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B La fermentazione

Nella fermentazione non si ha la completa demolizione del composto di partenza,


che viene solo parzialmente fermentato in uno o più prodotti finali per lo più ancora
organici, che mantengono ancora parte dell’energia del composto iniziale. Pertanto
la resa energetica della fermentazione non è paragonabile a quella dei processi
respiratori e l’ATP viene generato soltanto per trasferimento di un gruppo fosfato
legato ad un intermedio del processo con un legame ad alto contenuto energetico
all’ADP (fosforilazione a livello di substrato)

Rese teoriche in ATP per molecola di glucosio

RESPIRAZIONE: 36-38 molecole teoriche di ATP (2 da glicolisi, 2 dal ciclo di Krebs


(GTP) e 32-34 dalla catena di trasporto degli elettroni)
FERMENTAZIONE ALCOLICA e LATTICA: 2 ATP
FERMENTAZIONE dei BIFIDOBATTERI: 2,5 ATP

Il metabolismo respiratorio è circa 15 volte più efficiente del metabolismo fermentativo


Il metabolismo fermentativo, però, è molto rapido!
1

B La fermentazione
La glicolisi è la principale via che precede numerose fermentazioni. Per la maggior parte dei
processi fermentativi la stessa glicolisi è anche la via che frutta alle cellule l’energia, scopo
del processo metabolico (2 moli di ATP per mole di glucosio fermentato) attraverso le già citate
reazioni di fosforilazione a livello di substrato. Le tappe successive della fermentazione hanno
invece lo scopo di consentire la riossidazione delle due moli di NADH, prodotte nell’ossidazione
della 3-fosfo gliceraldeide ad acido 1,3-difosfoglicerico, in quanto nei microrganismi anaerobi la
catena di trasporto degli elettroni è incompleta. Pertanto l’equilibrio ossido-riduttivo si ristabilisce
mediante riossidazione del NADH a spese di un intermedio del processo a valle dell’acido piruvico.
In qualche caso, in questo tratto della fermentazione si ha ulteriore produzione di ATP, che porta la
resa energetica della fermentazione a valori comunque di ben poco superiori a 2

Quasi sempre le varie vie fermentative sono caratteristiche di ben definiti gruppi microbici,
i quali dimostrano un’elevata specificità di processo 2
B1 La fermentazione omolattica

È operata dai batteri omolattici


od omofermentanti, anaerobi
obbligati ossigeno-tolleranti
appartenenti ai generi Gram
positivi Streptococcus,
Pediococcus, Lactobacillus…

In questa fermentazione è lo
stesso acido piruvico di origine
glicolitica a fungere da
accettore di elettroni per la
riossidazione del NADH,
riducendosi così ad acido
lattico

lattato deidrogenasi

da ricordare!

B2 La fermentazione alcolica
È caratteristicaFERMENTAZIONE
dei lieviti, che sono eumiceti unicellulari anaerobi facoltativi di cui è
ALCOOLICA
ben noto il genere Saccharomyces. L’enzima-chiave di questa fermentazione è la
piruvato decarbossilasi glucosio

2ATP

2 gliceraldeide-3- P
2 etanolo

NAD+

NADH
2 acetaldeide da ricordare!
2 CO2 NAD +

NADH
2 piruvato

4ATP
Avviene anche nel già
Equazione generale:
citato batterio Zymomonas
glucosio 2 etanolo + 2 CO2

Resa energetica = 2 ATP


4
B3 La fermentazione acido-mista
Gli enterobatteri (cioè i membri della famiglia
glucosio
Enterobacteriaceae) come Escherichia,
2NADH Salmonella, Shigella e i generi Proteus, Vibrio e
2ATP Photobacterium sono microrganismi Gram-
NADH CO2
succinato
negativi anaerobi facoltativi che in anaerobiosi
ossaloacetato fosfoenolpiruvato (PEP)
fermentano il glucosio secondo questa via. I
diversi prodotti finali caratteristici di questo
2ATP provesso sono acidi organici a basso peso
NADH
piruvato lattato
molecolare quali acido formico, acido acetico,
CoA acido lattico e acido succinico e piccole quantità
di etanolo (in E. coli e Proteus l’acido formico è
NADH scisso in CO2 e H2 dalla formico idrogenoliasi,
acetaldeide acetil-CoA formiato un enzima la cui presenza assume una
NADH
rilevante importanza tassonomica e
etanolo diagnostica)

acetil- P
I rapporti percentuali di questi prodotti variano
CO2 H2
nei diversi microrganismi e a seconda delle
condizioni colturali e ambientali, sempre nel
ATP formico rispetto dell’equilibrio ossido-riduttivo del
idrogenoliasi
processo
acetato
5

