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MEMBRANE

Funzioni - Delimitano i contorni e fungono da barriere di permeabilità


Le membrane intracellulari dividono in compartimenti funzionali l’interno delle cellule
- Costituiscono i siti di specifiche proteine
Esemplificata dai numerosi enzimi presenti nelle o sulle membrane
- Regolano il trasporto dei soluti
Le modalità di trasporto sono molto varie
Diffusione semplice e facilitata o trasporto attivo
- Specifiche proteine rilevano e trasmettono segnali elettrici e chimici
Operano la Trasduzione del segnale
Essa è differente in base al tipo di segnale che deve essere recepito e ritrasmesso
Può essere che il segnale entri direttamente (estrogeni)
ma più spesso si legano a recettori che sfruttano secondi messaggeri
- Mediano l’adesione e la comunicazione cellula-cellula
La comunicazione intercellulare è stabilita dalle giunzioni comunicanti (Gap Junction)

Modello a Mosaico Fluido (Singer e Nicholson)


Si pensa sia applicabile a tutte le membrane biologiche
La membrana è costituita da un doppio strato lipidico fluido con proteine al suo interno e sulla sua superficie

Il fluido – I lipidi
Costituito da tre classi di lipidi differenti
- Fosfolipidi
Fosfogliceridi (derivati da glicerolo)
Sfingolipidi (derivati dalla sfingosina)
Variano in proporzione a seconda del tipo di membrana e dalla sua origine
- Glicolipidi
Carboidrati + Lipidi
Particolarmente presenti nelle membrane delle cellule nervose (come gangliosidi)
- Steroli
Lo sterolo più importante per le membrane delle cellule animali è il colesterolo
(nelle cellule vegetali ci sono differenti classi di fitosteroli)
Gli acidi grassi fanno parte delle molecole di tutti i lipidi di membrana, tranne per gli steroli
Le loro lunghe code idrocarburiche idrofobe: Impediscono la diffusione nei soluti polari
Impongono una larghezza di membrana di 6-8nm
Asimmetria di membrana
Distribuzione ineguale dei lipidi nei due monostrati
Determinata durante la sua biogenesi
Mantenuta poiché il movimento dei lipidi da un monostrato all’altro richiede che le teste idrofile passino attraverso la
parte idrofoba della membrana
Possibile solo attraverso flippasi, relativamente raro
I movimenti dei lipidi sono più spesso (e continuatamente) di diffusione laterale
Funzionamento solo allo stato fluido
Ogni doppio strato lipidico possiede una temperatura di transizione T
Sotto di essa gelifica
Interrompe tutte le funzioni che dipendono dalla mobilità e dai cambiamenti conformazionali
Trasporto soluti, comunicazioni cellula-cellula, motilità cellulare
La fluidità dipende dai lipidi che contiene e dal loro grado di insaturazione
Il colesterolo: diminuisce la fluidità a temperature superiori a T
aumenta la fluidità a temperature inferiori a T
Il singolo gruppo ossidrillico (l’unica parte polare) è orientato vicino alla testa polare di un fosfolipide adiacente
Forma un legame idrogeno che: rende la membrana meno fluida
impedisce l’impacchettamento dei fosfolipidi a basse T
Adattamento omeoviscoso
Capacità di compensare alle variazioni di temperatura esterne variando la composizione lipidica delle membrane
Caratteristica degli organismi pecilotermi
Zolle lipidiche
Sono aree del monostrato esterno più spesse e meno fluide
Hanno più colesterolo e glicosfingolipidi
Ruolo di rilevamento e risposta a segnali chimici, per via della presenza di chinasi sulla superficie
Caveole
Piccole invaginazioni di membrana plasmatica rivestite da una proteina che lega il colesterolo, la caveolina
Il mosaico – Le proteine
Proteine integrali di membrana
Molecole anfipatiche Una o più regioni idrofile in un lato di membrana
Una o più regioni idrofobe all’interno della membrana
- Proteine integrali monotopiche
Relativamente rare proteine che sporgono solo da un lato di membrana
- Proteine integrali transmembrana
Attraversano totalmente la membrana, e le regioni idrofile sporgono da entrambi i lati
- Monopasso
Attraversano la membrana una sola volta
Possiedono un solo segmento transmembrana
L’estremità N-terminale sporge internamente
L’estremità C-terminale sporge esternamente
- Multipasso
Se a peptide singolo = Monomeriche
Se a peptidi multipli = Multimeriche
I segmenti transmembrana sono molti
Non è possibile prevedere quale estremità sporga dove, se non sperimentalmente
Ancorate al doppio strato lipidico grazie ai segmenti transmembrana idrofobi
Solitamente sono ad ά-elica da 20-30 residui amminoacidici
Le porine hanno un segmento a foglietto β modificato (barile β)
Proteine periferiche di membrana
Prive della componente idrofoba, non penetrano nella membrana
Sfruttano forze elettrostatiche deboli e legami ad idrogeno per collegarsi alla superficie della membrana
Solitamente si associano alla faccia interna della membrana
Formano una struttura scheletrica che aiuta a sostenere la stessa
Proteine di membrana ancorate ai lipidi
Le catene polipeptidiche si trovano su una delle superfici del doppio strato
Sono unite con legame covalente a molecole lipidiche all’interno della membrana
- Legate alla superficie interna
Sono legate con un legame covalente:
- ad acidi grassi
Sono sintetizzate nel citosol
- a un gruppo prenile
Sono sintetizzate nel citosol e modificate
- Legate alla superficie esterna
Sono legate con un legame covalente al GPI
Sono sintetizzate nel RE come proteine monopasso e poi modificate
Funzioni: Proteine di trasporto, Proteine canale (ATPasi di trasporto), Recettori, Connessoni
Secrezione ed assorbimento di sostanze
Stabilizzazione e modellamento della membrana
Asimmetria
Le proteine integrali sono orientate asimmetricamente lungo la membrana
Un’estremità è chimicamente differente dall’altra
Riflettono una specifica necessità cellulare
Glicoproteine
Proteine associate ai carboidrati (prodotto di una glicosilazione)
Sono più abbondanti nelle membrane plasmatiche
Il loro ruolo principale è nel riconoscimento legami cellula-cellula
Sono sempre posizionate con i gruppi glucidici che sporgono esternamente
Formano in molte cellule animali il glicocalice
Mobilità
Ulteriore discrimine per descrivere le proteine
Alcune sembrano muoversi liberamente
Altre sono legate a complessi e non possono spostarsi
Diffondono molto più lentamente dei lipidi, ma a velocità variabile
Sono molto più grandi
Diffondono in aree preferenziali, domini di membrana
Cellule polarizzate = cellule le cui proteine si trovano tutte nello stesso dominio di membrana
TRASPORTO ATTRAVERO LE MEMBRANE
Diffusione Semplice
“Limiti” della diffusione semplice
Dimensioni
Il doppio strato è permeabile solo a molecole piccole
Sotto i 100 Da
Polarità
Il doppio strato è relativamente permeabile alle molecole apolari
Le molecole apolari si sciolgono facilmente nella fase idrofoba
Carica
Il doppio strato è altamente impermeabile agli ioni
Ciò a causa delle forti interazioni con l’acqua, con cui creano gusci di idratazione
Perderli è un processo molto endoergonico
Si tratta di diffusione passiva di molecole che attraversano la membrana in moto costante
Tende a creare una distribuzione causale in cui la concentrazione è la stessa in ogni punto
E’ sempre un movimento verso l’equilibrio e tende al minimo contenuto di energia libera
Nella diffusione, l’energia procede dalle regioni a en. libera più alta verso quelle a en. libera più bassa
Osmosi
Tendenza dell’acqua ad attraversare una membrana sempre dal lato a concentrazione minore (con più elevata energia
libera) verso quello a concentrazione maggiore (con più bassa energia libera)

Velocità
Le molecole diffondono casualmente in entrambe le direzioni, ma il flusso netto avviene sempre secondo gradiente
La velocità è direttamente proporzionale alla differenza di concentrazione tra le membrane

Diffusione Facilitata
Le sostanze che sono troppo grandi o cariche per passare tra le membrane ad una velocità apprezzabile secondo gradiente,
sfruttano la diffusione facilitata, si appoggiano, cioè, a proteine di trasporto
Proteine Carrier (permeasi)
- Si legano ad una o più molecole di soluto
Legame iniziale del substrato (soluto) con un sito specifico sulla proteina
Alta specificità, spesso solo per uno ione o una famiglia ristretta di molecole
- Subiscono un cambiamento conformazionale
Simili ad enzimi
Modello delle Conformazioni Alternative
Una proteina carrier è una proteina allosterica e il soluto il suo effettore allosterico
Si alterna tra due stati conformazionali
- Trasferiscono il soluto dal lato opposto della membrana
Rapporto velocità – concentrazioni iniziali
E’ descritto da una iperbole
In base alla quantità di soluto trasportato si distinguono:
- Uniporto = un solo soluto
- Trasporto accoppiato = più soluti
In base alla direzione dei due soluti si distinguono:
Simporto = soluti procedono nella medesima direzione
Antiporto = soluti procedono in direzioni contrarie
Canali transmembrana
- Canali ionici
Molto piccoli
Altamente specializzati
Ne consegue che devono essere presenti in grandi numeri per risultati apprezzabili
Possibilità di controllo
A voltaggio = si aprono/chiudono in risposta a cambiamenti del potenziale di membrana
Meccanico = in risposta a sollecitazioni meccaniche sull’esterno della membrana
- Porine
Molto grandi
Relativamente aspecifici
Pori costituiti da proteina transmembrana multipasso
La parte interna del poro con catena polari
La parte esterna del poro con catene apolari
- Acquaporine
Presenti nelle membrane delle cellule di alcuni tessuti (rene umano)
Facilitano il flusso veloce dell’acqua nelle cellule che lo richiedono
Risposta parziale al problema non ancora risolto delle grandi quantità di acqua che attraversano la
membrana
Trasporto Attivo
Il trasporto attivo determina movimento contro gradiente (lontano dall’equilibrio termodinamico)
E’ sempre un processo endorgonico
Le proteine di membrana devono perciò affiancare all’azione di trasporto una reazione che ceda energia
Assolve tre funzioni:
- Permette l’assorbimento di sostanze con concentrazioni esterne molto basse
- Permette l’espulsione di sostanze dalla cellula
- Consente alla cellula di mantenere concentrazioni intracellulari di ioni in uno stato stazionario di non equilibrio
E’ un modo per stabilire differenze nel potenziale elettrico attraverso le membrane
Possiede una direzionalità intrinseca
(Sebbene alcuni trasporti attivi possano essere anche reversibili)
Sono classificati per fonte di energia e numero di soluti:
- Trasporto attivo diretto
L’accumulo delle molecole su un lato della membrana viene direttamente accompagnato
dall’idrolisi dell’ATP
ATPasi di tipo P (fosforilazione)
L’ATP fosforila in modo reversibile queste ATPasi
Sono presenti nella pompa Na/K
ATPasi di tipo V (vacuolo)
Pompano protoni in organuli come vacuoli o vescicole
ATPasi di tipo F (fattore)
Pompano protoni in mitocondri e batteri
Sono capaci di sintetizzare ATP partendo dai gradienti
Quando operano il processo inverso sono dette ATPsintetasi
ATPasi di tipo ABC
Sono una superfamiglia estremamente varia
Trasportano una notevole quantità di soluti (zuccheri o amminoacidi)
- Trasporto attivo indiretto
Dipende dal trasporto simultaneo di due soluti: il primo soluto secondo gradiente, attiva quello contro
gradiente del secondo
Si differenziano per direzione:
Simporto = entrambi i soluti si dirigono nella stessa direzione
Antiporto = i soluti vanno in direzioni contrarie
Pompa Na/Glucosio
Pompa Na/K (trasporto attivo)
Costituita da una proteina transmembrana tetramerica, con due subunità ά e due subunità β
Le subunità ά hanno sul lato citoplasmatico = i siti di legame per ioni sodio e ATP
sul lato extracellulare = i siti di legame per gli ioni potassio
E’ una proteina allosterica con due conformazioni alternative (E1 e E2)

1 = la pompa è aperta verso l’interno (E1)


2 = tre ioni sodio vengono presi dall’interno
3 = l’ATP fosforila le subunità ά
4 = la fosforilazione porta ad un cambiamento conformazionale (E1>E2)
5 = vengono espulsi i tre ioni sodio
6 = la pompa si apre verso l’esterno (E2)
7 = due ioni potassio vengono presi dall’esterno
8 = le defosforilazione porta ad un cambiamento conformazionale (E2>E1)
9 = due ioni potassio vengono espulsi all’interno
10 = la pompa è aperta verso l’interno (E1)
VIE DI SECREZIONE
Il circuito che le proteine fanno, dopo essere state sintetizzate dal RE ed essere state modificate dal Golgi
Ha come destinazioni le vescicole di secrezione ed i granuli di secrezione
Secrezione costitutiva
Dopo la gemmazione dalla faccia trans del Golgi, alcune vescicole si muovono direttamente verso la superfice
cellulare, dove si fondono e rilasciano all’esterno il loro contenuto
E’ spontaneo
E’ continuo
E’ Indipendente da segnali extracellulari
Secrezione regolata
Le vescicole occupate in questo tipo di secrezione si accumulano nella cellula e si fondono con la membrana
solo in risposta a specifici segnali extracellulari (neurotrasmettitori, per es)
Le vescicole gemmano immature, perdono il loro rivestimento di clatrina e maturano
La maturazione comporta la condensazione delle proteine
Se sono particolarmente grandi e dense sono dette granuli di secrezione
L’informazione necessaria per indirizzare una proteina alle vescicole è contenuta nella sequenza
amminoacidica
In questo caso, attendono segnali di esocitosi

ESOCITOSI ED ENDOCITOSI
Esocitosi
Le cellule animali secernono in questo modo enzimi digestivi, ormoni, muco e proteine del latte
1- La vescicola secretoria si avvicina alla membrana plasmatica
2- La membrana della vescicola si fonde con quella plasmatica
Innescata da uno specifico segnale extracellulare (ormone o neurotrasmettitore)
Si lega a specifici recettori presenti sulla superficie cellulare e innesca sintesi o rilascio di un
secondo messaggero
L’aumento del calcemia è altrettanto importante
Innesca una cascata di segnali che portano la vescicola ad avvicinarsi financo a fondersi
Porta all’attivazione di protein-chinasi le cui proteine bersaglio sono proteine delle membrane
3- Il contenuto della vescicola viene scaricato all’esterno
4- La membrana della vescicola si integra nella membrana plasmatica
La parte luminale va a comporre la superficie esterna della membrana plasmatica
Glicoproteine e glicolipidi ancorati alla membrana plasmatica si rivolgono allo spazio intercellulare
Endocitosi
1- Un piccolo segmento di membrana si introflette progressivamente
In risposta a particolari segnali, spesso provenienti dalle stesse molecole che assorbirà
2- Si restringe e circonda i materiali, formando una vescicola di endocitosi
3- La vescicola si distacca dalla membrana plasmatica
Attraverso la proteina dinamina
4- Il materiale esterno viene così portato all’interno della cellula
Internalizza porzioni di membrana plasmatica (mentre l’esocitosi le apporta)
La composizione stazionaria della membrana plasmatica è un equilibrio tra questi due moti

Fagocitosi (cellula che mangia)


Negli eucarioti unicellulari per cibarsi
Molecole superiori ai 0,5micrometri
Negli organismi più complessi ambito solo di poco cellule specializzate (fagociti)
Neutrofili e Macrofagi, con funzione protettiva e di difesa
Il contatto con la cellula bersaglio innesca l’inizio della fagocitosi
Si polimerizza actina, pseudopodi circondano l’oggetto fino a fondersi ed inglobarlo formando un vacuolo
fagocitico intracellulare
Pinocitosi (cellula che beve)
- Endocitosi clatrina-dipendente
Internalizzazione specifica di macromolecole (come LDL, Lipoproteina a Bassa Densità)
1- Le molecole si legano a recettori specifici di membrana
2- I complessi recettore-ligando si spostano per diffusione laterale in fossette rivestite
3- Invaginazione prodotta da Clatrina e Proteina Adattatrice
4- Formazione della vescicola grazie a Dinamina ed internalizzazione del materiale extracellulare
5- Perdita di Clatrina e possibilità di fondersi con altre membrane intracellulari (endosomi precoci)
6a- Verso un endosoma tardivo per la digestione
6b- Verso il sistema di endomembrane ed il relativo trasporto
6c- Verso un’altra regione della membrana plasmatica ed esocitosi (Transcitosi)
- Endocitosi clatrina-indipendente
Internalizzazione non specifica di fluidi extracellulari
La concentrazione delle molecole racchiuse nelle vescicole rispecchia quella extracellulare
E’ una strategia di controllo di Volume ed Area superficiale della cellula

