radici e lo sviluppo delle foglie.
Data l’importanza che questo ormone riveste per la vita di tutti gli
organismi vegetali, l’auxina dal secolo XIX è sempre stata oggetto
d’indagine. A oggi, il suo meccanismo d’azione è in buona parte
conosciuto, tuttavia molti aspetti riguardanti la regolazione della
concentrazione dell’ormone a livello cellulare e tissutale risultano
ancora elusivi.
La scoperta dei geni Aucsia è rilevante sia per le sue ricadute
applicative in agricoltura sia da un punto di vista euristico, poi-
ché potrebbe contribuire ad aumentare l’informazione riguardo ai
meccanismi molecolari sottesi all’azione dell’auxina nello svilup-
po della pianta.

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