FERMENTAZIONE 2.3-BUTILENGLICOL
B4 La fermentazione 2,3-butilenglicolica
glucosio
Tipica di altre Enterobacteriaceae aventi come
2 NADH
habitat il suolo o le acque (Enterobacter
NADH 2 ATP
aerogenes e i generi Erwinia, e Serratia, patogeni
lattato piruvato delle piante). Il prodotto principale è il 2,3-
NADH butilenglicol che si forma dalla condensazione di
formiato
acetaldeide acetil-CoA due molecole di piruvato con la liberazione di due
NADH
molecole di CO2. In minore quantità si producono
4
etanolo anche gli acidi della precedente fermentazione
accanto a notevoli quantità di etanolo per il
CO2 H2
mantenimento dell’equilibrio ossido-riduttivo.
CO2

α-acetolattato
L’uso di questa via causa il decremento della
formazione di acidi (il butilenglicole è neutro) e la
CO2 formazione dell’intermedio ACETOINO. Coloro
che si occupano di analisi microbiologica delle
acetoino
acetoina acque possono distinguere i coliformi fecali
NADH (fermentazione acidomista) dai non fecali
(fermentazione butileglicolica tipica dei generi
come Klebsiella) andando a svelare la presenza
2,32,3-butilenglicol
butilenglicole di acetoino ed un pH più alto
o butandiolo 6
B5 La fermentazione propionica
Il glucosio viene fermentato ad
acido acetico, CO2 ed acido
propionico dal genere
acido assalacetico Propionibacterium attraverso una
via complessa detta del
acido metilmalonilCoA. Veillonella, il cui
malico
habitat è il rumine dei bovini,
compie la stessa fermentazione
acido lattico
partendo dall’acido lattico. Altri
microrganismi producono acido
propionico da acido lattico
attraverso una via diversa
N.B.: La resa energetica, tra le
acido propionico
più elevate, include anche una
mole di ATP prodotto per
fosforilazione ossidativa (cioè
attraverso la ATP sintasi) tramite
una breve catena di trasporto degli
elettroni nella riduzione del
fumarato a succinato (respirazione
del fumarato: è un tipo di
respirazione anaerobica)

Resa energetica = 5 ATP / 1,5 glucosio o 2 ATP / 3 ac. lattico 7

FERMENTAZIONE BUTIRRICA
B6 La fermentazione butirrica
CH3 - CH2 - CH2 - COOH

butirrato

ATP
Si ritrova in Clostridium, sporigeno
anaerobio obbligato sensibile
all’ossigeno, in grado di fermentare il
CH3 - CH2 - CH2 - CO - O - P
butirril fosfato
glucosio glucosio. Caratteristica di questa via è la
Ferredossina
CoA produzione di CO2 e H2 nella reazione
Pi
2NADH del coenzima A (CoASH) con il piruvato.
2ATP
CH3 - CH2 - CH2 - CO - CoA Il principale prodotto finale è l’acido
butirril-CoA 2CH3 - CO - COOH
2H2 butirrico, la cui formazione consente il
2FdOX 2CO2
Ferredossina mantenimento dell’equilibrio ossido-
NADH 2FdRED
idrogenasi 2CoA
riduttivo
CH3 - CH CH - CO - CoA 2H+
crotonil-CoA 2CH3 - CO - CoA

CoA
Alcuni Clostridi producono in particolari
H2O
condizioni butanolo e acetone, che sono
CH3 - CH - CH2 - CO - CoA CH3 - CO - CH2 - CO - CoA di interesse industriale
OH acetoacetil-CoA
L (+) -β-idrossibutirril-CoA