VESCICOLE
La natura proteica del rivestimento è indicatrice dell’origine e della destinazione della vescicola stessa, e – quindi – del tipo
Vescicole rivestite da Clatrina
Sono circondate da rivestimenti composti da due proteine multimeriche:
- Clatrina
Le strutture alla base dei reticoli di clatrina sono i triskelion
Ciascun triskelion ha tre bracci
Costituiti da tre grandi polipeptidi e tre piccoli polipeptidi che si irradiano dal centro
I triskelion si posizionano ai vertici del reticolo poligonale
Ciascun spigolo del reticolo è prodotto dalla sovrapposizione di tra bracci di tre triskelion
L’assemblaggio è un processo relativamente energetico
Tre molecole di ATP per triskelion
- Proteina Adattatrice
Capacità di promuovere il rapido assemblaggio dei rivestimenti di clatrina
Ne esistono almeno quattro tipi differenti (ciascuno con leggere differenza)
Composti sempre da quattro polipeptidi
Due subunità di adaptina, una catena media, una catena piccola
Si legano a differenti recettori proteici
Contribuiscono a dare specificità alla gemmazione e smistamento vescicolare
- Dinamina
GTPasi citosolica richiesta per la strozzatura della fossetta rivestita e per la chiusura delle vescicole gemmate
Quando il GTP è idrolizzato, gli anelli di dinamina separano dalla membrana le vescicole
Vescicole rivestite da COP-I e COP-II
Sono circondate da rivestimenti composti da:
- COP-I o COP-II
Le COP-I sono presenti nelle vescicole retrograde
Le COP-II sono responsabili dell'assemblaggio della vescicola anteretograda
- Fattore di ribosilazione dell’ADP (ARF)
Media l’assemblaggio delle vescicole
Reagisce con uno specifico fattore di scambio associato alla membrana da cui si sta per formare la
vescicola e scambia il GDP con GTP
Ancorato, si lega a multimeri di COP-I
Per le COP-II il fattore è chiamato Sarl
Si occupano del trasporto tra le cisterne del Golgi e tra RE e Golgi, aiutate da diverse famiglie di proteine
Proteine SNARE
Facilitano lo smistamento e l’indirizzamento delle vescicole
- Recettori SNAP della vescicola
Sono localizzate sulle vescicole di trasporto
- Recettori SNAP del bersaglio
Si trovano sulle membrane bersaglio
Sono specifiche e complementari
GTPasi Rab
Entrano in gioco quando la vescicola raggiunge la sua destinazione
Sono specifiche ed ogni destinazione ha membri diversi di Rab associati
Proteine di ancoraggio
Agiscono su distanze maggiori e potrebbero dare specificità maggiore delle SNARE
- Ad avvolgimento elicoidale
Come le “golgine”, presenti nel legame con il Golgi
- A multisubunità
Famiglia molto vasta di proteine anche estremamente complesse (a otto multisubunità)
Caveole
Si occupano di facilitare l’attraversamento della membrana a molecole specifiche (anticorpi, fattori del complemento)
Sono rivestite da caveolina
Produce introflessioni a forma di fiasca nella membrana plasmatica
LISOSOMI
Organuli contenenti enzimi digestivi
Variano considerevolmente in forma e dimensioni (generalmente 0,5 micrometri)
Circondati da una singola membrana
Determinante per proteggere il resto della cellula dagli enzimi litici
Pompe protoniche mantengono un pH fortemente acido (4)
Gli enzimi lisosomiali sono svariati e variegati
Sono tutti idrolasi acide
Fosfatasi, Proteasi, Peptidasi, Nucleasi…
Possono digerire tutte le principali classi di molecole biologiche
Sviluppo
1- Gli enzimi lisosomiali vengono sintetizzati nei ribosomi del REr, trasferite nel lume del RE ed inviati al Golgi
2- Subiscono modificazioni e vengono selezionati da proteine dal transGolgi
3- Vengono impacchettati in vescicole rivestite di clatrina, che gemmano dal transGolgi
4- Maturano perdendo il rivestimento e raggiungono uno dei compartimenti endosomiali
Molto spesso sono portati ad endosomi tardivi
Gli endosomi tardivi hanno un corredo completo di idrolasi acide, ma nessuna attività digestiva
5- Le pompe protoniche abbassano il pH dell’endosoma tardivo fino a 5
6a- L’endosoma tardivo matura in un lisosoma
Pompe protoniche abbassano ulteriormente il pH per attivare le idrolasi acide
6b- L’endosoma tardivo si fonde con un lisosoma già esistente
- Modello dell’ibrido
Endosoma tardivo e lisosoma si fondono per formare un organulo temporaneo
- Modello della fusione transitoria
Endosoma tardivo forma connessione temporanee che riversano il suo contenuto in un lisosoma
Funzioni
Difesa e Nutrizione
Le vescicole di endocitosi possono
- Accumulare enzimi lisosomici attraverso fusioni transitorie
- Fondersi con lisosomi e rilasciare entro essi il loro contenuto
I prodotti solubili della digestione (zuccheri) vengono trasportati nel citosol attraverso membrana lisosomale
I prodotti non digeriti formano il corpo residuo
Nei protozoi è espulso
Negli vertebrati è accumulato
Autofagia
Disgregazione e smaltimento di componenti cellulari inutili o dannosi
- Macrofagia
Un organulo viene accolto da una doppia membrana di derivazione dal RE
Si forma una vescicola detta vacuolo autofagico
- Microfagia
Si forma un vacuolo autofagico piccolissimo intorno a ristrette porzioni di citoplasma
Non si occupa di organuli
E’ presente in modo naturale nelle cellule sane
Aumenta esponenzialmente nelle cellule che subiscono stress da fame
Digestione extracellulare
Casi eccezionali per cui i lisosomi rilasciano i loro enzimi al di fuori della cellula
Durante la fecondazione, lo spermatozoo rilascia enzimi lisosomiali per fondere le barriere chimiche
Perossisomi
Sono composti da una sola membrana
Non derivano dal RE e non ne fanno parte (a differenza dei lisosomi)
Sono presenti in tutte le cellule eucariotiche
Abbondanti nelle cellule renali e negli epatociti
Presentano l’enzima catalasi
Essenziale per la degradazione del perossido di Idrogeno
Tossico in quanto produce reazioni ossidative estremamente dannose
Formazione e degradazione di H2O2 avvengono nello stesso organulo
Degradano gli xenobiotici (sostanze insolite, D-amminoacidi, carburi)
Richiedono proteine perossine per la biogenesi
- Divisione di perossisomi esistenti
- Formazione in specifiche vescicole (come i lisosomi)
- Combinazione delle due strategie
TRASDUZIONE DEL SEGNALE – CELLULE NERVOSE
Raccoglie, rielabora e re-invia l’informazione - Sistema Nervoso Centrale (SNC)
- Sistema Nervoso Periferico (SNP)
Sistema Nervoso Somatico
Controllo dei movimenti volontari
Sistema Nervoso Autonomo
Controllo attività involontarie
Cellule Neuroni
Costituiti da soma, dentriti, cono di emergenza, assone, bulbi terminali e sinapsi
Cellule Gliali
Microglia = Cellule fagocitiche responsabili di combattere le infezioni
Oligodendrociti = Formano la guaina mielinica degli assoni del SNC
Cellule di Schwann = Formano la guaina mielinica degli assoni del SNP
Astrociti = Controllano l’accesso del liquido extracellulare ai vasi intorno ai neuroni
Potenziale di membrana
Si genera per diverso contenuto di anioni e cationi all’interno ed all’esterno della cellula
Tutte le sostanze tendono a diffondere dall’area in cui si trovano a concentrazione maggiore a quella a concentrazione minore
Concentrazione alta all’interno della cellula di ioni potassio = gradiente dello ione potassio
Elettroneutralità, ossia tendenza all’equilibrio di carica
Gli ioni sodio fanno da controanioni agli ioni potassio
Potenziale
Tendenza a riunirsi di due cariche separate
Il loro movimento genera una corrente
La pompa Na/K è alla base del potenziale di riposo della membrana
Contribuisce a mantenere il gradiente ionico del potassio
Gli ioni potassio tendono a diffondere all’esterno della cellula (rendendo il potenziale negativo)
Polarizzano la membrana
Gli ioni sodio tendono ad entrare nella cellula (rendendo il potenziale positivo)
Depolarizzano la membrana
L’ingresso di ioni cloruro
Se presente sodio = inibisce l’effetto depolarizzante
Se controioni assenti = comporta l’iperpolarizzazione della membrana
Eccitabilità elettrica
Una cellula elettricamente eccitabile, sottoposta allo stesso grado di depolarizzazione, risponde con un potenziale di azione
Il potenziale d’azione è prodotto a causa della presenza sulla membrana di canali ionici
Canali ionici voltaggio-dipendenti
Si aprono/chiudono in risposta ad un cambiamento del voltaggio di membrana
- Canali ionici voltaggio-dipendenti del Potassio
Proteine multimeriche
- Canali ionici voltaggio-dipendenti del Sodio
Grosse proteine monomeriche
Ciascuna subunità ha sei ά eliche transembrana (S4 fa da sensore di voltaggio)
L’apertura e la chiusura sono fenomeni “tutto o niente”
Due modalità: - Channel gating
Il canale si chiude a seguito della rotazione dell’elica transmembrana S4
Può riaprirsi a seguito di depolarizzazione
- Inattivazione del canale
Una particella inattivante (regione della proteina canale) sporge nel citosol
Allo stato di inattivazione, essa chiude il canale
Attraverso proteasi la particella inattivante può essere spostata
Una volta richiuso il canale, esso non può essere riaperto subito
Potenziale d’azione
Per poter essere innescato, il livello della depolarizzazione deve superare il potenziale di soglia
Oltre di esso, la membrana del neurone inizia a modificarsi a cascata
La depolarizzazione è causata dall’ingresso di ioni sodio e dalla fuoriuscita di ioni potassio (Ciclo di Hodgkin)
1- In neuroni a riposo, i canali voltaggio dipendenti Na/K sono chiusi
2- Raggiunto il potenziale di soglia, l’uscita del Potassio non riesce a bilanciare l’ingresso del Sodio
Il potenziale si genera non appena la velocità del Sodio supera quella del Potassio
3- Quando il potenziale di membrana arriva al suo valore massimo +40mV, il potenziale di azione si avvicina
senza raggiungere il potenziale di equilibrio del sodio
4- Inizia la ripolarizzazione dovuta all’inattivazione dei canali sodio (che restano chiusi finché pot non è neg)
5- Fase di iperpolarizzazione
Dovuta all’aumento di permeabilità al Potassio durante la fase di apertura dei canali K
Il potenziale di iperpolarizzazione si avvicina senza raggiungere il potenziale di
equilibrio del potassio
Periodo di refrattarietà assoluta e relativa
I canali del sodio sono inattivati fino alla fase di iperpolarizzazione
Una volta generato, viaggia lungo tutta la membrana secondo un processo detto propagazione
Si propaga lungo l’assone senza perdere intensità
Lo stato di depolarizzazione di membrana si diffonde passivamente alle membrane dentritiche adiacenti
La diffusione passiva porta ad un leggero e progressivo indebolimento
Il segnale di depolarizzazione diffonde fino al cono d’emergenza
I canali del Sodio sono qui concentrati (e nei nodi di Ranvier)
La continua generazione ex novo (o propagazione) di un potenziale è detta impulso nervoso
La mielinizzazione dell’assone diminuisce la sua capacitanza (tendenza a trattenere cariche elettriche)
Nei Nodi di Ranvier (presenti ogni 1-2mm dalla guaina mielinica precedente) sono concentrati canali sodio
La propagazione è detta saltatoria e permette di essere molto più rapida
Trasmissione sinaptica
Sinapsi elettriche
Assone di neurone presinaptico è collegato al dentrite di una cellula effetrice/postsinaptica con Giunzioni Comunicanti
Quando gli ioni passano da una cellula all’altra, la depolarizzazione della prima diffonde passivamente all’altra
Sinapsi chimiche
I neuroni non sono direttamente collegati tra loro
Vi è un intervallo sinaptico di 20-50 nm
Un segnale nervoso non riesce ad attraversare lo spazio senza disperdersi
Il segnale viene convertito in neurotrasmettitori
Molecole presenti nei bottoni sinaptici, la cui secrezione è stimolata dal potenziale d’azione
Si legano a proteine specifiche nella membrana del neurone postsinaptico e ritrasformano il segnale
Caratteristiche: - Devono indurre la risposta appropriata
Possono essere eccitatori/inibitori (inducono a polarizzazione/depolarizzazione)
- Devono essere presenti nel neurone presinaptico
- Devono essere rilasciati nel momento giusto ed a seguito di uno stimolo
Acetilcolina
Neurotrasmettitore di tipo eccitatorio le cui sinapsi sono dette colinergiche
Catecolammine
Comprendono dopamina, noradrenalina ed adrenalina
Derivano dall’amminoacido tirosina
Sono neurotrasmettitori di tipo eccitatorio e le specifiche sinapsi sono dette adrenergiche
Amminoacidi
Comprendono istamina, serotonina e GABA
Sono una famiglia relativamente variegata (serotonina eccitatorio, GABA inibitorio)
Neuropeptidi
Catene amminoacidiche
Neurotrasmettitori anomali e particolari
Agiscono su gruppi di neuroni con azione a lungo termine
Il calcio stimola la secrezione di neurotrasmettitori
La depolarizzazione apre momentaneamente i canali calcio voltaggio dipendenti
Massiccio aumento della concentrazione del calcio
- Favorisce il movimento delle vescicole neurosecretorie che contengono i neurotrasmettitori
- Favorisce la fusione delle vescicole neurosecretorie con la membrana plasmatica
Processo che coinvolge aggiunta gruppi fosfato alla sinapsina
I recettori per i neurotrasmettitori sono di due tipi
- Recettori ligando-dipendenti
La cui attivazione ha un effetto diretto sulla cellula
Recettore dell’acetilcolina
1- L’acetilcolina si lega al canale detto recettore dell’actilcolina
2- Il canale si apre e permette l’ingresso di ioni sodio e la depolarizzazione
Recettore del GABA
Come il recettore dell’acetilcolina, ma con passaggio di ioni cloruro
- Recettori il cui effetto è mediato da messaggeri intracellulari
I neurotrasmettitori devono essere inattivati dopo il loro rilascio
- Degradazione a forme inattive
- Riassorbimento per endocitosi
Proteine di trasporto pompano il neurotrasmettitore nel bottone presinaptico
TRASDUZIONE DEL SEGNALE – MESSAGGERI e RECETTORI
Tutte le cellule ricevono e rispondono a specifici segnali chimici esterni, possono comunicare tra loro e necessitano di essere differenziate e
specializzate (negli organismi multicellulari)
Differenziati in: Segnali endocrini – ormoni
Prodotti in sedi distanti dal tessuto bersaglio
Trasportati dal sistema circolatorio
Relativamente poco specifici
Segnali paracrini – fattori di crescita
Prodotti nelle vicinanze del tessuto bersaglio
Sono rilasciati localmente
Relativamente specifici
Segnali autocrini – peptide MHC (nei linfociti T)
Agiscono sullo stesso tessuto delle cellule che li hanno prodotti
Sono specifici
Legame ligandi-recettori
Il messaggero forma legami non covalenti con la proteina del recettore
Più legami si creano, più il legame è forte, data la debolezza individuale dei legami non covalenti
Il recettore ha un sito di legame (a cui la molecola si adatta) e specifiche catene laterali amminoacidiche
La specificità ligando-recettore dipende da queste caratteristiche
Affinità del recettore
Relazione tra concentrazione del ligando e numero di molecole del recettore occupate
L’inibizione del recettore può avvenire per: - rimozione del recettore dalla superficie cellulare
Endocitosi mediata da recettore
Invaginazione della porzione di membrana con il recettore
- modifiche chimiche del recettore che ne riducono l’affinità
Fosforilazioni più o mene reversibili
- modifiche che impediscono successive funzioni cellulari
Il legame del ligando induce una variazione conformazionale nel recettore
Ciò scatena nella cellula una cascata di eventi

I recettori
I recettori possono essere divisi in diverse categorie
- Recettori ligando dipendenti
- Recettori intracellulari
- Recettori della membrana plasmatica
Recettori associati a Proteine G
Pur avendo sequenze amminoacidiche diverse, hanno identica struttura
Sette ά eliche transmembrana connesse da anse citosoliche/extracellulari alternate
La parte N-terminale è all’esterno, la C-terminale è nel citosol
L’ansa citosolica tra la quinta e sesta ά elica è specifica per una proteina G
Sono paragonabili ad interruttori molecolari
Accesi, se hanno legato una molecola di GTP
Spenti, se hanno legato una molecola di GDP
Ne esistono due differenti famiglie: - Grandi Eterotrimeriche
Formate da tre subunità (Gά, Gβ e Gγ)
Quando Gά si lega al GTP, si stacca dal complesso Gβγ
O Gά+GTP o complesso Gβγ trasducono il segnale
- Piccole Monomeriche
Proteina Ras
Secondi messaggeri
AMP ciclico (cAMP)
1- La proteina G viene attivata dal ligando
2- La proteina G si lega con l’adenilil ciclasi
3- L’adenilil ciclasi attiva l’enzima che converti l’ATP in AMPciclico
4- Il suo principale bersaglio è una chinasi cAMP-dipendente, Proteina Chinasi A
5- Essa fosforila una serie di proteine cellulari fino alla risposta (es Adrenalina> Glucosio1fosfato)
Successivamente, interviene una fosfodiesterasi che degrada il cAMP
Inositolo trifosfato (IP3)
Deriva dal PIP2 che viene scisso in due molecole dal Fosfolipasi C
Inositolo trifosfato = apre canali ionici per il calcio, che poi si legano alla calmodulina
DAG = resta nella membrana ed attiva Proteina Chinasi C
Rilascio ioni calcio
La concentrazione del calcio è mantenuta bassa da Calcio ATPasi
Rilascio del calcio indotto dal calcio
Grazie alla calmodulina
Braccio a due estremità capaci di legare ciascuna due ioni Calcio
Gli ioni legati lo modificano: Complesso Calcio-Calmodulina attivo
Se è presente un sito di legame per la calmodulina, il complesso vi si lega come abbraccio
Rilascia il calcio quando la concentrazione del calcio scende ai livelli di riposo
Il rilascio del calcio è necessario:
- stimola la fusione dei granuli corticali
- modificano il rivestimento proteico della cellula uovo
Operando il blocco lento della polispmermia (impendendo ad
altri spermatozoi di fecondare l’uovo)
- è al centro dell’attivazione dell’uovo
La ripresa dei processi metabolici in sospeso
Ossidro Nitrico (NO)
Prodotto della conversione dell’arginina a NO e Citrullina ad opera dell’NO sintasi
Importante nel sistema cardiovascolare
Recettori associati a Protein Chinasi
I recettori ad attività chinasica fosforilano un residuo di tirosina o di serina
I recettori con attività tirosina chinasica (RTK) inducono crescita cellulare, proliferazione e differenziamento
Sono formati da una singola catena polipeptidica con un unico segmento transmembrana
La porzione extracellulare contiene il dominio di legame per il ligando
L’attività della proteina chinasica può essere integrante della proteina recettoriale
recettore e tirosin-chinasi possono essere proteine differenti
La tirosin-chinasi è detta “non recettoriale”
La proteina Ras
Importante nella crescita cellulare
Costituita da una singola subunità
Può essere legata sia a GDP sia al GTP (che la attiva)
Per acquisire GTP deve appoggiarsi ad un fattore di scambio, Sos
Il Sos deve essere legato al recettore in modo indiretto, attraverso un’altra proteina
Attivata, produce una cascata di eventi detta “Via del Ras”
Le GTPasi (o GAP) possono notevolmente velocizzare la Via del Ras
I messaggeri
Possono essere divisi in diverse categorie
- Fattori di crescita
Proteine capaci di stimolare la proliferazione e il differenziamento cellulare
Fattori di crescita dei fibroblasti (FGF) e Recettori per i FGF (FGFR)
Hanno un ruolo importante nello sviluppo delle cellule che derivano dal foglietto embrionale mesoderma
Recettori che fosforilano residui di serina
Fattori di crescita trasformante β
Regolano un ampio spettro di funzioni dall’embrione all’adulto fino alla morte cellulare programmata
Si legano a due tipi di recettori: tipo I e tipo II
Il recettore tipo II media la fosforilazione del tipo I che attiva la cascata di eventi
- Sistemi ormonali (endocrini e paracrini)
Hanno un’emivita limitata a qualche decina di minuti o a poche ore
Classificazione per tipi di recettori: Classificazione per proprietà chimiche:
- Recettori intracellulari (natura idrofoba, steroidi) - Steroidei (testosterone)
- Recettori associati a proteine G (ormoni adrenergici) - Peptidici (antidiuretico)
- Recettori con attività tirosina chinasica (insulina) - Proteine (insulina)
Si occupano di diverse funzioni: - Crescita e sviluppo
Androgeni, estrogeni o somatotropina
- Velocità processi corporei
Insulina, antidiuretico o ossitocina
- Concentrazioni di sostanze
Glucocorticoidi o paratormone (calcio)
- Risposte allo stess
Adrenalina, noradranalina
Spesso si tratta di ormoni del sistema paracrino, che agiscono anche in risposta
a danni tissutali
Apoptosi
Smantellamento del contenuto intracellulare
Caspasi vengono attivate (dopo che le procaspasi vengono tagliate ad opera di altre caspasi) ed avviano eventi proteolitici
La cellula può attivare le caspasi in tre modi
- In maniera diretta
Una popolazione di linfociti killer possono indurre cellule infette da virus alla morte cellulare
L’attivazione è innescata da segnali di morte cellulare
Fattore di necrosi tumorale
Proteina CD95/Fas
- In maniera indiretta
Quando il bilancio fattori di sopravvivenza / segnali di morte è sbilanciato
Le proteine pro-apoptotiche hanno la meglio
I mitocondri rilasciano nel citosol i Citocromo C
Il Citocromo C stimola il rilascio del calcio, dove si lega ai recettori dell’IP3
Attiva una procaspasi iniziatrice
- A causa di un danno
Se il DNA viene danneggiato in modo non riparabile, la stessa proteina p53 emette segnali di morte
Apoptosi ≠ Necrosi
La necrosi è il rigonfiamento e rottura delle cellule a causa di un danno chimico-fisico

SISTEMI DEL CITOSCHELETRO


Microtubuli Microfilamenti Filamenti intermedi
Struttura Tubo cavo di 13 protofilamenti Due catena di actina F intrecciate Otto profilamenti sovrapposti
Diametro Esterno: 25nm, Interno: 15nm 7nm 8-12nm
Monomeri Tubulina ά e Tubulina β Actina G Proteine diverse (citocheratine)
Funzioni Assonemali: motilità Contrazione muscolare Supporto strutturale
Citoplasmatici: organizzazione, Movimento ameboide Mantenimento della forma
strutturazione, flusso interno Correnti citoplasmatiche Rafforzamento dell’assone

Microtubuli
Sono costituiti da tubulina
Proteina organizzata in tre domini (N-terminale lega GTP, C-terminale contribuisce a legare i microtubuli)
Vi è una polarità intrinseca, in quanto le due estremità sono chimicamente differenti
1- tubulina ά e tubulina β si associano in un eterodimero
“fase di ritardo”, poiché il processo è relativamente lento
2- molti eterodimeri si aggregano in oligomeri
3- più oligomeri si aggregano a formare protofilamenti
4- tredici (13) protofilamenti si aggregano a formare un foglietto, che si ripiega
5- l’allungamento del microtubulo procede per aggiunta di tubulina ad una o a entrambe le subunità
L’estremità in crescita rapida è positiva
L’estremità a crescita lenta è negativa
Se la concentrazione di tubulina libera è superiore alla concentrazione critica per la subunità positiva,
ma inferiore per la subunità negativa, la prima polimerizza mentre la seconda depolimerizza
Fenomeno noto come tread milling (simultanea crescita ed accorciamento)
Modello dell’instabilità dinamica
Presuppone che esistano due popolazioni di microtubuli, una che si allunga ed una che si accorcia
La concentrazione di tubulina legata al GTP è limitante quando è disponibile, viene aggiunta rapidamente
quando poca, la sua aggiunta diminuisce di velocità
Si raggiunge un livello soglia di tubulina-GTP a cui la velocità di idrolisi
ad una estremità è più rapida di quella di aggiunta di tubulina-GTP
quando assente, viene favorita la perdita delle subunità
La frequenza di collasso è inversamente proporzionale alla concentrazione di tubulina
Si originano nel MTOC
MTOC = Centro Organizzatore dei Microtubuli (in molte cellule è il centrosoma)
Sono in grado di nucleare ed ancorare i microtubuli, che si estendono dal MTOC alla periferia con l’estremità
negativa ancorata
La capacità di nucleare microtubuli può essere modificata (durante la mitosi)
La stabilità è regolata
- Il cinetocore di ogni cromosoma cattura il terminale positivo dei microtubuli
I microtubuli che non lo incontrano si disorganizzano per instabilità dinamica
- Sono ancorati alla corteccia cellulare (struttura a base di actina)
In corrispondenza di cinetocore e corteccia cellulare vi sono “proteine di attracco delle estremità positive”
Riducono, in modo diretto e/o indiretto, la possibilità di perdere per collasso il microtubulo
Ne esistono di due tipi:
Microtubuli assonemali
Altamente organizzati e stabili che si trovano in ciglia o flagelli
Microtubuli citoplasmatici
Organizzati in modo più dinamico, responsabili di disposizione di organelli e movimento di vescicole
MAP – proteine associate ai microtubuli
Sono in grado di modularne la struttura, l’assemblaggio e la funzione
Formano circa il 15% della massa dei microtubuli
Le MAP cerebrali sono di due classi:
- Proteine MAP motrici
Includono chinesina e dineina
Usano l’ATP per il trasporto di vescicole o per creare forze di scorrimento tra i microtubuli
- Proteine MAP non motrici
Controllano l’oganizzazione dei microtubuli nel citoplasma

Microfilamenti
Sono costituiti da actina
Sintetizzata come una singola catena polipeptidica
Inizialmente ha struttura ad U con sito di legame per ATP
Può esistere in forma globulare (Actina G) o in forma filamentosa (Actina F)
Actina G ed F si legano ad un gran numero di proteine, che ne regolano e modificano le funzioni
Ne esistono tre tipi: - ά actine (muscolo specifiche)
- β actine (non muscolo specifiche, presenti nella porzione apicale dell’epitelio)
- γ actine (non muscolo specifiche, presenti nella zona basale dell’epitelio)
I filamenti di actina F sono composti da due catene parallele lineari di actina G avvolte ad elica
All’interno di un microfilamento, tutti i monomeri sono orientati nella stessa direzione (polarità intrinseca)
Estremità sfrangiata = estremità positiva
Estremità appuntita = estremità negativa
La polarità regola in modo indipendente l’assemblaggio
Monomeri aggiunti (e rimossi) più rapidamente all’estremità positiva
L’ATP legato all’actina G polimerizzata si idrolizza in ADP
Le estremità di un filamento in crescita sono formate da actina F-ATP
Il corpo del microfilamento è costituito da actina F-ADP
L’idrolisi, tuttavia, non è necessaria per l’allungamento
Le proteine ad essa correlate sono dette Arp
Possono creare strutture (la cui forma probabilmente dipende dalla natura del movimento)
Lamellipodi
Contengono filamenti di actina ramificati a formare una rete dentritica
Il complesso Arp2/3 contribuisce alla formazione di ramificazioni mediante la “gemmazione”
(nucleazione) di rami laterali su filamenti preesistenti
L’angolo è di 70°
Proteine note come formine possono assemblare alcune altre strutture di actina F
Si trovano, per esempio, nell’anello contrattile durante la divisione cellulare
Cdc42 è un’altra proteina che induce la formazione di lamellipodi
Filopodi
La formazione è data dalla proteina G Rac, che ne causa l’estensione
Fibre da stress
La formazione è mediata da acido lisofosfatidico (LPA) e dalla proteina G Rho
Sono fasci contrattili di filamenti di actina e di miosina II
Corteccia cellulare
Rete tridimensionale di microfilamenti e proteine associate localizzate immediatamente sotto la membrana
Sostiene la membrana plasmatica e conferisce rigidità
Facilita i cambiamenti di forma ed il movimento cellulare
I microfilamenti sono legati in una rete stabile dalle proprietà di gel da proteine che legano l’actina
Filamina = Formano ponti tra due microfilamenti che si intersecano, formando reti 3D
Gelsolina = incappuccia estremità positive dei microfilamenti e impedisce ulteriori polimerizzazioni
Microvilli
Lunghi 1-2 micrometri e dal diametro di 0,1 micrometri, aumentano superficie tissutale
La loro struttura è costituita da un fascio compatto di microfilamenti
Estremità positive rivolte verso la punta ed ancorate da placca elettrondensa
Microfilamenti legati all’esterno da calmodulina e tra loro da fibrina
Alla base, microfilamenti si estendono con miosina e spectrina nella trama terminale
Solco di clivaggio
Struttura che si forma durante la citocinesi
L’ancoraggio dei microfilamenti alla membrana plasmatica è indiretto e mediato da proteine FERM
Filamenti intermedi
Costituiti da una varietà di proteine, che li differenziano in 6 classi
Classe I-II = Citocheratine (si trovano in cellule epiteliali)
Classe IV = Proteine dei neurofilamenti (si trovano nei nervi centrali e periferici)
Per quanto diverse, hanno caratteristiche in comune
- Sono fibrose
- Hanno un dominio centrale a bastoncello
Non sono polarizzati
Dunque sono adirezionali
Sono le strutture più stabili e meno solubili del citoscheletro
La struttura
1- due polipeptidi si avvolgono tra loro con struttura coiled coil
2- due dimeri si associano lateralmente e formano un tetramero = protofilamento
3- i protofilamenti si sovrappongono lateralmente e longitudinalmente costituendo una struttura filamentosa
4- otto (8) protofilamenti si connettono coda-coda e formano un filamento intermedio
MOVIMENTO/MOTILITÀ CELLULARE

Basato su microtubuli
Il loro lavoro meccanico dipende da proteine motrici associate ai microtubuli
Esse si attaccano alle vescicole e “camminano” sul microtubulo, sfruttandone la direzionalità ed usando ATP
Chinesine
Responsabili del trasporto assonale anterogrado
Costituite da: - Due teste globulari che legano i microtubuli ed idrolizzano ATP
- Regione avvolta ad elica
- Catena leggere che lega gli organelli
Movimento “Mano a Mano”
Camminano sul microtubulo usando le teste come piedi
Compiono passi di 8nm sulla subunità di β-tubulina
Una testa si stacca e si sposta in avanti, legandosi successivamente
La seconda testa, a quel punto, si stacca e supera la prima di 8nm
E’ accoppiato dall’idrolisi di ATP in siti specifici delle teste
L’efficienza è di circa il 70%
Sono dotate di processività
Possono percorrere grandi distanze senza ricorrere a collaborazioni o staccarsi
Proteine KIF
Sono proteine membre della famiglia delle chinesine
Posseggono simili domini, ma in zone differenti
Alcune sono implicate nel trasporto assonale retrogrado
Altre hanno un ruolo focale nelle fasi iniziali di mitosi e meiosi
Dineine citoplasmatiche
Responsabili del trasporto assonale retrogrado
Costituite da: - Due catene pesanti che interagiscono con i microtubuli
- Tre catene intermedie
- Quattro catene leggere
Movimento impossibile senza un complesso proteico
Il complesso dinactina contribuisce a legare la dineina citoplasmatica al cargo
Localizzazione
Come le chinesine, svolgono il ruolo di trasportatori principali delle vescicole nel complesso RE-Golgi
Nello specifico, le dineine citoplasmatiche si occupano della tratta RE>Golgi>Membrane
Dineine assonemali
Responsabili della motilità cellulare
I microtubuli costituiscono le principali strutture di cigli e flagelli

Ciglia = movimento nel mezzo o del mezzo Flagelli = movimento nel mezzo
= presenti in grandi quantità = presente massimo una coppia
= caratteristico battito a remo (colpo di potenza) = movimento a gomito (simmetrico e ondulatorio)
Accomunate dall’assonema
Struttura cilindrica di circa 0,25 micrometri di diametro costituita da microtubuli
Connesso ad un corpo basale
Tra corpo basale ed assonema vi è la zona di transizione
E’ costituito da nove triplette di tre microtubuli
L’assonema ha struttura con disposizione “9+2”: 9 coppie periferiche di tubuli
2 coppie centrali di microtubuli
Ciascuna coppia periferica presenta: un microtubulo completo (A), a 13 protofilamenti
un microtubulo incompleto (B), a 10-11 protofilamenti
La nexina li collega tra loro
Legami radiali li collegano alla coppia centrale
Sono presenti bracci laterali di dineina asonnemale intorno alle coppie periferiche
Questi bracci sono responsabili dello scorrimento dei microtubuli uno sull’altro e della flessione
Modello dello scorrimento dei microtubuli
1- l’attività ATPasica dei bracci di dineina idrolizza ATP e fornisce energia necessaria
2- le coppie periferiche iniziano a scorrere l’una sull’altra
lo stelo del braccio di dineina si attacca/stacca dal tubolo B ciclicamente
i bracci di dineina di una coppia spostano la coppia adiacente e sfasano le due strutture
3- i legami radiali tra coppie periferiche e coppia centrale conferiscono forza di trattenimento
conversione scorrimento>flessione
Basato su actina (microfilamenti)
Classe di meccanoenzimi con attività motrice dipendente da ATP capaci di esercitare trazione sui filamenti di actina
Miosine
Ne esistono 18 classi, ma presentano caratteristiche comuni
Costituite da: - Una testa globulare (o più), che lega actina e idrolizza ATP
- Catene leggere legate alla testa, coinvolto nell’attività ATPasica
- Una coda (o più, avvolte ad elica)
Miosine II
Presenti nel tessuto muscolare striato, cardiaco e liscio
Costituite da: - Quattro catene leggere
- Due catene pesanti
Caratterizzate dalla capacità di assemblarsi in lunghi filamenti
Scorrimento di actina sulle molecole di miosina che porta alla contrazione cellulare
Non sono capaci di muoversi autonomamente lungo un filamento di actina
Operano come aggregati (anche di miliardi di unità)
Hanno una processività nulla
Movimento Muscolare (striato)
Il tessuto muscolare consiste di fasci di fibre
Le fibre sono singolarmente cellule multinucleate allungate
Ogni cellula contiene diversi miofibrille
Ogni miofibrilla è un insieme di fasci di filamenti allineati (effetto striato)
L’unità contrattile lungo ogni miofibrilla è il sarcomero
Sarcomero Filamenti spessi
Hanno un diametro di 14nm
Consistono di miosina disposta in modo sfasato
Le teste globulari sono orientate all’esterno in modo regolare
Filamenti sottili
Hanno un diametro di 7nm
Contengono actina, che è il costituente più importante
Presentano anche tropomiosina e troponina
La tropomiosina lega i filamenti spessi
La troponina è un complesso: TnT (tropomiosina)
TnC (calcio)
TnI (inibizione)
Bande A strie scure
(zona H, regione chiara tra bande A e I)
(linea M, in mezzo a zona H, contiene miomesina, che lega le miosine)
I strie chiare
(linea Z, in mezzo bande B)
Il tratto di miofibrilla tra due linee Z costituisce un sarcomero