N.B.: la ferredossina è una ferro-zolfo proteina


NADH
che media il trasferimento di elettroni in diverse
Equazione generale: glucosio butirrato + 2CO2 + 2H2 reazioni metaboliche
Resa: 3 ATP
8
B7 La fermentazione omoacetica
In alcuni clostridi, il glucosio (1 mole) viene stechiometricamente fermentato a 3 moli
di acetato, una delle quali deriva dalla riduzione delle 2 moli di CO2, che provengono
dalla scissione del piruvato ad acetil-CoA

Non va confusa con la produzione di acido acetico da parte di Acetobacter


e Gluconobaceter, i quali, per produrre acido acetico, non operano una
fermentazione, ma ossidano l’etanolo ad acido acetico per recuperare
potere riducente (NADH + H+) 9

4 B8 Il metabolismo fermentativo dei bifidobatteri

Ha scarsa attività
nei bifidobatteri
Aldolasi
È assente nei
bifidobatteri
Il fruttosio 1,6 bisfosfato
funge da induttore della
lattato deidrogenasi

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Fruttosio-6-P 4 B8
Pi H2O

F6PPK (xfp)
D-eritrosio-4-P
Acetil-P
Diidrossiaceton
ADP transferasi
ATP Via fermetativa di Bifidobacterium
Fruttosio-6-P
1 Acetato o
via della Fruttosio-6-P Fosfochetolasi
D-gliceraldeide-3-P D-sedoeptulosio-7-P

D-xilulosio-5P

D-ribosio-5-P

D-ribulosio-5-P
2
D-xilulosio-5-P
Pi H2O
F6PPK (xfp)
2 Acetil-P

ADP ATP Formiato


2 D-gliceraldeide-3-P
Etanolo
2 Acetate
ACETATO:LATTATO = 3:2 11

Legenda per la descrizione tassonomica


p__ = phylum, cioè divisione

c__ = classe

o__ = ordine

f__ = famiglia

g__ = genere

Per esempio, per descrivere Escherichia coli, scriveremo:


p__Proteobacteria;c__Gammaproteobacteria;o__Enterobacteriales;
f__Enterobacteriaceae;g__Escherichia

…oppure, per descrivere Bacillus licheniformis:

p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Bacillales;f__Bacillaceae;g__Bacillus
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I BATTERI LATTICI
Sono batteri Gram POSITIVI, immobili, chemioeterotrofi a forma di bastoncino o cocco
Il loro nome deriva dal fatto che formano ACIDO LATTICO come principale (e talvolta unico)
prodotto finale del loro metabolismo energetico
Hanno un metabolismo fermentativo; sono tutti anaerobi con variabile capacità di
tollerare l’ossigeno (con rare eccezioni, legate alla presenza di EME esogeno)

Sono incapaci di produrre ATP attraverso un metabolismo aerobio, a causa dell’incapacità di


sintetizzare citocromi o altri enzimi contenenti il gruppo eme. A causa dell’impossibilità di
produrre proteine eminiche, sono CATALASI NEGATIVI e quindi non possono operare la
decomposizione dell’H2O2 in H2O e O2

Una caratteristica propria dei batteri lattici è la loro elevata ACIDO-RESISTENZA, la quale
consente loro di crescere fino a quando il pH raggiunge valori inferiori a 5. Questa
caratteristica fisiologica è di grande importanza ecologica, perché permette loro di vincere la
competizione di altri batteri in ambienti ricchi di materia organica. Come risultato della loro
specializzazione fisiologica, i batteri lattici sono confinati in pochi e caratteristici ambienti
naturali: alcuni vivono in associazione con le piante e crescono a spese delle sostanze nutritive
liberate in seguito alla morte e alla decomposizione dei tessuti vegetali; si trovano quindi in
alimenti e bevande preparate con materiale vegetale come sottaceti, crauti, foraggi insilati, vino
e birra. Altri fanno parte del normale microbiota degli animali (bocca, intestino, mucosa
vaginale). Infine, alcuni sono spesso associati al latte (per es. Streptococcus thermophilus).
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Alcuni generi di batteri lattici