Modello dello scorrimento dei filamenti


La contrazione muscolare è dovuta allo scorrimento dei filamenti sottili su quelli spessi, senza accorciamenti
La contrazione coinvolge lo scorrimento dei filamenti sottili negli spazi tra i due spessi (accorciamento banda I)
La quantità di forza generata dipende dal numero di teste di miosina del filamento spesso che perdono il
contatto con il filamento sottile
1- si formano ponti trasversi e si rilascia Pi
Formati da legami tra actina F dei filamenti sottili e teste di miosina dei filamenti spessi
La contrazione è il risultato netto di cicli di formazione e rottura
Provocano lo spostamento di un segmento di filamento sottile di una fibrilla
2- colpo di potenza o di forza e rilascio di ADP
Passaggio della miosina al legame più stabile, con cambiamento conformazionale
Il cambiamento conformazionale rilascia ADP
Fa sì che il filamento spesso trascini quello sottile
3- la configurazione della testa di miosina è a bassa energia
4- distacco del ponte traverso e legame dell’ATP
l’ATP si lega alla testa della mosina, provoca un cambiamento conformazionale
Il cambiamento riduce la sua associazione con l’actina
Senza ATP la dissociazione non può avvenire (rigor mortis)
5- idrolisi dell’ATP e flessione della testa di miosina
L’energia dell’idrolisi dell’ATP riporta la testa di miosina alla configurazione ad alta energia
Il ruolo del Calcio
I siti di legame della miosina sul filamento di actina sono normalmente mascherati dalla tropomiosina
Questa deve essere rimossa per permettere l’attacco della miosina all’actina e l’inizio del ciclo
dei ponti trasversi
La troponina C (TnC) si lega agli ioni calcio e va incontro a un cambiamento conformazionale
Questo cambiamento viene trasmesso alla tropomiosina, che si sposta
Il sito di legame libero è disponibile per l’interazione con miosina
Si formano i ponti transversi
Trasmissione di un impulso
Il sito in cui una cellula nervosa si innerva è detto giunzione neuromuscolare
In essa, l’assone si dirama nei terminali dell’assone, che contengono acetilcolina
Le regioni a contatto con i terminali sono dette placche motrice ed hanno recettori per acetilcolina
I recettori sono canali ionici a controllo di ligando
La depolarizzazione di membrana nella placca motrice viene propagata grazie a un sistema di tuboli transversi -T
Trasportano i potenziali all’interno della cellula muscolare
Prendono contatto con il reticolo sarcoplasmatico (RS)
Esso corre lungo le miofibrille, in modo da poter rilasciare ioni calcio direttamente
dentro di esse, causando la contrazione ed il rapido rilassamento una volta rimossi
Il reticolo sarcoplasmatico può essere suddiviso in due componenti:
- Elemento mediale
- Cisterne terminali
Contengono un’elevata concentrazione di pompe calcio ATP dipendenti
Pompano continuamente il calcio nel lume del RS
Essenziale per rilassamento/contrazione muscolare
Il calcio viene rilasciato nel citoplasma per contrarre il muscolo
Movimento Muscolare (liscio)
Le cellule muscolari lisce sono lunghe e sottili e non contengono linee Z
Hanno corpi densi che contengono i filamenti intermedi ed attaccano i filamenti di actina
Grazie ad essi si formano ponti trasversi tra filamenti sottili e spessi, in modo meno regolare
Contrazione
1- impulso nervoso/segnale ormonale scatena l’ingresso di ioni calcio all’interno della cellula
2- se a concentrazione sufficientemente alta, si legano alla calmodulina
si forma il complesso attivo calcio-calmodulina
3- il complesso si lega alla chinasi della catena leggera della miosina (MLCK)
la MLCK viene così attivata
4- l’MLCK attivata fosforila catene leggere di miosina (ripiegata e distesa)
5- la miosina attivata e distesa si lega all’actina e genera il ciclo dei legami trasversi
6- quando la concentrazione degli ioni calcio scende, l’MLCK si inattiva
la fosfatasi della catena leggera della miosina rimuove il gruppo fosfato dalla miosina
la miosina defosforilata non può più legarsi all’actina e si ha rilassamento
Motilità non muscolare
Molte cellule non muscolari (fibroblasti o coni di crescita dei neuroni) sono capaci di strisciare su un substrato
Movimento ameboide
1- estensione di una protrusione in un’estremità guida
es: lamellipodio o filopodio
Flusso retrogrado = massiccio movimento di microfilamenti verso la zona opposta
- Assemblaggio dell’actina sulla punta della protrusione
- Spostamento all’indietro dei filamenti di actina
2- adesione della protrusione con il substrato
Nel margine anteriore si formano siti di adesione (e quelli del bordo posteriore sono rotti)
L’adesione è data da integrine, che legano le proteine della matrice extracellulare,
mentre sono connesse internamente ai filamenti di actina
3- generazione di una tensione che trascina la cellula avanti
La forza con cui la cellula è attaccata al substrato influenza la velocità dello strisciamento
4- rilascio dell’adesione e ritrazione dell’estremità posteriore
Passaggio sol-gel
Le cellule specializzate nel movimento ameboide sono caratterizzate da
- Pseudopodi
- Citoplasma bifasico: esternamente spesso e gelatinoso (ectoplasma)
internamente sottile e fluido (endoplasma)
STRUTTURE EXTRACELLULARI
Matrice extracellulare
Resistenza meccanica
Il collagene forma fibre ad elevata resistenza alla trazione ed è il principale responsabile della resistenza meccanica
Vengono secreti da un gran numero di cellule diverse
Nel lume del RE, tre catene ά si assemblano forma una tripa elica detta “procollagene”
Viene convertito in collagene da procollafene peptidasi
I collageni sono le proteine più abbondanti nei vertebrati
Struttura: - tripla elica rigida
possibile grazie all’alto contenuto di glicina
- tre catene polipeptidiche avvolte tra loro
- composizione amminoacidica inusuale (amminoacidi rari)
I collageni si raggruppano in fibrille, che insieme costituiscono fibre di collagene
In base alla struttura, si distinguono diversi tipi ed altrettante funzioni
Fibrille lunghe = cute, ossa, tendini, muscolo
Foglietti = lamine basali
Fibrille di ancoraggio = epiteli
Elasticità e flessibilità
Le elastine sono le principali responsabili dell’elasticità cellulare
Sono ricche di amminoacidi glicini e prolina (non idrossilata)
Si legano tra loro con legami crociati covalenti esercitando sul reticolo di elastina tensione
Più legami crociati sono presenti, più la struttura assume rigidità
(matrice di proteoglicani)
Fibre di collagene e di elastina sono immerse in una rete gelatinosa costituita da proteoglicani
I proteoglicani sono glicoproteine a cui sono legati glicosamminoglicani (GAG)
I GAG sono molecole idrofile cariche negativamente
Attirano l’acqua ed i cationi, formando la matrice idrata gelatinosa
I proteoglicani possono: - Legare direttamente le fibre di collagene
Partecipando alla formazione del reticolo di fibre (collagene+elastina)
- Essere presenti come molecole singole
Lo ialuronato ha proprietà lubrificanti (regioni dove c’è molta frizione)
I proteoglicani hanno la funzione di trattenere le molecole d’acqua
Trattenendo acqua la resistenza alla compressione dei reticoli di proteoglicani aumenta molto
Movimento cellulare
Il movimento cellulare è guidato dalle fibronectine
Glicoproteine adesive che esistono in più forme: - solubile, nel sangue e nei fluidi corporei
- mista, quando associate alla superficie cellulare
- insolubile, nella matrice extracellulare
Vengono sintetizzate a partire da un unico RNA
La fibronectina lega recettori sulla superficie cellulare a componenti della MEC, fungendo da ponte