Oenococcus Pediococcus
Streptococcus

Lactococcus Lactobacillus

Enterococcus Carnobacterium Leuconostoc

Immagini al SEM

p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Lactobacillus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Lactobacillaceae;g__Pediococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Lactococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Streptococcaceae;g__Streptococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Leuconostocaceae;g__Oenococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Leuconostocaceae;g__Leuconostoc
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__ Enterococcaceae;g__Enterococcus
p__Firmicutes;c__Bacilli;o__Lactobacillales;f__Carnobacteriaceae;g__Carnobacterium 14
I BATTERI LATTICI
Sulla base dei loro prodotti di fermentazione, sono divisi in tre sottogruppi metabolici
1 – OMOFERMENTANTI: degradano il glucosio via glicolisi e non sono in grado di
utilizzare i pentosi. Il piruvato viene poi ridotto ad acido lattico, unico prodotto della
loro fermentazione
2 – ETEROFERMENTANTI OBBLIGATI: non possono degradare il glucosio via
glicolisi in quanto non possiedono l’enzima FRUTTOSIO 1,6 DIFOSFATO
ALDOLASI che catalizza la scissione del fruttosio 1,6 difosfato in gliceraldeide-3-
fosfato e diidrossi-acetone-fosfato. Per tale ragione essi fermentano il glucosio
attraverso la via dei pentoso fosfati, ottenendo tre prodotti finali in rapporto
equimolare: ACIDO LATTICO, ETANOLO e CO2. Possono utilizzare anche i pentosi,
nel qual caso senza produzione di CO2. Possono produrre anche piccole quantità di
acido acetico
3 – ETEROFERMENTANTI FACOLTATIVI: in presenza di ESOSI essi li fermentano
attraverso la glicolisi con produzione di solo ACIDO LATTICO, comportandosi perciò
come omofermentanti. In presenza di PENTOSI, effettuano l’ossidazione di tali
composti attraverso la via dei pentoso fosfati, senza produzione di CO2

L’acido lattico prodotto può essere in configurazione L, D oppure in miscela


racemica DL
15

Oenococcus

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Omofermentanti Eterofermentanti Esosi
Zuccheri facoltativi
Eterofermentanti
Zuccheri pentosi
esosi esosi obbligati
X

Pentosi

in quantità ridotte

( )

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TERRENI COLTURALI PER BATTERI LATTICI


Terreno MRS a pH 6,2-7: non selettivo, adatto per il mantenimento dei
lattobacilli

Terreno SL: selettivo per l’isolamento dei lattobacilli (tripticase,


estratto di lievito, citrato, glucosio, arabinosio, saccarosio, acetato, pH
finale 5,4)

Terreno ATB: adatto per l’isolamento di Oenococcus oeni (peptone,


estratto di lievito, succo di pomodoro 25 %, pH finale 4,8)

Poiché i batteri lattici sono anaerobi (sebbene ossigeno tolleranti), i migliori


risultati di crescita si ottengono incubando le piastre di isolamento in giare di
anaerobiosi (Gas-Pak)

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I BATTERI ACETICI
Appartengono alla famiglia delle Acetobacteraceae
p__Proteobacteria;c__Alphaproteobacteria;o__Rhodobacterales;f__Acetobacteraceae

Sono bastoncini Gram NEGATIVI, aerobi chemio-eterotrofi, catalasi positivi,


termolabili e psicrotrofi
Sono marcatamente acidofili (crescono fino a pH 4, a concentrazioni di ac. acetico fino a 0,4 M)
Il pH ottimale è compreso tra 5,4 e 6,3. Acetobacter pasteurianus cresce anche a pH 3 se
l’etanolo è inferiore all’8%
Si localizzano soprattutto sulla superficie di piante, in particolare fiori e frutti
Sono microrganismi mesofili che crescono con temperatura ottimale intorno a 30 °C; alcuni
ceppi si riescono a sviluppare anche a 5 °C, altri sono blandamente termotolleranti (37-40 °C)

Tollerano basse concentrazioni di acido acetico; tollerano bene l’etanolo e molti ceppi
crescono in un range compreso tra 8 e 15 %. La concentrazione tollerata dipende da
pH, temperatura e concertazione di O2
I tre generi più noti:
Acetobacter: A. xylinus, A. aceti, A. pasteurianus, A. cerevisiae, A. pomorum