- Migrazione delle cellule


Le vie che le cellule in migrazione (es embrionali) seguono, contengono alte concentrazioni di fibronectine
- Coagulazione del sangue
La fibronectina solubile (fibronectina plasmatica) promuove la coagulazione sanguinea
Presenta diversi domini che riconoscono la fibrina
Ancoraggio alla lamina basale
Le laminine si trovano principalmente nella lamina basale
Struttura: - glicoproteine adesive molto grandi
- tre lunghe catene polipeptidiche che formano struttura a croce
- ponti disolfuro stabilizzano la croce
Sono glicoproteine adesive
Si localizzano sulla superficie della lamina basale a contatto con l’epitelio sovrastante
Collaborano all’ancoraggio delle cellule
La lamina basale è un sottile strato di materiale specializzato frapposto tra cellule epiteliali e tessuto connettivo
Serve come - struttura di supporto che mantiene l’organizzazione dei tessuti
- barriera di permeabilità
(recettori superficie di membrana)
Integrine => Fibronectine e laminine possono legarsi alla cellule poiché queste presentano specifici recettori, le integrine
Le integrine sono proteine transmembrana con il ruolo di integrare la MEC al citoscheletro
Struttura: - dimero di due grosse catene polipeptidiche transmembrana
- la subunità ά stabilisce la specificità del legame
Integrine e citoscheletro
Le integrine non legano MEC e citoscheletro in modo diretto
Adottano due differenti tipi di connessioni
- Adesioni focali
Presenti nelle cellule in migrazione non epiteliali (fibroblasti)
Contengono gruppi di integrine che interagiscono con microfilamenti di actina
- Emidesmosomi
Presente nelle cellule epiteliali (e nello specifico nella lamina basale)
Le integrine sono ancorate ai filamenti intermedi
Formano una densa placca, collega i gruppi di integrine al citoscheletro
Ricoprono un ruolo chiave anche nella regolazione del movimento
Integrine e segnalazione intracellulare
- Segnalazione invertita
I cambiamenti all’interno della cellula hanno effetti sull’esterno
es: segnali di crescita possono indurre un’aggregazione delle integrine
- Segnalazione normale
Agiscono come recettori che attivano autonomamente una via di segnalazione intracellulare
Integrine ed ancoraggio
La maggior parte delle cellule ha una crescita ancoraggio-dipendente
Deve, cioè, attaccarsi ad una MEC
Le cellule tumorali ed immortalizzate costituiscono un’eccezione
Chinasi di Adesione Focale (FAK) e Chinasi Associata alle Integrine (ILK)
Chinasi che vengono attivate in seguito all’adesione focale di una cellula con la sua MEC
Glicocalice
Rivestimento esterno con un elevato contenuto di carboidrati
- Protegge la superficie cellulare
- Permette fenomeni di riconoscimento/adesione
- Forma barriera di permeabilità
Consiste solitamente di due porzioni riconoscibili: - Glicocalice ancorato
Costituito da catene glucocidiche attaccate a
glicoproteine ed a glicolipidi
- Glicocalice disancorato
Può essere rimosso con facilità
Riconoscimento/Adesione tra cellule
Le molecole di adesione servono a legare le cellule tra loro
Due tipi di interazioni: - Interazione omofiliche
Le cellule interagiscono con le molecole identiche presenti sulla superficie della cellula a cui
devono aderire
- Interazioni eterofiliche
Un recettore di adesione su una cellula interagisce con una molecola diversa presente sulla
superficie della cellula a cui si attacca
Vi sono relativamente poche classi di molecole di adesione
Superfamiglia delle immunoglobuline (IgSF)
Così denominate poiché contengono domini simili a quelli delle subunità immunoglobulineche degli anticorpi
Le proteine CAM
Fanno parte della superfamiglia delle immunoglobuline
Stabiliscono interazioni omofiliche con CAM presenti su cellule adiacenti grazie ai domini
Nel sistema nervoso embrionale, le N-CAM si occupano della crescita/organizzazione
dei fasci di neuroni
Caderine
Sono glicoproteine adesive che mediano i processo di riconoscimento ed adesione tra le cellule
Richiedono calcio per il corretto funzionamento
Il calcio ne modifica la conformazione e permette loro di mediare l’adesione
Struttura: - caratterizzate da una serie di subunità ripetute simili al dominio extracellulare
- la quantità di ripetizioni e le estremità citosoliche le differenziano
Differenti caderine si trovano in differenti tessuti
Ricoprono ruoli importanti nello sviluppo embrionale
Nelle fasi precoci dello sviluppo, mediano l’adesione delle cellule derivanti dalle prime divisioni cellulari
Lectine
Proteine che legano i carboidrati
L’importanza dei carboidrati sulla superficie cellulare è esemplificata dai gruppi sanguigni
Essi sono determinati da una specifica catena laterale carboidratica presente su un glicolipide
di membrana negli eritrociti
La catena laterale carboidratica viene rilevata dagli anticorpi del sangue
Poiché le catene laterali sono diverse, si hanno differenti gruppi sanguigni
Promuovono l’adesione cellula-cellula legando specifiche sequenze saccaridiche
Selectine
Ogni tipo cellulare esprime una diversa selectina
Endotelio = selectina-E
Leucociti = selectina-L
Naturalmente, i leucociti rotolano lungo le pareti dei vasi sanguigni
In caso di infiammazione, si attaccano alla parete di un vaso in prossimità del sito di infiammazione
L’adesione iniziale è mediata dal legame delle selectine del leucocita con carboidrati sul vaso
Giunzioni
Gli organismi pluricellulari creano associazioni cellulari stabili (tessuti e organi), per cui è richiesta comunicazione
Giunzioni adesive
Legano tra loro le cellule dei tessuti, rendendole un’unità funzionale singola
Sono divise in quattro categorie:
(Adesioni focali)
> Adesione cellula-MEC
Associate a microfilamenti di actina
(Emidesmosomi)
> Adesione cellula-lamina basale
Associate ai filamenti intermedi
Giunzioni aderenti
> Adesione cellula-cellula
Giunzioni adesive contengono:
- Proteine di ancoraggio intracellulare
Permettono il legame della giunzione con il citoscheletro
- Caderine
Sporgono sulla superficie esterna della membrana plasmatica
Permettono il legame della giunzione con altre cellule
Formano una struttura detta “giunzione a cintura”
Un’ampia zona che si estende per l’intero perimetro delle cellule di uno strato tissutale
Sono connesse al citoscheletro di actina grazie alla proteina catenina β, a sua volta legata a catenina ά
Desmosomi
> Adesione cellula-cellula
Sono presenti nelle cellule di diversi tessuti
Sono aree piccole e simili a bottoni di adesione
Lo spazio tra le due membrane è detto “core del desmosoma”
Sono costituiti da filamenti intermedi
Desmina e cheratina soprattutto
Lo spazio tra le membrane è di 20-35nm
Giunzioni occludenti
Non lasciano spazio tra la membrana e le cellule adiacenti
Servono come sigilli per impedire il flusso di fluidi tra le cellule
In questo modo, il passaggio di molecole è necessariamente mediato e regolato da proteine di trasporto
Impediscono: - Passaggio di fluidi
- Movimento laterale di lipidi e proteine
Ma contribuiscono al mantenimento dello stato polarizzato
Struttura: Sono connesse lungo margini precisamente definiti
Ogni giunzione appare come una serie di filamenti intrecciati a formare una rete interconnessa
I principali componenti proteici sono: - Claudine
Diversi tipi di tessuti esprimono diverse claudine
- Occludine
Giunzioni comunicanti
Una giunzione comunicante è una regione dove le membrane sono allineate solo a 2-3nm di distanza
Le membrane sono legate da connessoni
Una singola giunzione comunicante può essere costituita da pochi o da migliaia di connessoni
Ogni connessone è formato dall’assemblaggio di sei subunità di connessina
Esistono diverse connessina a seconda del tessuto e (di conseguenza) della funzione
Struttura connessone: - diametro di 7nm
- cavità centrale = canale idrofilico di 3nm di diametro
Quando i connessone di due cellule adiacenti sono allineati, i cilindri si incontrano test-testa
Si creano così canali di comunicazione diretta tra le cellule
Nel cuore facilitano la propagazione della corrente elettrica che causa il battito
DNA
DNA-B
Doppia elica destrorsa
Scheletro zuccherofosfato all’esterno dell’elica
Sono antiparalleli
Uno dei filamenti mostra una direzione 5’ > 3’
L’altro filamento ha direzione opposta 3’ > 5’
Le coppie di basi complementari sono purine-pirimidine
Tenute insieme da legami H, stabilizzano nel modo massimo le eliche
Sono complementari
Composti da - dieci coppie di nucleotidi per giro
- avanzamento di 0,34nm ogni coppia di nucleotidi
- diametro di 2nm
Presenta un solco maggiore ed un solco minore
Gli altri DNA presentano forme leggermente differenti (DNA-A è una doppia elica sinistrorsa)
Superavvoglimento del DNA
Condizione la capacità del DNA di interagire con le altre molecole
- Superavvolgimento positivo
Favorisce un maggior compattamento della doppia elica
Riduce le possibilità di interazione
- Superavvolgimento negativo
Tende a srotolare la doppia elica
Aumenta l’accessibilità dei due filamenti
L’interconversione tra uno stato e l’altro è mediata da Topoisomerasi
- di tipo I
Inducono il rilassamento del DNA
tagliando un solo filamento della doppia elica
Non richiede energia
- di tipo II
Inducono il rilassamento del DNA
La DNA girasi anche superavvolgimento
tagliando entrambi i filamenti del DNA
e facendo passare un segmento nella doppia elica
Richiede energia (idrolisi dell’ATP)
Denaturazione e Rinaturazione
Denaturazione = Separazione dei due filamenti a causa di alte temperature
Temperatura di fusione del DNA, quando si ottiene il 50% dell’aumento dell’assorbanza
Gli acidi nucleici hanno la possibilità di rinaturarsi
Capacità alla base dell’ibridazione degli acidi nucleici (tecniche che ne permettono il riconoscimento)
GENOMA
Costituito dalla quantità di DNA che contiene una copia completa di tutte le informazioni genetiche
La dimensione è espressa come numero totale di coppie di basi nucleotidiche
La distribuzione varia di otto ordini di grandezza da specie e specie e non è realmente sinonimo di complessità dell’organismo
Enzimi di restrizione
Particolari enzimi che tagliano le molecole di DNA a libello di siti specifici
I siti specifici corrispondono ad una specifica sequenza e sono detti siti di restrizione
I frammenti che ne derivano sono detti frammenti di restrizione
Impiegati insieme all’elettroforesi su gel
Tecnica utilizzata per analizzare e separare acidi nucleici
Sequenze di DNA ripetuto
Circa il 99% del genoma umano è composto di sequenze non codificanti
Le sequenze di DNA ripetuto sono un tipo particolare di DNA non codificante
Rappresentano una frazione elevata del genoma (dal 35 al 50%)
- DNA ripetuto in tandem
Le coppie multiple sono organizzate l’una dietro all’altra in fila
L’unità di ripetizione è fortemente variabile (tre ordini di grandezza)
- DNA satellite
DNA ripetuto in tandem a sequenza semplice
L’unità di ripetizione è di circa una decina di basi
Potrebbero conferire particolari caratteristiche fisiche ad alcuni regioni del cromosoma
I telomeri sono costituiti da sequenze di DNA satellite
- DNA ripetuto intersperso
Le coppie multiple sono distribuite singolarmente all’interno del genoma
Costituiscono il 20-25% dell’intero genoma
Le unità di ripetizione sono solitamente piuttosto lunghe
Transposoni = una classe di segmenti di DNA possono proliferare e spostarsi nel genoma
- Trasposoni a DNA
Tramite l’enzima trasposasi attuano trasposizione conservativa
Si staccano dal filamento principale
Si inseriscono in un altro punto del filamento principale
- Retrotrasposoni
Utilizzano un processo di trascrizione inversa, attuano una trasposizione replicativa
Un filamento di RNA sintetizza numerose segmenti identici di DNA
Essi si inseriscono in punti diversi del filamento principale di DNA
IMPACCHETTAMENTO DEL DNA
Cromosomi batterici
Il cromosoma batterico è costituito da una molecola di DNA circolare con proteine associate
Si localizza in una zona detta nucleodie
Non è contenuto all’interno di una membrana
Si tratta di DNA superavvolto
Il superavvolgimento produce una serie di anse
Le estremità di ogni ansa sono ancorate a componenti strutturali del nucleodi
Ma il filamento può essere modificato senza coinvolgere le anse adiacenti
Plasmidi batterici
Sono molecole di DNA circolare relativamente piccole che contengono geni per la loro replicazione e per funzioni cellulari
Ne esistono di tre classi: - Fattori F = Coinvolti nel meccanismo di coniugazione (un processo di riproduzione)
- Fattori R = Forniscono resistenza ai farmaci
- Fattori Col = “Colinergici”, permetto la secrezioni di coline (composti di difesa)
Cellule eucariotiche
Maggiore complessità strutturale prodotta dall’associazione con un maggior numero ed una più grande varietà di proteine
Quando il DNA è associato con queste proteine, è convertito in fibre di cromatina
Le fibre di cromatina sono: - normalmente disperse nel nucleo
- durante la divisione cellulare condensate a formare cromosomi
Le proteine che le creano sono gli istoni
Gli istoni hanno un elevato numero di amminoacidi basici arginina e lisina (che li caricano positivamente)
Con essi interagiscono con il DNA (che è carico negativamente)
Gli istoni sono divisi in cinque classi distinte:
- H2A, H2B, H3, H4
Presenti in uguali proporzioni
- H1
Presenti esattamente la metà delle altre
Ogni classe ha concentrazioni precisamente distinte e rigidamente mantenute
Le fibre di cromatina formano una struttura “a collana di perle”
Ogni “perla” (istone) ed ogni “filamento” (DNA) ad esso associata è un nucleosoma
Ogni nucleosoma è costituito da un ottamero di istoni
- Dimero H2A-H2B
- Dimero H3-H4
- H1 associato direttamente al DNA
La fibre di cromatina possono essere spesse 10nm o 30nm
Le fibre di cromatina a 30nm - formano una struttura irregolare a zing-zag che interagisce con le proteine adiacenti
- costituiscono un ulteriore impacchettamento, ripiegandosi e formando domini ad ansa
- proteine non istoniche contribuiscono all’impalcatura (scaffold) del cromosoma
Eterocromatina
Segmenti di cromatina così altamente compattati da essere visibili al microscopio ottico come aree scure
Contiene DNA trascrizionalmente inattivo
Eucromatina
Segmenti di cromatina meno condensata e più diffusa
Contiene DNA trascrizionalmente attivo
Al momento della divisione, tutta la cromatina si condensa generando i cromosomi (costituiti da due unità, cromatidi)
DNA mitocondriale
Molecole di DNA circolari e prive di istoni (simili al genoma procariotico, teoria endosimbiontica)
Sono organelli semi-autonomi
Capaci di codificare RNA ribosomiali, RNA di trasferimento e subunità polipeptidiche del sistema di trasporto el
NUCLEO
Luogo della cellula eucariotica dove sono localizzati e replicati i cromosomi
deposito della maggior parte delle informazioni genetiche della cellula
dove il DNA in esso contenuti viene trascritto
centro di controllo per l’espressione delle informazioni genetiche
(eucariotica -> “con vero nucleo”/ “realmente nucleata”)
È circondato da un involucro nucleare
E’ divisa in due membrane distinte:
Membrana nucleare interna
Spessa circa 8nm, appoggiata su una rete di fibre detta lamina nucleare
Spazio perinucleare
Dimensione variabile tra 20-40nm, considerabile una propaggine del lume del RE
Membrana nucleare esterna
Spessa circa 8nm, in comunicazione con il RE
Pori nucleari
Aperture specializzate che permetto la comunicazione tra citosol e nucleoplasma
Costituite da un piccoli canali cilindrici che si estendono attraverso le due membrane
Le due membrane sono fuse insieme a livello di ogni poro
Formano una complessa struttura proteica detta Complesso del poro nucleare (NPC)
Il complesso del poro è strutturato come due ruote ad otto subunità tenute insieme da otto raggi
Al centro della ruota, un granulo centrale detto trasportatore
Si pensa sia il responsabile del movimento delle macromolecole attraverso l’involucro
Alcune fibre creano una struttura a cesto estendendosi dalle ruote verso il citosol
Diffusione semplice di piccole molecole
Particelle dalle dimensioni inferiori ai 10nm, possono naturalmente attraversare le due membrane
Il complesso del poro contiene piccoli canali acquosi di diffusione a 9nm di diametro
La diffusione semplice è ristretta anche a molecole leggere (peso molecolare<20'000)
Trasporto attivo di grosse proteine
Solitamente le molecole che attraversano l’involucro nucleare sono piuttosto grandi (pesi mol>100’000)
Sono necessari trasporti attivi selettivi
Possono essere trasportate proteine con segnali di localizzazione nucleare (NLS)
I segnali sono sequenze amminoacidiche che permettono alla proteina di essere riconosciuta
1- il segnale viene riconosciuto da una proteine recettoriale, importina
2- l’importina si lega al segnale NLS e media il movimento proteina-NLS verso il poro
3- il trasportatore porta il complesso importina-proteina-NLS all’interno del nucleo
4- nel nucleo, l’importina si lega ad una proteina che lega GTP (si libera di proteina-NLS)
5- il complesso proteina-GTP-importina viene ritrasportato nel citoplasma
6- l’importina viene rilasciata idrolizzando GTP
Matrice nucleare
Mantiene la forma del nucleo e fornisce uno scheletro che organizza le fibre di cromatina
Correlata ad essa, vi è un’altra struttura fibrosa, la lamina nucleare
Sottile e densa rete di fibre che tappezza la superficie interna della membrana nucleare interna
Serve da sostegno per l’involucro nucleare
Strutturalmente: - è spessa dai 10 ai 40nm
- costituita da filamenti intermedi di proteine lamine
Potrebbero fornire punti di attacco per la cromatina
Fibre di cromatina
Le fibre di cromatina corrispondono ai singoli cromosomi ed occupano precisi “territori cromosomici” all’interno del nucleo
La posizione dei “territori cromosomici” non è necessariamente fissa (da cellula a cellula, invecchiamento, traumi…)
L’involucro nucleare è di aiuto nell’organizzazione della cromatina
Lega certi segmenti cromatinici a siti specifici sulla superficie interna dell’involucro
Eterocromatina costitutiva
Mantiene in ogni momento del ciclo cellulare la sua struttura altamente condensata
Costituita da DNA satellite, presente nel centromero e nei telomeri
Eterocromatina facoltativa
Varia in relazione alle particolari attività che la cellula sta effettuando
Potrebbe corrispondere a “territori cromosomici” resi inattivi
Nucleolo
Componente strutturale (spesso ve ne sono diversi) adibito a fabbrica di ribosomi, la cui dimensione è correlata all’attività
Contengono la regione dell’organizzatore nucleolare (NOR)
Blocco di DNA che contiene copie multiple organizzate in tandem di geni per l’rRNA
Potrebbe avere anche un ruolo nella modificazione di piccoli RNA e nel controllo della divisione cellulare
(GENERALE) CICLO CELLULARE
Fase M = La cellula si divide
1- Mitosi
2- Citocinesi
Interfase = Periodo tra una divisione e l’altra (tempo di generazione)
3- Fase S (replicazione del DNA)
4- Fase G1 (dura solitamente una decina di ore)
5a- Fase G0 (la cellula non si replica più)
5b- Fase G2 (dura una mezza dozzina di ore)
REPLICAZIONE
La replicazione del DNA è semiconservativa
Uno dei filamenti di ciascuna molecola di DNA neoformata è un filamento parentale, l’altro è sintetizzato ex novo
Ciascun filamento della doppia elica fa da stampo per la sintesi di relativi filamenti complementari
Origine della replicazione
Sequenza di DNA particolare, presente nel punto specifico in cui ha inizio la replicazione
Quando un gruppo di proteine iniziatrici si lega a questa sequenza ha inizio la replicazione
Usando ATP, le proteine iniziatrici svolgono la doppia elica e consentono modifiche da parte del resto della replicazione
Procede in modo bidirezionale a partire dall’origine
Si formano due forcelle di replicazione che si muovono allontanandosi dall’origine in direzioni opposte
Nelle molecole di DNA lineare ci sono molteplici siti di inizio
Le altrettante unità di replicazione che si formano sono dette repliconi
Al centro di ogni replicone c’è un’origine di replicazione da cui inizia la sintesi del DNA
Questo è un processo a più fasi:
1- un complesso proteico multisubunità detto Complesso di Riconoscimento dell’Origine (ORC),
si lega all’origine di replicazione
2- proteine dette caricatori dell’elicasi mediano il legame del MCM all’ORC
3- il complesso MCM contiene enzimi DNA elicasi fondamentali allo svolgimento dell’elica
4- il gruppo completo di proteine che legano il DNA è detto complesso di pre-inizio
il DNA si dice “autorizzato”
Tuttavia, la replicazione non inizia finché non si aggiungono altre proteine
A l’inizio della replicazione, il DNA che si allontana da una forcella di replicazione in versi opposti genera una bolla di replicazione
La bolla di replicazione di un replicone cresce finché non incontra quella di un replicone adiacente
A quel punto, il DNA sintetizzato in repliconi multipli viene unito
Alcuni repliconi tendono a replicarsi prima di altri
La velocità ed il numero dei repliconi che si replicano dipende anche dalla vita dell’individuo (embrione>>)
DNA polimerasi
Enzima in grado di copiare il DNA a partire da una piccola quantità di DNA che fa da stampo
In presenza dello stampo, l’enzima catalizza l’allungamento dei filamenti di DNA, usando come substrati i
desossinucleosidi trifosfati derivati dalle quattro basi (dATP, dTTP, dGTP,dCTP)
Quando uno di questi substrati è incorporato nel filamento in formazione, i suoi due gruppi fosfato terminali
vengono rilasciati e l’energia derivante spinge la reazione verso la polimerizzazione
I nucleotidi che vengono incorporati sono legati in modo covalente all’estremità 3’-OH
Ogni nuovo nuleotide è aggiunto tra il gruppo fosfato del suo Carbonio-5’ e il gruppo idrossilico sul Carbonio-3’
Per questo la catena cresce in direzione 5’->3’
Le cellule eucariotiche possiedono diversi tipi di DNA polimerasi
Elencate dalla alfa (principale) alla gamma
I filamenti discontinui
La DNA polimerasi può catalizzare l’aggiunta di nucleotidi solo all’estremità 3’ di un filamento di DNA già esistente
La sintesi del DNA ad ogni forcella è - continua nella direzione del movimento della forcella
Filamento anticipato
- discontinua nella direzione opposta sull’altro filamento
Filamento ritardato (composto da Frammenti di Okazaki)
Perché la DNA polimerasi va solo in una direzione?
Si pensa sia un modo per correggere errori
L’attività esonucleasica opera solo 3’->5’, se ci fosse un enzima capace di sintetizzare il DNA in direzione 3’->5’ la
correzione di bozze non potrebbe funzionare: il filamento avrebbe all’estremità 5’ un nucleoside trifosfato
Rimosso quello, non ci sarebbe più energia per proseguire
Replicazione
Premesse fondamentali: 1- i Frammenti di Okazaki hanno all’estremità 5’ corti tratti di RNA
2- la DNA polimerasi può catalizzare l’aggiunta di nucleotidi all’estremità 3’ di filamenti sia di DNA sia di RNA
3- le cellule contengono l’enzima primasi che sintetizza RNA anche dal nulla (legando due nucleotidi)
La sintesi del DNA inizia con la formazione di primer di RNA sintetizzati dalla primasi (che usa come stampo una molecola di DNA)

1- la proteina iniziatrice si lega al DNA nel punto di origine della replicazione


i filamenti devono svolgersi per poter essere esposti agli enzimi che li copieranno
2- la DNA elicasi si attacca al DNA ed inizia a svolgerlo
lo svolgimento è dato dalla rottura dei legami idrogeno ed l’energia viene dall’idrolisi dell’ATP
almeno due elicasi sono implicate: - una si lega al filamento ritardato e si muove da 5’->3’
- l’altra si lega al filamento anticipato e si muove 3’->5
quest’ultima è la più importante per la replicazione
3- una topisomerasi (DNA girasi) facilita la separazione dei filamenti
opera superavvolgimenti negativi
4- i filamenti sono tenuti separati da “proteine che si legano ai filamenti singoli” (SSBP)
si legano alla regione svolta del DNA e permettono ai filamenti separati di fare da stampo
5- si è formata la forcella di replicazione
il DNA del filamento ritardato si ripiega ad ansa
permette alla DNA polimerasi di entrambi i filamenti di procedere nella stessa direzione fisica
(nonostante i filamenti siano orientati con polarità opposte)
6- La primasi si lega sullo stampo del filamento anticipato e sintetizza un corto innesco di RNA complementare
7- la DNA polimerasi ά usa questo innesco per iniziare a sintetizzare il DNA ed aggiunge desossiribonucleolidi alla sua estremità 3’
per il filamento anticipato è sufficiente un solo innesco, poiché la sintesi procede in modo continuo in senso 5’->3’
alla DNA polimerasi è legata una proteina sliding clamp
circonda la doppia elica e permette alla DNA polimerasi di scorrere in modo saldo
8- viene sintetizzato un innesco di RNA per il filamento ritardato
la sintesi è discontinua e richiede una serie di inneschi
procede a partire dall’estremità 3’ di ogni innesco, formando un frammento che si allunga fino al successivo
l’innesco di RNA viene poi eliminato dall’attività esonucleasi della DNA polimerasi
è sostituiti con DNA dall’attività polimerasica della stessa DNA polimerasi
9- i frammenti di Okazaki sono uniti da una DNA ligasi

Le proteine coinvolte nella replicazione del DNA sono tutte associate in un unico grosso complesso, il replisoma
Telomeri
La DNA polimerasi può aggiungere nucleotidi solo all’estremità 3’OH di un filamento
Quando un filamento ritardato si allunga, raggiunge l’estremità della molecola di DNA
L’attività esonucleasica rimuovere l’ultimo innesco di RNA, ma l’intervallo non può essere colmato
Le molecole di DNA lineare genererebbero molecole figlie sempre più corte
I telomeri sono sequenze altamente ripetute di DNA poste all’estremità di ciascun cromosoma lineare
Nell’uomo, per esempio, la sequenza è TTAGGG, ed è detta “sequenza telomerica”
La telomerasi è un enzima insolito: - è una proteina
- contiene un RNA
quest’ultimo serve da stampo per la sequenza di DNA ripetuta di DNA alle estremità
Dopo essere stati allungati, i telomeri vengono protetti da “proteine cappuccio dei telomeri”
spesso l’estremità 3’ può ripiegarsi all’indietro ed appaiarsi ad un filamento opposto
creando, così, un’ansa chiusa che protegge ulteriormente i telomeri
I telomeri divenuti troppo corti
Espongono un DNA a doppia elica, che attiva un sistema di segnalazione che porta all’apoptosi
DNA autorizzato
Il DNA eucariotico viene autorizzato, per evitare che la replicazione possa avvenire più di una volta in una divisione cellulare
Si basa sul legame dell’ORC, dell’MCM e delle “proteine di caricamento dell’elicasi”
1- la chinasi ciclina-dipendente (Cdk)
prodotta verso la fine della fase G1
- attiva la sintesi del DNA alle origini autorizzate
- assicura che quelle stesse origini non possano essere autorizzate nuovamente
catalizza la fosforilazione delle tre classi di proteine richieste per l’autorizzazione, bloccandone l’attività
2- la geminina, secondo inibitore
prodotta durante la fase S
impedisce il legame delle proteine MCM al DNA
MECCANISMI DI RIPARAZIONE
Esistono due tipi di danni
Spontanei
Depurinazione
Perdita di una base purinica per idrolisi spontanea del legame glicosilico che la lega al desossiribosio
Deaminazione
Distacco di un gruppo amminico di una base
La citosina è la più soggetta a questo tipo di danno e viene trasformata in uracile
Agenti Mutageni
Mutageni chimici
Alterano la struttura del DNA in vari modi: - analoghi alle basi = vengono incorporati nel DNA
- agenti modificatori delle basi = ne alterano la struttura
- agenti intercalanti = si inseriscono tra basi adiacenti
Radiazioni
Possono essere di diversi tipi: - radiazione ultravioletta = stimola formazione di dimeri di pirimidina
- radiazioni ionizzanti = rimuovono elettroni dalle molecole biologiche
generano intermedi molto reattivi (raggi X)
Riparazione per escissione
Svolgono la sintesi da translesione, ovvero la sintesi di nuovo DNA in regione nei quali lo stampo è danneggiato
1- enzimi endonucleasi di riparazione staccano i nucleotidi alterati da uno dei filamenti
tagliano lo scheletro del DNA vicino al sito danneggiato, facilitano l’allontanamento di nucleotidi
possono collaborare con altri enzimi: - elicasi
- endonucleasi
2- una DNA polimerasi sostituisce i nucleotidi mancanti con i nucleotidi corretti
la sequenza nucleotidica del filamento complementare fa da stampo
3- una DNA ligasi salda l’interruzione rimasta e lega il tutto
i legami che forma sono fosfodiesterici
Riparazione per escissione delle basi
Corregge i danni alle singole basi del DNA, come le basi deamidate
Vengono individuate da specifici enzimi, come la DNA glicolasi
Riparazione per escissione di nucleotidi
Usato per rimuovere dimeri di pirimidine o grandi lesioni
Fa uso di proteine che riconoscono le distorsioni più evidenti
In particolare l’enzima endonucleasi NER
Introduce due tagli nello scheletro del DNA, a monte e a valle del danno
Un’elicasi si lega al tratto di DNA tra i due tagli e lo svolge
Una DNA polimerasi introduce i nucleotidi mancanti
Una ligasi ripristina in filamento
Riparazione dei mismatch
Corregge errori introdotti durante la replicazione del DNA
Dato che le basi appaiate in modo sbagliato non formano legami idrogeno corretti, la loro presenza può essere usata come segnale
Il sistema degli appaiamenti scorretti deve essere in grado di riconoscere quale dei due filamenti è quello originale e quale il figlio
Uno dei metodi più semplici (cellule batteriche) è controllare la metilazione delle adenine
Generalmente, esse sono modificate per aggiunta di un gruppo metilico, ma questo legame richiede tempo
In questo intervallo di tempo, il filamento nuovo può essere individuato dal fatto che non è metilato
Viene eliminato attraverso l’attività sinergica di endonucleasi ed esonucleasi
Negli eucarioti questo sistema esiste, ma è molto più complesso
Timina al posto dell’uracile
Energeticamente la timina dovrebbe essere sfavorevole
La metilazione necessaria per la sintesi della timina richiede energia
Quando il DNA subisce un danno di deaminazione, la citosina è convertita in uracile
In questo modo, i sistemi di riparazione possono individuare il danno istantaneamente
Rotture di entrambi i filamenti
Si utilizzano due principali meccanismi
- Unione non omologa delle estremità
Utilizza un corredo di proteine che si legano alle estremità dei due frammenti di DNA e le riuniscono
Metodo soggetto ad errori (per esempio, non impedisce la perdita di nucleotidi)
- Ricombinazione omologa
Usa la copia intatta dell’altro cromosoma come stampo (usata anche per scambio di informazioni)
Processo più complicato che trae vantaggio dal fatto che la cellula possiede due coppie di ciascun cromosoma
DIVISIONE NUCLEARE E CELLULARE
La Mitosi è divisa in cinque fasi successive
Profase
Fase successiva alla replicazione del DNA = la cellula è uscita dalla fase S ed è entrata in fase G2, al cui termine
si ha la massima condensazione di fibre cromatiniche
La profase inizia quando i cromosomi sono visibili al microscopio ottico

1- I nucleoli si disperdono
2- Entra in azione il centrosoma, che in fase S si è duplicato
Localizzato vicino al nucleo, è il principale centro MTOC (centro assemblaggio microtubuli)
I due centrosomi migrano verso le estremità opposte del nucleo
Mentre si allontanano, agiscono da sito di nucleazione per assemblaggio di microtubuli
La regione compresa tra i due centrosomi si riempi di microtubuli (saranno il fuso mitotico)
I centrioli hanno un ruolo nell’orientamento del fuso all’interno della cellula
3- I microtubuli del citoscheletro si dissociano

Prometafase
La prometafase inizia quando le membrane dell’involucro nucleare iniziano a frammentarsi

1- I microtubuli entrano a seguito della disgregazione dell’involucro nucleare


Prendono contatto con i cromosomi
2- I microtubuli del fuso si attaccano ai cromatidi appaiati a livello del centromero
Il centromero è una regione strozzata che presente sequenze di DNA ripetuto (dette CEN)
I microtubuli si legano ad una proteina associata al centromero, il cinetocore
Ogni cromosoma presenta due cinetocori ai lati opposti del centromero
A ciascuno di questi si lega un microtubulo

La composizione è la stessa, ma i microtubuli si differenziano in: - MT del cinetocore = legati ai cromosomi


- MT polari = interagiscono con MT del lato opposto
- MT astrali = formano gli aster ai poli della cellula

Metafase
La metafase i cromosomi sono alla massima condensazione e legati alla piastra metafasica

1- I microtubuli sembrano fermi


Sono in realtà sottoposti a forze di attrazione e repulsione di pari intensità

La metafase dura una ventina dell’ora richiesta per la mitosi

Anafase
L’anafase è la fase più rapida, dura pochi minuti

1- I due cromatidi fratelli di ciascun cromosoma improvvisamente e rapidamente si separano


Iniziano a muoversi verso i poli opposti del fuso

E’ caratterizzata da due tipi di movimenti: - Anafase A = i cromosomi sono tirati, dal centromero verso i poli,
man mano che i MT del cinetocore si accorciano
- Anafase B = i poli del fuso si allontanano fra loro,
man mano che i MT polari si allungano

Telofase
All’inizio della telofase i cromosomi figli sono arrivati ai poli del fuso

1- I cromosomi si decondensano
Tornano ad assumere la forma di fibre estese (cromatina interfasica)
2- Al sito di organizzazione nucleolare del DNA cominciano a formarsi i nucleoli
3- Il fuso si disgrega
4- Si formano gli involucri nucleari intorno ai corredi cromosomici figli

Citocinesi
Divisione cellulare
Può avvenire immediatamente dopo, con un certo ritardo o non avvenire affatto (chicchi di cereali)
Inizia dal solco di clivaggio ed è la conseguenza di un anello contrattile di microfilamenti di actina
La forza necessaria proviene dall’accoppiata actina-miosina
Movimenti cromosomici
Assemblaggio del fuso
Il fuso mitotico è responsabile dei movimenti cromosomici durante la mitosi
I microtubuli hanno polarità intrinseca (le subunità di tubulina sono orientate tutte in una sola direzione)
L’estremità dove inizia l’assemblaggio è la negativa, quella dove avviene la maggior crescita è la positiva
Nella profase tardiva, l’attività di formazione dei microtubuli accelera moltissimo
Nella prometafase, si dissocia l’incolucro nucleare e si stabilisce un contatto microtubuli-cinetocori
I microtubuli divengono microtubuli del cinetocore, ed il legame rallenta la loro depolimerizzazione
Poiché i cinetocori si trovano sui lati opposti di un cromosoma, solitamente si attaccano ai microtubuli provenienti dai lati opposti
I microtubuli polari dei due poli opposti, invece, si mettono direttamente in contatto tra loro
Siccome si uniscono polarità uguali, delle proteine li legano insieme con legami crociati (che li stabilizzano)
Separazione dei cromosomi
All’inizio della prometafase cromosomi si distribuiscono nel fuso in modo casuale
Solo successivamente migrano verso la regione centrali del fuso
Questa migrazione è il prodotto di due forze contrarie
Vengono disposti sulla piastra metafasica (la localizzazione che dà loro più stabilità)
All’inizio dell’anafase, i due cromatidi si separano e migrano verso poli opposti
Diverse molecole mediano questa migrazione
Una delle più presenti è l’enzima topoisomerasi II
Presente nei pressi del centromero, catalizza le modifiche del superavvolgimento negativo
Proteine motrici
Utilizzano l’energia ricavata dall’ATP per modificare la propria forma in modo da esercitare forza o indurre il movimento
Hanno tre distinti ruoli
1- Meccanismo che tira i cromosomi dai cinetocori ai poli, durante l’Anafase A
Guidato da proteine motrici associate ai microtubuli del cinetocore
Quella presente all’estremità positiva è immersa nel cinetocore
Induce la depolimerizzazione del microtubulo
Sposta il cromosoma verso il polo progressivamente (tipo Pac Man)
Quella presente all’estremità negativa è immersa nel polo del fuso
Induce la depolimerizzazione del microtubulo
Tira i microtubuli ed cromosomi ad essi attaccati
2- Movimento di allontanamento dei poli dal fuso, durante l’Anafase B
Guidato da proteine motrici associate ai microtubuli polari
I microtubuli polari si allungano per aggiunta di subunità di tubulina alle loro estremità positive
Poiché le estremità positive sono quelle dove gli MT polari si incrociano, spingono le pareti all’esterno
3- Forza motrice esercitata durante l’anafase
Guidato da proteine motrici associate ai microtubuli astrali
Queste proteine attaccano l’estremità positiva dei MT astrali alla contraccia cellulare
Esercitano sul fuso una tensione verso l’esterno
Questa forza dovrebbe contribuire alla separazione dei poli del fuso durante l’Anafase B
Gli apporti di queste tre forze sono diversi per ogni organismo
REGOLAZIONE DEL CICLO CELLULARE
Le variazioni del ciclo cellulare più frequenti riguardano la sua lunghezza temporale
Dipende dal tipo di organismo e dalle caratteristiche della cellula
Per es: le cellule embrionali non hanno necessità di sintetizzare componenti diverse dal DNA,
poiché la cellula uovo è una cellula sufficientemente grande da poter sostenere diversi cicli di divisione cellulare
ad ogni ciclo il citoplasma iniziale è ripartito in cellule sempre più piccole
non hanno una fase G1 ed hanno una brevissima fase G2

Un sistema di controllo deve garantire che tutti i processi associati alle diverse fasi siano portati a termine
Ciò è fatto da un gruppo di molecole che agiscono a livello dei punti di transizione del ciclo cellulare
A ciascun punto di controllo, le condizioni all’interno della cellula determinano se la cellula può o non può passare alla fase dopo
Punto di controllo G1 – Punto di Restrizione
La capacità di superare il punto di restrizione è controllata da fattori di crescita
dimensioni della cellula
presenza di danni al DNA
Punto di controllo G2-M
E’ il punto di controllo fondamentale, in quanto la cellula decide se entrare in mitosi
Se la cellula non dispone dei requisiti per dividersi, rimane in uno stallo paragonabile a G0
I requisiti sono: dimensioni della cellula
presenza di danni al DNA
replicazione del DNA
Punto di controllo Metafase-Anafase
Punto di controllo dove si programma la segregazione dei cromosomi nelle cellule figlie
Per superare questo controllo tutti i cromosomi devono essere correttamente attaccati al fuso

Complesso Cdk-ciclina mitotitco


La progressione attraverso il ciclo cellulare è controllata da chinasi ciclina dipendenti
Le cicline attraverso oscillazioni della loro concentrazione intracellulare, controllano l’attività di varie Cdk nei diversi stadi del ciclo
Cicline mitotiche = coinvolte nella regolazione del passaggio da G2 a M e nelle prime fasi di M
Cicline G1 = cicline coinvolte nel passaggio dal punti di restrizione di G1 (le proteine che ad esse si legano Cdk G1)
Cicline S = richiese per gli eventi associati alla replicazione del DNA durante la fase S

L’attività del complesso Cdk-ciclina mitotico è esemplificato dallo sviluppo della cellula uovo
In essa, il ciclo cellulare si ferma poco dopo l’inizio della meiosi e, dopo un ormone, alla metafase della seconda divisione meiotica
Solo a questo punto è una cellula uovo matura
L’ormone che fa riprendere la meiosi (induce anche la mitosi) è l’MPF (Fattore che Promuove la Maturazione)
Esso è un complesso mitotico Cdk-ciclina
Come funziona: Esso è controllato in modo tale da operare solo al momento appropriato, alla fine della fase G2
La Cdk mitotica è attiva come proteina chinasi solo quando è legata ad una ciclina mitotica
Quest’ultima non è sempre presente in quantità adeguante, ma aumenta gradualmente a partire da G1
A metà della mitosi, le molecole di ciclina mitotica sono distrutte
Il risultato è un declino dell’attività della Cdk mitotica, che impedisce il verificarsi di un’altra mitosi
L’attivazione della Cdk mititica coinvolge anche la fosforilazione/defosforilazione della proteina Cdk stessa
Appena la ciclina miotica si lega alla Cdk mitotica, il complesso è inattivo
1- Una chinasi inibitoria fosforila la Cdk in altre due posizioni, bloccandone il sito attivo
2- Una chinasi attivatrice aggiunge un gruppo fosfato attivatore su un particolare aminoacido della Cdk
3- Una fosfatasi specifica rimuove i fosfati inibitori
La Cdk mitotica attivata stimola la fosfatasi, causando un’accelerazione del processo di attivazione
Il complesso mitotico Cdk-ciclina, inoltre, fosforila proteine associate ai microtubuli facilitandone l’assemblaggio al fuso
Il complesso mitotico Cdk-ciclina contribuisce anche all’anafase
L’MPF, infatti, fosforila e attiva, il complesso che promuove l’anafase
Si tratta di un enzima ubiquitina ligasi, che indirizza specifiche proteine verso la degradazione (legandole alla ubiquitina)
Il complesso che promuove l’anafase introduce proteine adesive che tengono uniti i cromatidi fratelli
Queste proteine adesive sono le coesine, vengono depositate sul SNA cromosomico di nuova sintesi durante la fase S
Assicurano il legame immediato tra i cromatidi fratelli
All’inizio dell’anafase, le coesine sono degradate attraverso una separasi ed una securina attivate dall’MPF
Il complesso che promuove l’anafase induce eventi associati alla fine della mitosi, indirizzando la ciclina mitotica alla distruzione
L’attività del complesso Cdk-ciclina G1 regola l’entrata alla fase S
Il punto di restrizione determina se una cellula possa entrare o meno in fase S è sotto il controllo di vari fattori (dimensione cellulare…)
Questi diversi segnali funzionano attivando il complesso Cdk-ciclina G1, la cui attività induce la progressione in S
Tra i bersagli principali delle fosforilazioni, la proteina Rb
La proteina Rb controlla l’espressione dei geni i cui prodotti proteici sono necessari per entrare in fase S
Come funziona: 1- Rb lega e inibisce un fattore di trascrizione (proteina che, quando non legata ad Rb, tiene attivi geni per replicazione)
2- La Cdk-ciclina G1 va a fosforilarla e Rb rilascia il fattore trascrizionale, che si attiva

Meccanismi di checkpoint
- Checkpoint del fuso
Impedisce che i cromosomi in anafase si spostino prima che siano tutti agganciati al fuso
Agisce tramite un meccanismo ove i cromosomi i cui cinetori restano staccati dai microtubuli creano un segnale d’attesa
Questo segnale va ad inibire il complesso che promuove l’anafase
Finché il complesso che promuove l’anafase è inibito, le coesine non possono essere distrutte
E’ trasmesso da proteine della famiglia Mad e Bub
Esse si accumulano a livello dei cinetocori cromosomici non agganciati
Qui vengono convertite in un complesso multiproteico
- Checkpoint della replicazione del DNA
Controlla lo stato della replicazione del DNA per garantire che la sintesi sia completata prima di uscire da G2
In assenza dell’attività di MPF il ciclo si arresta in G2 ed entra in una simil-G0
- Checkpoint dei danni al DNA
Impedisce alle cellule con danni al DNA di procedere finché i danni non sono riparati
Il ciclo viene arrestato mediante inibizione dei complessi Cdk-ciclina in ogni momento purché prima della mitosi
Quando il DNA è esposto ad agenti che causano ingenti danni al DNA, esso attiva l’enzima protein chinasi ATM
Esso catalizza la fosforilazione di p53, la protegge dalla degradazione e ne determina l’accumulo
p53 attiva due tipi di eventi, in base al tempo di risposta:
- Arresto del ciclo cellulare
A cui seguono i tentativi di riparazione del DNA
- Morte cellulare per apoptosi
Entrambe si fondano sulla capacità di p53 di legarsi al DNA ed agire come fattore trascrizionale