Gluconoacetobacter: G. xylinus, G. diazotrophicus, G. intermedius, G. liquefaciens

Gluconobacter: G. oxydans, G. frateurii


Altri generi e specie: Acidomonas methanolica, Asaia spp., Kozakia baliensis,
Saccharibacter spp., Swaminathania spp., Frateuria spp.
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Le specie più importanti nella produzione industriale dell’aceto sono:


- Acetobacter aceti subsp. orleanensis
- Acetobacter aceti subsp. xylinum (madre dell’aceto)
- Acetobacter pasteurianus subsp. lovaniensis
- Acetobacter pasteurianus subsp. ascendens
- Acetobacter pasteurianus subsp. paradoxus

In particolare, i membri del genere Acetobacter sono particolarmente importati da un punto di


vista industriale (sia positivamente che negativamente) per diversi motivi, tra i quali:
1. sono usati per la produzione dell’aceto (usati per convertire intenzionalmente l’etanolo del
vino o di altri prodotti alcolici in acido acetico)
2. possono deteriorare il vino producendo quantità eccessive di acido acetico o etil-acetato
(entrambi rendono sgradevole il vino). La crescita di Acetobacter nel vino può essere inibita
attraverso la completa eliminazione dell’ossigeno durante la conservazione del vino oppure
con l’aggiunta di moderate quantità di SO2
3. sono usati per acidificare intenzionalmente alcune birre
aventi periodi di maturazione lunghi (per esempio per
la produzione della birra tradizionale Flemish Sour Ale)

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Peculiarità metaboliche
I batteri acetici sono aerobi obbligati aventi metabolismo aerobio (respirazione
aerobica)

In particolare, i batteri acetici sono caratterizzati da metabolismo aerobio con


ossidazione incompleta dei substrati organici

Utilizzano diverse fonti di carbonio, dagli zuccheri agli aminoacidi. Preferiscono


etanolo, glicerolo, lattato, mannitolo, sorbitolo, fruttosio, glucosio
Come fonte di azoto molti ceppi utilizzano NH4+

Gli zuccheri sono ossidati esclusivamente attraverso la via del pentosio fosfato

L’acetato deriva dalla ossidazione parziale della materia organica e non da un vero
processo di fermentazione
Il PIRUVATO è trasformato attraverso una decarbossilazione non ossidativa ad
acetaldeide (la decarbossilazione ossidativa del piruvato ad Acetil-CoA e CO2,
tipicamente presente nel processo di respirazione, non avviene in quanto il
COMPLESSO DELLA PIRUVATO DEIDROGENASI nei batteri acetici è inattivo)

FONDAMENTALE!!! DA RICORDARE!!! 21

I BATTERI ACETICI Glucosio

tutto il NADH generato in queste reazioni via del pentosio fosfato


di ossidazione è destinato alla catena di
trasporto degli elettroni, per creare il
pentosi-P
gradiente di H+ che permette la sintesi
dell’ATP interconversione non ossidativa

triosi-P
NAD+ NADH+H+
ultime tappe della glicolisi
ACIDO LATTICO lattato deidrogenasi
Ac. piruvico

CO2 decarbossilazione non ossidativa


NAD+ NADH+H+

ETANOLO Acetaldeide
alcol deidrogenasi
NAD+
aldeide deidrogenasi
NADH+H+

acetil-CoA ligasi Ac. acetico


acetil-CoA sintetasi In Acetobacter
Gluconobacter Acetil-CoA il ciclo di Krebs è
non ha un ciclo di Krebs inibito solo a
funzionale e non può concentrazioni
dunque ossidare l’acetato Ciclo dei CO2 elevate di etanolo
TCA
CO2 22
I BATTERI ACETICI: la metabolizzazione dell’etanolo
Sono capaci di crescere utilizzando etanolo come unica fonte di carbonio ed
energia producendo acido acetico
L’etanolo, infatti, viene ossidato ad acetato, ed il potere riducente ottenuto si trasforma
in energia per la cellula (cioè in ATP) a livello della catena di trasporto degli elettroni

pirrolochinolin-chinone, associato
CH 3CH 2OH
all’aldeide deidrogenasi
biosintesi
NAD +, PQQ

catena respiratoria

NADH, PQQH 2
ATP

CH 3COOH CH 3COSCoA KREBS


acetil-CoA sintetasi
detta anche
rilasciato extracellularmente acetil-CoA ligasi X