FATTORI DI CRESCITA
Negli organismi multicellulare, le cellule sono normalmente circondate da fluidi extracellulari ricchi di nutrienti,
tuttavia è necessario contenere la crescita/proliferazione cellulare per preservare la vita dell’individuo
Per fare questo utilizzano proteine di segnalazione extracellulare, i fattori di crescita
I più diffusi sono i mitogeni, che stimolano la cellula ad entrare nella fase S
Altri fattori importanti sono - il fattore di crescita di derivazione piastrinica
proteina prodotta dalle piastrine che stimola la proliferazione delle cellule del
tessuto connettivo e della muscolatura liscia
- fattore di crescita epidermico
distribuito in quasi tutti i tessuti e fluidi corporei
Agiscono legandosi a recettori di membrana presenti sulla superficie di cellule bersaglio
Inducono spesso ad una complessa cascata di segnali (es via del Ras)
1- legame fattore di crescita-recettore
2- fosforilazione del recettore
3- attivazione di Ras
4- attivazione di una cascata di chinasi citoplasmatiche
5- attivazione di fattori trascrizionali
6- sintesi di molecole di Cdk e ciclina per proliferazione cellulare
Esistono fattori che inibiscono la proliferazione cellulare, al posto di stimolarla
Il più importante è il fattore di crescita trasformante beta
Può agire da inibitore della crescita
Si lega ad un recettore sulla superficie e catalizza la fosforilazione di particolari proteine
che inibiscono le Cdk
Può agire come promotore della crescita
RIPRODUZIONE SESSUALE
La riproduzione sessuale consente che i caratteri favorevoli dei vari individui possano combinarsi in modi diversi
Genera, tra gli individui di una popolazione, un’enorme variabilità
La variabilità dipende da mutazioni (cambiamenti casuali della sequenza di basi del DNA)
L’informazione genetica proviene dai due diversi genitori
Gli individui che si riproducono sessualmente hanno cellule che contengono due copie di ogni cromosoma
Una ereditata dal padre,
una ereditata dalla madre
I due membri della coppia sono detti “cromosomi omologhi”
portano la stessa serie di geni, ma le due forme di ogni singolo gene (alleli) possono variare
Una cellula con due serie di cromosomi è detta diploide (2n)
Questo stato dà una certa protezione ai danni al DNA – ricombinazione omologa
Una cellula con una sola serie di cromosomi è detta aploide (n)
Il locus genico
E’ la posizione occupata sul cromosoma dalla sequenza di DNA di un particolare gene
Le due forme di un gene sono dette alleli
La combinazione degli alleli determina l’espressione nell’organismo del carattere controllato da quel gene
Un organismo che porta due alleli identici di un dato gene è detto omozigote per quel gene
Un organismo che presenta alleli diversi è detto eterozigote e solitamente manifesta solo il carattere dell’allele dominante
L’allele recessivo viene conservato intatto (salvo mutazioni) e trasmesso alle generazioni successive
Il genotipo è la composizione genetica di un dato organismo
Il fenotipo è la manifestazione fisica del genotipo
Dipende anche da una componente ambientale
I gameti sono le cellule specializzate nella riproduzione
Nella riproduzione sessuale si ha l’unione dell’informazione genetica proveniente da due genitori
Per poter generare organismi figli diploidi, le cellule parentali che si uniscono devono essere aploidi
Sono detti gameti (spermatozoi = uomo, uova = donna)
L’unione dei gameti è la fecondazione
Il prodotto della fecondazione (l’uovo fecondato) è detto zigote
Alla fecondazione segue lo sviluppo dello zigote
MEIOSI
La meiosi comporta sempre la duplicazione dei cromosomi di una cellula diploide, seguita da due divisioni che la convertono in quattro aploidi

Meiosi I – Divisione Riduttiva


Profase I
1- Leptotene
Le fibre di cromatina si condensano
2- Zigotene
I cromosomi omologhi si appaiano grazie alla sinapsi
Si formano le tetradi
Quattro cromatidi, a due a due derivanti da ciascun cromosoma omologo
I cromosomi omologhi si dispongono a bouquet
A mediare questo sono complessi sinaptinemali (processo associato al crossing-over)
3- Pachitene
Ha luogo il crossing-over
Scambio fisico dell’informazione genetica tra punti corrispondenti dei cromosomi omologhi
I cromosomi si compattano ulteriormente
4- Diplotene
Iniziano a separarsi i cromosomi omologhi di ciascuna tetrade, soprattutto nella zona del centromero
I due cromosomi di ciascuna coppia restano attaccati a connessione dette “chiasmi”
5- Diacinesi
I cromosomi si ricondensano
I centromeri omologhi si separano ulteriormente (anche per effetto di noduli di ricombinazione)
I chiasmi restano gli unici punti di contatto degli omologhi
Scampaiono i nucleoli
Si forma il fuso
Si frammenta l’involucro nucleare
Metafase I
1- Le tetradi si attaccano ai microtubuli del fuso attraverso i cinetocori
Dato che ogni tetrade è formata da quattro cromatidi (due cromatidi fratelli di ciascun cromosoma),
sono presenti quattro cinetocori
Quelli dei cromosomi fratelli sono affiancati e rivolti verso lo stesso polo della cellula
Per cui, i cinetocori dei cromatidi fratelli di un cromosoma omologo si attaccano a
microtubuli provenienti da un polo del fuso, e gli altri dall’altro
2- Migrano verso l’equatore del fuso
Anafase I
1- I membri di ciascuna coppia di cromosomi omologhi si separano
In mitosi sono i cromatidi a separarsi, in meiosi i cromosomi omologhi!
Per evitare che i cromatidi fratelli si separino, è prodotta una proteina meiosi-specifica
La shugoshina protegge le coesine a livello dei centromeri dei cromosomi
2- Iniziano a migrare verso i poli opposti tirati dai microtubuli dei cinetocori
Ciascun polo riceve un corredo aploide di cromosomi
Telofase I
1- A ciascun polo del fuso arriva un corredo aploide di cromosomi
2- Intorno ai cromosomi si formano involucri nucleari
3- Inizia la citocinesi
Si formano due cellule aploidi i cui cromosomi sono formati da due cromatidi fratelli

Meiosi II – Divisione Separativa


Non è preceduta da alcuna replicazione del DNA
Si svolge come una divisione mitotica, il cui scopo è quello di suddividere i cromatidi fratelli
Manca la prometafase
Produce cellule che contengono un assortimento casuale di cromosomi paterni e materni
Ciascun cromosoma è il risultato della combinazione casuale di DNA paterno e materno

Confronto Meiosi I Mitosi


Profase 2n, 4C 2n, 4C
Ciascun cromosoma condensato è formato da quattro cromatidi
Cromosomi omologhi appaiati in sinapsi Ogni cromosoma si comporta in modo indipendente
Formazioni delle tetradi
Crossing over tra cromatidi non fratelli
Metafase Le tetradi si allineano sulla piastra metafasica I singoli cromosomi si allineano sulla piastra metafasica
Anafase I cromosomi si separano I cromatidi si separano
Bilancio 1n, 2C (Meiosi II = 1n, 1C) 2n, 2C
Differenziamento cellulare dei gameti
Spermatozoi
Tutti e quattro i prodotti della meiosi sono conservati e vengono differenziati
Raggiungono la maturazione eliminando molto citoplasma e sviluppando un flagello
Al momento della fecondazione rilasciano enzimi dalla vescicola acrosoma
Cellula uovo
Entrambe le divisioni mitotiche sono asimmetriche
Si formano - tre globuli polari
- una cellula uovo grande
Acquisisce specializzazione durante il processo di meiosi
Durante la profase I, nella “fase di crescita”
Sviluppa diversi rivestimenti protettivi per agenti chimici/fisici
Lo sviluppo dell’oocita rimane fermo in profase I fino ad opportuna stimolazione
Il progesterone stimola una proteina chinasi che attiva una cascata
La cascata di reazioni attiva MPF, che completa la Meiosi I
La cellula uovo è completamente maturata
Potenzialmente è pronta a fecondazione

VARIABILITÀ GENETICA – SEGREGAZIONE e ASSORTIMENTO DEGLI ALLELI


Leggi di Mendel sull’ereditarietà - Legge della segregazione
I due alleli di un gene sono unità distinte che si separano durante la formazione dei gameti
I due alleli mantengono la loro identità anche quando si sono distribuiti
separatamente in gameti diversi o si trovano in un organismo ibrido
Per questo possono comparire immodificati in generazioni successive
- Legge dell’assortimento indipendente
I due alleli di ciascun gene segregano indipendentemente dagli alleli di altri geni
Si applica solo ai geni localizzati su cromosomi diversi
Sutton – Teoria cromosomica dell’ereditarietà
- I nuclei di tutte le cellule, fatta eccezione per i gameti, contengono due corredi di cromosomi omologhi
- I cromosomi mantengono la loro individualità ed integrità genetica durante tutto i ciclo vitale
- I due corredi di cromosomi omologhi di una cellula diploide sono funzionalmente equivalenti (ciascuno porta la stessa serie di geni)
- Gli omologhi parentali formano sinapsi durante la meiosi e si muovono verso i poli opposti del fuso, segregando in cellule diverse
- Gli elementi materni e paterni delle diverse coppie di omologhi segregano indipendentemente dalla meiosi

Omologia di sequenza del DNA


I cromosomi omologhi sono fatti di molecole di DNA la cui sequenza di basi è quasi (anche se non completamente) identica
Piccole differenze nella sequenza di basi del DNA cromosomico possono generare alleli diversi per lo stesso gene
Queste differenze derivano da mutazioni e le popolazioni via via accumulano mutazioni
Gli alleli si esprimono in seguito a trascrizione in RNA e traduzione in proteine
Determinano di conseguenza il fenotipo dell’organismo
La somiglianza delle sequenze di basi dei DNA è il motivo per cui i cromosomi omologhi riescono ad appaiarsi (con sinapsi) durante le meiosi
Fondamentale per il crossing-over

Segregazione e assortimento
– dei geni associati
Gli alleli di geni situati sullo stesso cromosoma durante la meiosi restano associati se non avviene crossing-over
– con crossing-over
Possono scambiarsi
Le probabilità del crossing-over dipende da diversi fattori (distanza dei loci genici, per es)
– dei geni non associati
Gli alleli di geni situati su cromosomi diversi durante la meiosi segregano ed assortiscono indipendentemente
Le probabilità sono le medesime per tutti gli alleli

VARIABILITÀ GENETICA – RICOMBINAZIONE e CROSSING OVER


Gruppi di associazione = geni associati solitamente ereditati insieme
Il numero di gruppi di associazione corrisponde al numero di cromosomi
Ogni cromosoma costituisce la base fisica per uno specifico gruppo di associazione
La ricombinazione nella progenie avviene tramite scambi di segmenti tra cromosomi omologhi (eventi di rottura e fusione)
Questo processo è il crossing-over
Un particolare tipo di allele (o gruppi di alleli) inizialmente preesistenti su uno dei due cromosomi può essere scambiato in
modo reciproco con allele (o gruppi di alleli) presente sull’altro
Avviene in pachietene (profase I)
Possono esserci crossing over multipli
Il cromosoma può essere considerato come una serie lineare di geni le cui posizioni possono essere definite in base ai dati di ricombinazione
CODICE GENETICO
Insieme di regole su cui è fondata la relazione tra sequenza di basi nucleotidiche del DNA ed ordine lineare degli amminoacidi nelle proteine
Una sequenza di basi nucleoniche può contenere l’informazione per guidare la sintesi proteica, ma deve essere tradotta in sequenza
amminoacidica per avere senso nella cellula
Beadle e Tatum – Un gene, un enzima
Afferma che ciascun gene controlla la produzione di una singola molecola enzimatica
Pauling e Ingram – Un gene, un polipeptide
Afferma che la sequenza nucleotidica di un gene determina la sequenza degli amminoacidi della catena polipeptidica
Moderna – Funzione genica più complessa
Tiene conto del fatto che i geni eucariotici contengono sequenze non codificanti intersperse tra regioni codificanti
- I geni non mostrano una corrispondenza lineare con i loro prodotti polipeptidici
- Le sequenze codificanti possono essere lette in modi differenti per produrre mRNA diversi (splicing alternativo)
Tiene conto del fatto che esistono geni che non portano alla produzione di catene polipetidiche,
ma codificano per RNA: RNA di trasferimento, RNA ribosomiali o RNA nucleari
Afferma che i geni sono unità funzionali che o (1) codificano per la sequenza di uno o più polipeptidi o (2) per uno o più tipi di RNA

E’ un codice a triplette
Tre coppie di basi di un DNA a doppio filamento sono richieste per codificare ciascun amminoacido di un polipeptide
Consente di avere “quattro (numero di basi) alla terza (numero di “lettere per parola”) = 64” combinazioni
Bastano ed avanzano per codificare i venti amminoacidi
Mutazioni frameshift Supponiamo di avere una frase di parole a tre lettere
- Se letta nella fase corretta, è comprensibile
- Se vi è inserzione/delezione di una lettera, la cornice di lettura si sposta
Il messaggio si altera in modo incomprensibile
- Se vi è inserzione/delezione di tre lettere, parte del messaggio è incomprensibile
La cornice di lettura non altera completamente il messaggio
E’ degenerato
Un singolo amminoacido può essere codificato da più di una tripletta di nucleotidi
Ciò significa che molti amminoacidi sono specificati da più di un codone
Non è sovrapposto
La cornice di lettura avanza rigidamente ogni tre nucleotidi, evitando di leggere nucleotidi già letti
Non è ambiguo
Tutti i 64 codoni sono usati nella traduzione dell’mRNA e ciascun codone ha un significato
- 61 specificano l’aggiunta di particolari amminoacidi al polipeptide in crescita
Uno di questi è anche codone iniziatore (AUG)
- 3 sono codoni di stop (UAA, UAG, UGA)
E’ (quasi) universale
I 64 codoni (quasi sempre) specificano sempre per gli stessi amminoacidi
Le eccezioni sono poche e circoscritte

Flusso direzionale dell’informazione genica


1- Un segmento di un filamento di DNA agisce come stampo per la sintesi di una molecola di RNA (mRNA)
Trascrizione – Trasferimento di un messaggio usando lo stesso linguaggio nucleotidico (acido nucleico>acido nucleico)
2- La molecola di RNA dirige la sintesi di una particolare proteina (o è, più raramente, prodotto finale)
Traduzione – Cambiamento di linguaggio da sequenza nucleotidica a sequenza amminica (acido nucleico>catena polipeptidica)
Certi virus sono in grado di condurre la “trascrizione inversa”
Usano l’RNA virale come stampo per la sintesi di DNA
TRASCRIZIONE – PROCARIOTI
La trascrizione del DNA è condotta dall’enzima RNA polimerasi, che catalizza la sintesi di RNA usando il DNA come stampo
Le cellule batteriche hanno una sola RNA polimerasi che catalizza la sintesi delle tre maggiori classi di RNA: mRNA, tRNA e rRNA
Struttura RNA polimerasi: - due subunità alfa
- due subunità beta (sufficientemente diverse da poter essere distinte in beta1 e beta2)
- una subunità dissociabile detta Fattore Sigma
Gioca un ruolo critico nel processo che promuove il legame della RNA polimerasi a sequenze
specifiche del DNA dette promotori, che si trovano all’inizio dei geni

La trascrizione è la sintesi di una molecola di RNA la cui sequenza di basi è complementare a quella del filamento di DNA stampo
E’ un processo divisibile in quattro momenti
1- Legame della RNA polimerasi ad una sequenza promotrice
Il sito promotrice è una specifica sequenza di una decina di coppie di basi che determina dove la sintesi debba iniziare
Le sequenze del promotore sono descritte in direzione 5’->3’ sul filamento codificante
Il filamento codificante è quello opposto a quello che ha funzione “di stampo”
Le sequenze a 5’ sono dette a monte, quelle a 30 sono dette a valle del filamento codificante
Il riconoscimento e il legame dell’enzima dipendono solo da una serie di corte sequenze localizzate in specifiche posizioni
all’interno di ciascun promotore
Il punto dove ha inizio la trascrizione è detto “punto di inizio”
Molto spesso è rappresentato da una purina
2- Inizio della sintesi dell’RNA
Una volta che le molecole di RNA polimerasi si sono legate ad un sito promotore ed in quel punto la doppia elica del DNA
si è srotolata, comincia la fase di inizio
Uno dei due singoli filamenti del DNA esposti serve come stampo per la sintesi dell’RNA
Usa ribonucleosidi trifosfati come substrati
- Il filamento che porta la sequenza promotrice determina quale via debba seguire l’RNA polimerasi
- L’orientamento dell’enzima determina quale filamento di DNA sia trascritto
L’RNA polimerasi catalizza la formazione di un legame fosfodiesterico tra il gruppo ossidrillico in 3’ ed il fosfato
La polimerasi si muove lungo il promotore fino a quando la catena raggiunge la lunghezza di nove nucleotidi
Il fattore sigma si stacca dall’RNA polimerasi e lo stadio di inizio si completa
3- Allungamento della catena di RNA
L’RNA polimerasi procede lungo la molecola di DNA, la cui elica si srotola poco alla volta
Aggiunge progressivamente un nucleotide complementare alla catena nascente di RNA
Il filamento viene allungato nella direzione 5’->3’, ogni nucleotide è aggiunto all’estremità 3’
Mentre la catena di RNA cresce, gli ultimi nucleotidi aggiunti rimangono appaiati al filamento di DNA stampo,
formando un corto ibrido RNA-DNA
Il DNA davanti all’enzima si svolge per permettere la formazione dell’ibrido DNA-RNA
Il DNA dietro si riavvolge in doppia elica, con superavvolgimento mediato da topoisomerasi
Alcune RNA polimerasi possiedono attività esonucleasica che permette correzioni di errori
4- Terminazione della sintesi dell’RNA
L’allungamento procede fino a quando l’RNA polimerasi non incontra un segnale di terminazione
Il risultati è il rilascio di una molecola di RNA completa e dell’RNA polimerasi core
La polimerasi core può tornare a legare un fattore sigma e iniziare la sintesi di RNA da un nuovo promotore
TRASCRIZIONE – EUCARIOTI
Principali differenze: - Ci sono tre differenti RNA polimerasi, ciascuna sintetizza una o più classi di RNA
- I promotori eucariotici sono più diversificati (più tipi e più variabilità nello stesso tipo)
- Il legame RNApolimerasi-DNA richiede la partecipazione di fattori di trascrizione (non parte integrante RNApol)
- Le interazioni proteina-proteina sono molto importanti (almeno nelle prime fasi)
- Il taglio dell’RNA è più importante del sito dove la trascrizione termina per determinare l’estremità 3’
- Le molecole di RNA eucariotiche sono sottoposte a maturazione (modifiche chimiche) durante e dopo
RNA polimerasi
RNA polimerasi I
Risiede nel nucleolo
Responsabile della sintesi di una molecola di RNA precursore di tre dei quattro tipi di rRNA
Il promotore
E’ composto da: - promotore core
minimo insieme di sequenze di DNA sufficiente al corretto inizio della trascrizione
- sequenza a monte
sequenza che facilita l’inizio della trascrizione
RNA polimerasi II
Risiede nel nucleoplasma
Sintetizza i precursori degli mRNA e piccoli RNA responsabili della maturazione post-trascrizionale
Il promotore
Quattro tipi di sequenze di DNA: - sequenza iniziatrice
- TATA box
- elemento di riconoscimento
- elemento promotore a valle
Due tipi di promotori core: - promotori guidati dalla TATA (sequenza iniziatrice, TATA box, el. di ric)
- promotori guidati dal DPE (elemento promotore a valle, sequenza iniziatrice)
RNA polimerasi III
Risiede nel nucleoplasma
Sintetizza piccoli RNA, precursori dei tRNA e il quarto rRNA
Il promotore
Usa sequenze consenso di due blocchi
Si trovano completamente a valle del sito di inizio della trascrizione
Strutturalmente sono tutti e tre piuttosto simili: enzimi piuttosto grossi, con subunità polipeptidiche multiple

Fattori di trascrizione
Si tratta di proteine richieste obbligatoriamente perché l’RNA polimerasi possa legarsi al promotore e iniziare la sintesi
Gli eucarioti ne hanno un gran numero ed il funzionamento è leggermente diverso da ciascuno
Generalmente, si legano al promotore dell’RNA polimerasi ed il complesso risultante si lega alla polimerasi
MATURAZIONE DELL’RNA
Una molecola di DNA prodotta dalla trascrizione è detta “trascritto primario”
Deve andare incontro a cambiamenti chimici prima che possa svolgere la sua funzione nella cellula
Maturazione = modificazioni chimiche per produrre RNA funzionale (che usa il trascritto primario come precursore)
Implica sempre la rimozioni di alcune regioni, può includere la modificazione o l’aggiunta di certi nucleotidi

Taglio di rRNA multipli da un precursore comune


Dei quattro tipi di rRNA presenti nei ribosomi, i tre più grossi sono codificati da una singola unità di trascrizione
Questa unità di trascrizione è sintetizzata nel nucleolo dall’RNA polimerasi I come un unico trascritto primario (pre-rRNA)
Le sequenze di DNA che codificano per questi tre DNA sono separate nell’unità di trascrizione da “spaziatori trascritti”
Ciò permette alla cellula di produrre in uguale quantità questi tre rRNA
Dopo che l’unità di trascrizione per il pre-rRNA è stata trascritta dalla RNA polimerasi I, la risultante molecola matura
Attraverso numerose reazioni di taglio, rimuove gli spaziatori trascritti e li degrada
Aggiunta e modificazioni di nucleotidi del tRNA
Le cellule sintetizzano diversi tRNA, ciascuno dei quali è deputato a trasportare un particolare amminoacido
Una molecola di tRNA contiene un’ottantina di nucleotidi, alcuni dei quali sono chimicamente modificati
La struttura secondaria del tRNA è detta “a trifoglio”
La maturazione del pre-tRNA coinvolge diversi passaggi 1- al 5’ una corta sequenza leader viene rimossa dal pre-tRNA
2- al 3’ due nucleotidi terminali sono sostituiti
3- il 15% dei nucleotidi sono chimicamente modificati
4- viene rimossa una sequenza interna
taglio-riunione che coinvolge RNA endonucleasi e RNA ligasi
Aggiunta di cappuccio e coda / Rimozione degli introni nell’mRNA
La maggior parte degli mRNA procariotici è sintetizzata in forma pronta alla traduzione, anche prima che la trascrizione sia completa
Negli eucarioti la trascrizione e la traduzione sono separate - nello spazio trascrizione nel nucleo
traduzione nel citoplasma
- nel tempo
Per convertire i trascritti primari in molecole mature di mRNA, nel nucleo avvengono sostanziali modifiche chimiche
Gli introni
Sequenze presenti nel trascritto primario che non appaiono nell’RNA maturo e funzionale
Perché esistono? - Rendono possibile lo splicing alternativo
Permette diversi tipi di splicing a carico di singoli pre-mRNA
Permette l’origine di più RNA, e dunque polipeptidi, da uno stesso gene
- Ruolo evolutivo
Potrebbero essere base per evoluzione di nuove proteine
- Crossing over tra introni di geni diversi crea geni con nuovi esoni
- Ricombinazioni di introni diversi in uno stesso gene produce
duplicati di particolari esoni all’interno del gene stesso
- Richard Dawkins
Il Gene Egoista
“E’ nato prima l’uovo o la gallina”
- Antichi relitti di organismi unicellulari

Lo spliceosoma
Per produrre una molecola funzionale di mRNA da un pre-mRNA che contiene introni, gli eucarioti devono rimuoverli
e riunire i restanti segmenti di RNA, gli esoni
Il processo è chiamato Splicing dell’RNA
E’ catalizzato da un complesso di RNA-proteine dette spliceosoma, assemblato a partire da un gruppo di piccoli complessi
ribonucleoproteici
Durante lo splicing dell’RNA, un gruppo di questi si lega in modo sequenziale ad un introne, formando lo
spliceosoma
1- il pre-mRNA è tagliato al sito di splicing al 5’
2- l’estremità 5’ dell’introne appena rilasciata crea una struttura a cappio
3- il sito di splicing al 3’ è tagliato
4- le due estremità dell’esone vengono unite
5- l’introne viene rilasciato e successivamente degradato
Alcuni introni sono self-splicing, hanno un gruppo di geni in grado di intraprendere autonomamente il processo
Esistono due famiglie: - gruppo I (genoma mitocondriale dei funghi)
- gruppo II (genoma mitocondriale eucarioti monocellulari)
Le molecole di mRNA hanno un’emivita breve
TRADUZIONE

Componenti
La traduzione si avvale di cinque componenti:
1- Ribosomi
Organuli privi di nucleo adibiti alla sintesi proteica
Si trovano sia nei procarioti sia negli eucarioti, ma differiscono per: - dimensioni (70S, 80S*)
- numero (migliaia, milioni)
- localizzazione (citoplasma, citoplasma e REr)
- proteine sintetizzate
Struttura: - subunità ribosomiale maggiore (60S)*
- subunità ribosomiale minore (40S)*
Sono sintetizzate ed assemblate separatamente, ma si associato per la sintesi proteica
*Il coefficiente di sedimentazione dipende da dimensione e forma e non è linearmente correlabile al peso molecolare
Quattro siti sono importanti per la sintesi: - Un sito di legame per l’mRNA
- Tre siti di legame per il tRNA
Sito A (amminoacidico) = si lega tRNA con il suo amminoacido
Sito P (peptidico) = risiede il tRNA che porta legata la catena polipeptidic
Sito E (uscita) = dal quale i tRNA lasciano il ribosoma
2- Molecole di tRNA
Famiglia di molecole adattatrici con il ruolo di organizzare gli amminoacidi nei codoni
Intermediari tra amminoacidi ed mRNA, posseggono due tipi specificità:
Ogni tRNA riconosce uno o più codoni dell’mRNA che specificano quel particolare amminoacido e vi si lega estericamente
Il tRNA viene detto “amminoacil-tRNA”: il tRNA è carico e l’amminoacido attivato
I tRNA riconoscono i codoni dell’mRNA in quanto dotati di anticodoni per appaiamento delle basi complementari
Poiché il codice genetico usa 61 codoni diversi per specificare gli amminoacidi, ci si dovrebbe aspettare che nella sintesi proteica
siano coinvolti 61 molecole di tRNA
Poiché molti tRNA riconoscono più di un codone, il numero richiesto è molto inferiore a 61
Questo perché mRNA e tRNA i affacciano sul ribosoma in modo da consentire flessibilità di appaiamento
Tale flessibilità di appaiamento è detta “ipotesi del vacillamento”, permette appaiamenti inattesi
tra le basi e spiega perché siano richiesti meno di 61 amminoacidi
3- Amminoacil-tRNA sintetasi
Prima che una molecola di tRNA possa portare il suo appropriato amminoacido al ribosoma, questo deve essere legato al tRNA
Gli enzimi responsabili del legame sono detti amminoacil-tRNA sintetasi
Sono venti diversi, ciascuno per i 20 amminoacidi utilizzati per la sintesi proteica
Quando per un determinato amminoacido esiste più di un tRNA l’amminoacil-tRNA sintetasi li riconosce tutti
Riesce in questo per differenze della sequenza di basi dei diversi tRNA
Le amminoacil-tRNA sint riconoscono i nucleotidi localizzati in almeno due regioni del tRNA
Catalizzano l’unione di un amminoacido al corrispondente tRNA mediante un legame esterico con idrolisi di ATP
4- RNA messaggero
Lo specifico mRNA che si lega ad un dato ribosoma determina quale polipeptide quel ribosoma sintetizzerà
Struttura: - “cuore” di nucleotidi che codifica per un polipeptide
- estremità con sequenze che non vengono tradotte
La sequenza non tradotta al 5’ precede il codone di inizio (AUG)
La sequenza non tradotta al 3’ segue il codone di stop (UAG, UAA, UGA)
Possono essere più o meno lunghe
Ciascuna molecola di mRNA codifica per un unico polipeptide (negli eucarioti, i procarioti hanno eccezioni)
5- Fattori proteici
In aggiunta alle ammioacil-tRNA sintetasi ed alle componenti proteiche del ribosoma, la traduzione richiede un gran numero di
componenti proteici, che prendono il generico nome di “fattori proteici”
Svolgono funzioni all’inizio della traduzione o per l’allungamento, per esempio
Meccanismo
Durante la traduzione gli amminoacidi sono aggiunti alla catena polipeptidica in allungamento a partire dall’estremità N verso la C-terminale
Si tratta di un processo a più fasi sequenziali

– Fase di inizio
- Procarioti
Tre fattori di inizio legano la subunità ribosomiale minore (30S) con un GTP
Il tRNA che porta il primo amminoacido si lega alla subunità minore (30S) insieme all’mRNA
Il complesso di inizio 30S è unito (idrolisi ATP) ad una subunità 50S libera, originando il complesso di inizio 70S
- Eucarioti
Differenze: gruppo diverso di fattori di inizio, una modalità di assemblaggio del complesso, RNA iniziatore
Le modalità di assemblaggio, tuttavia, presentano differenze principalmente riguardo le tempistiche
– Allungamento della catena
Implica la ripetizione di un passaggio a tre fasi:
1- Legame dell’amminoacil-tRNA
All’inizio della fase di allungamento, il codone di inizio dell’mRNA è posizionato a livello del sito P del ribosoma
il secondo codone è posizionato sul sito A dello stesso
L’allungamento inizia quando un amminoacil-tRNA si lega al sito A del ribosoma
Ciò richiede due fattori di allungamento proteici ed è guidato dall’idrolisi di GTP
Il complesso che si forma promuove il legame di tutti gli amminoacil-tRNA al ribosoma
Il tRNA iniziatore è l’unica eccezione
Appena l’amminoacil-tRNA è trasferito sul ribosoma, il GTP è idrolizzato ed il complesso rilasciato
Sistemi di correzioni degli errori si assicurano che l’ amminoacil-tRNA sia corretto
2- Formazione del legame peptidico
Dopo che il giusto amminoacil-tRNA si è legato al sito A si forma un legame peptidico
Tra gruppo amminico del sito A e gruppo carbossilico con il quale l’amminoacido è legato al sito P
La formazione di questo legame causa il trasferimento della catena polipeptidica in allungamento
Dal tRNA nel sito P essa passa a quello localizzato nel sito A
Questo è il solo passaggio della sintesi che non richiede fattori proteici/apporto energia
Essa è fornita dalla rottura del legame ad alta energia dell’amminoacido
3- Traslocazione
Dopo la formazione del legame peptidico, il sito P contiene un tRNA scarico e il sito A un peptidil-tRNA
L’mRNA avanza di tre nucleotidi, portando il successivo codone nella corretta posizione per la traduzione
Il peptidil-tRNA si sposta dal sito A al sito P, mentre il tRNA scarico passa dal sito P al sito E
– Terminazione
Il processo di allungamento continua ciclicamente, leggendono codone dopo codone
Si ferma solo quando incontra uno dei tre possibili codoni di stop (UAG, UGA, UAA) al sito A del ribosoma
Essi vengono riconosciuti come fattori di rilascio
Inducono il rilascio dal peptidil-tRNA attraverso un taglio idrolitico
Il polipeptide viene trasferito su una molecola di acqua invece che su un amminoacido attivato

Il ripiegamento può essere mediato da chaperone molecolari


Essi si legano alle catene polipepticdiche durante le fasi iniziali del ripiegamento della proteina
Prevengono possibili interazioni con altri polipeptidi prima che la struttura tridimensionale non è compiuta
I più famosi sono HSP60 ed HPS70.

Mutazioni
Puntiformi
Sostituzione di basi, determinano uno scambio di un nucleotide con un altro
- Silenti: quando la mutazione determina un codone diverso ma che codifica per lo stesso amminoacido
- Missenso: quando un codone viene sostituito con uno che codifica per un altro amminoacido
- Nonsenso: quando la mutazione determina la formazione di un codone di stop all'interno della sequenza
Frame-shift
Determinano l'aggiunta (inserzione) o l'eliminazione (delezione) di un nucleotide
TEORIA UNIFICANTE DEL CANCRO
Oncogeni
Mutazioni che comportano gain of function (sono dominanti)

Sono oncogeni tutte le proteine e i fattori anti-apoptotici


Fase decisionale - Fattori di crescita
- Molecole coinvolte nella trasduzione del segnale mitotico
Fase esecutiva - Fattori di trascrizione
- Cicline

Oncosoppressori
Mutazioni che comportano loss of function (sono recessive)
La mutazione di loss of function può essere dominante per un effetto quantitativo del prodotto genico

Sono oncosoppressori tutte le proteine e i fattori pro-apoptotici


Fase decisionale - Fattori di inibizione della crescita
- Proteine di adesione
- Integrine
Fase esecutiva - Proteine Rb
- Proteina p53

Possibilità
- Gain of function di un oncogene
Le mutazioni che determinano l’insorgenza di un tumore sono quelle che attivano un oncogene
La mutazione comporta un guadagno di funzione - aumento quantitative
- attivazione perenne
- sintesi in momenti inopportuni
- Loss of function di un oncosoppressore
I tumori ereditari dipendono dalla mutazione di uno degli alleli di un gene oncosoppressore
- seguita dall’inattivazione, per una seconda mutazione, dell’altro allele (tumori ereditari “specifici”)
- seguita dalla mutazione di un gene coinvolto nella riparazione del DNA (tumori ereditari “aspecifici”)
- Virus oncògeni (Retrovirus)
Virus Lenti
Inseriscono il loro promotore nel DNA cellulare in modo tale da controllare positivamente un oncogene
Virus Rapidi
Si inseriscono direttamente nel DNA cellulare un oncogéne cellulare difettivo da essi trasportato

Senescenza
mTOR è una chinasi
Viene attivata da - elevati livelli di energia
- insulina
- fattori di crescita
La sua attivazione favorisce - la sintesi proteica
- l’accrescimento cellulare
- la proliferazione
inibisce - risposte cataboliche
in particolare autofagia

La continua stimolazione di mTOR in condizioni in cui la cellula è soggetta ad arresto della proliferazione porta alla senescenza.
Infatti, la sua attività contrasta con quella di p53, che svolge un ruolo fondamentale anche nell’indirizzare la cellula verso la
senescenza o il semplice arresto del ciclo cellulare