Il blocco del ciclo di Krebs è causato da:


→ presenza di etanolo in Acetobacter → carenze genetiche in Gluconobacter
23

I BATTERI ACETICI:
la metabolizzazione dell’etanolo

La produzione di acido acetico a partire da


etanolo da parte dei batteri acetici NON è
una fermentazione, ma il risultato di una
semplice ossidazione parziale dell’etanolo,
al fine di recuperare potere riducente

Solo i membri del genere


Acetobacter possono ossidare
completamente l’acetato a CO2,
se le concentrazioni di etanolo
non sono troppo alte

24
Come distinguere Acetobacter da Gluconobacter in laboratorio
Si devono preparare piastre contenenti il seguente terreno di coltura agarizzato:

Estratto di lievito 50 g/l


CaCO3 20 g/l rende il terreno di coltura opaco

Etanolo 7% è la fonte di carbonio ed energia per il batterio

Agar 20 g/l
Dopo semina e incubazione a 28/30 °C per 2-3 giorni, parte dell’etanolo sarà convertito dai batteri
acetici in acido acetico, che abbasserà il pH solubilizzando il carbonato di calcio: le colonie
appariranno quindi con un alone di chiarificazione intorno a loro. Prolungando l’incubazione la
concentrazione di etanolo diminuirà fino a permettere agli Acetobacter di ossidare completamente
l’acido acetico prodotto (poiché il ciclo di Krebs è sbloccato).
Dopo altri 2-3 di incubazione, quindi, il
Acetobacter Gluconobacter
pH sarà risalito, con conseguente ri-
precipitazione del carbonato di calcio.
colonia batterica
Dopo un totale di 5-6 giorni di
incubazione, quindi, le colonie di2-3 giorni di alone di chiarificazione
Gluconobacter avranno un alone diincubazione
chiarificazione, mentre quelle di
Acetobacter no, poiché il carbonato di5-6 giorni di
calcio riprecipitando avrà reso diincubazione
nuovo opaco il terreno (sì vedrà un
alone opaco di precipitazione). alone di precipitazione
25

La fermentazione malolattica
(o meglio, conversione malolattica)

NON è una fermentazione nel senso


metabolicamente corretto del termine

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CENNI DI ANABOLISMO
L'anabolismo comprende tutto
l'insieme dei processi di sintesi
o bioformazione delle molecole
organiche (biomolecole) più
complesse da quelle più
semplici o dalle sostanze
nutritive. Questi processi
richiedono energia, al contrario
del catabolismo

Sebbene l'anabolismo e il
catabolismo siano due processi
contrari, funzionano in maniera
coordinata ed interdipendente

Le vie cataboliche forniscono gli


intermedi biochimici utili
all’anabolismo per operare la
biosintesi delle macromolecole

27

I PRECURSORI BIOSINTETICI DEGLI AMMINOACIDI

28
SINTESI DELLE STRUTTURE CELLULARI A PARTIRE DA GLUCOSIO
Ulteriori reazioni …che interagiscono per
I precursori metabolici formati …i monomeri o i polimerizzano i monomeri produrre le strutture che
dalla glicolisi, dal ciclo dei TCA mattoni di tutte le per formare costituiscono la cellula
e dalle vie correlate entrano componenti cellulari. macromolecole… batterica
nelle vie biosintetiche che
producono…

PROTOTROFIA
e CAPACITÀ DI SINTETIZZARE... un
AUXOTROFIA amminoacido... una base azotata... etc…

INCAPACITA’ DI SINTETIZZARE UN ... FABBISOGNO COLTURALE,


amminoacido ... una base azotata ... etc... NUTRIZIONALE
29

LA BIOSINTESI DELLE BASI AZOTATE

30