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Instituto Politécnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biológicas


Laboratorio de Genética Microbiana
Q.B.P.

Práctica 1: Aislamiento y caracterización del DNA

Presentan:
Hernández Arenas Aranza Gisell
Huerta Reséndiz Daniel Alejandro
García Mondragón José Luis
5QV2 Equipo 6

Profesores:
Verónica Pérez Enríquez
Español Español Francisco Javier

03 /09/18
 Introducción.

LISIS CELULAR

Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la
pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que
los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o
agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como
inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones
de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg2+ e
impide el funcionamiento de las DNAsas.

PURIFICACIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS.

Los métodos de purificación presentan una gran variabilidad y están desarrollados


en función de las propiedades físico-químicas de las moléculas de ADN y ARN.

En esta etapa se separa el ADN de las proteínas mediante solventes orgánicos y


ciclos de centrifugación. Se utiliza la fuerte tendencia hidrofílica de los grupos
fosfato para separarlos en medios acuosos, mientras que las proteínas y los
lípidos se separan en solventes orgánicos.

La fase acuosa y la orgánica se separan por centrifugación lo que permite aislar al


ADN. Los solventes que se usan frecuentemente son el fenol, el cloroformo y el
alcohol isoamílico. Estos reactivos contaminan fácilmente el ADN, por lo que se
debe evitar acarrearlos en el proceso de purificación.

Este método permite obtener un alto rendimiento pero es frecuente que restos de
solventes orgánicos contaminen la muestra. Además, el uso de estas sustancias
tóxicas para la salud hace necesario que todo el proceso se lleve a cabo siguiendo
las buenas practicas del laboratorio.

PRECIPITACIÓN DEL ADN.

Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de
sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas
repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo
haciéndolo insoluble.

Un paso de centrifugación permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo


mientras que el etanol es desechado. Los restos de etanol se eliminan con un
lavado con etanol al 70% y el remanente se elimina por evaporación.
REDISOLUCIÓN DEL ADN

Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para
permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se
utiliza una solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a
10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material.

 Objetivos.
a) Aislar DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de un cultivo
bacteriano.
b) Establecer el espectro de absorción del DNA aislado
c) Determinar la influencia de algunas características de la secuencia del DNA
sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático
DNAMAN.

 Resultados.
Tabla 1. Absorbancia, pureza y concentración de DNA extraído de E. coli W3350.

Equipo A260 A280 Pureza C=(A260)/(Ae*b) 1unidad


A260=50μg/ml DNA
1 6.790 3.361 2 301.7 339.5
2 13.031 6.307 2 579.1 651.5
3 8.433 4.198 2 374.8 421.6
4 1.725 0.883 1.9 76.6 86.2
5 6.352 3.275 1.9 282.3 317.6
6 3.803 2.001 1.9 169 190.15

Espectro de Absorción de DNA de E. Coli W3350 (Equipo 4)


2
1.8
1.6
1.4
Absorbancia

1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Longitud de Onda (nm)

Gráfica 1.Espectro e absorción del DNA extraído de E. coli W3350 elaborado con los datos obtenidos por el
equipo 4
Espectro de Absorción de DNA de E. Coli W3350 (Equipo 5)
7

5
Absorbancia

0
220 230 240 250 260 270 280 290 300 3120 320
Longitud de Onda (nm)

Espectro de Absorcionde DNA de E.coli W3350 (Equipo 6)


9
8
7
6
Absorbancia

5
4
3
2
1
0
220 210 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Longtud de onda (nm)

Gráfica 2 Espectro e absorción del DNA extraído de E. coli W3350 elaborado con los datos obtenidos por el equipo 6

Longitud de onda 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Absorbancia 0.138 7.782 5.231 4.479 3.803 3.083 2.001 0.917 0.379 0.208 0.138
Tabla 2. Absorbancias obtenidas de la disolución de DNA del equipo 6 en diez longitudes de onda distintas
Ilustración 1. espectros de absorción de cantidades equimolares de ácido poliadenílico y ácido
poliuridílico. la curva superior se refiere a los mononucleótidos obtenidos por hidrólisis alcalina.

Influencia de diferentes parámetros sobre la desnaturalizacion de


oligodesoxirribonucleótidos. Las determinaciones se efectuaron
empleando el programa DNAMAN

A. Diseñar tres oligonucleotidos de 40 residuos con diferentes relaciones de GC/AT.


Análisis de los oligos: Se realizaron tres oligonucleotidos de 40 residuos cada uno pero
con diferentes relaciones de GC/AT, se pudo observar que la relacion de GC/AT influye
directamente sobre la Tm de cada oligonucleótido, se aprecia que esta aumenta cuando
hay una mayor cantidad de GC en la cadena del oligonucleotido, esto debido a que GC
presentan tres enlaces por puente de hidrógeno entre si, esto le confiere una mayor
estabilidad a la cadena, y por lo tanto se necesita mayor energía para desnaturalizarla, lo
cual se ve reflejada en la Tm.

Conclusión: A mayor cantidad de GC que presente un oligonucleotido, mayor sera su Tm.

B. Influencia de la variación en la secuencia de nucleótidos.

Análisis de los oligos: Se realizaron tres oligonucleotidos de 40 residuos cada uno, con la
misma relación GC/AT pero con diferentes secuencias de nucleótidos, se observó que la
secuencia influye sobre cada oligonucleótido, por ejemplo; en dos de los oligonucleotidos
donde los primeros 20 nucleotidos eran GC y despues 20 de AT y viceversa, presentaron
ambos una Tm muy cercana entre uno del otro, en cambio el oligonucleotido donde se
distribuyeron a lo largo de toda la cadena de forma homogenea las bases nitrogenadas,
tuvo una mayor Tm significativamente, que en los dos oligos anteriores, esto porque las
fuerzas que presentan los tres puentes de hidrogeno de GC se distribuyen a lo largo de la
cadena, “igualando” de cierta forma la estabilidad de la misma, por lo tanto se necesita
mayor energía para desnaturalizarla, y se ve reflejado en una mayor Tm en cambio en los
oligos donde no estaban distribuidos los nucleotidos, dejaban partes vulnerables donde
sólo habia AT y partes más fuertes donde había GC, pero esta diferencia de fuerza, hace
menos estable a la cadena y por lo tanto se necesita una menor energía para
desnaturalizarla, lo cual presentan una menor Tm.

Conclusión: Si existe influencia de la secuencia de nucleótidos sobre la Tm

C. Influencia de la longitud de la secuencia de nucleótidos.

Análisis de los oligos: Se diseñaron tres oligonucleótidos con la misma relación de GC/AT,
pero con diferente tamaño, fueron de 20, 30 y 60 nucleótidos; Se observó que, al ir
aumentando el tamaño de la cadena, fue aumentando la Tm de cada oligo, esto porque al
haber mayor número de nucleótidos, también hay mayor número de enlaces, por lo tanto
se necesita mayor energía para desnaturalizar una cadena y se ve reflejado en una mayor
Tm, a esto hay que sumarle los factores del experimento anterior, ya que también hay
influencia de la secuencia u orden de los nucleótidos, así que en este experimento hay
que considerar ambas cosas para llegar a una conclusión.

Conclusión: Hay aumento de la Tm cuando se aumenta la longitud de la cadena, pero hay


que considerar que esos aumentos se ven influenciados también por la secuencia de los
nucleótidos, lo cual se ve reflejado en la Tm
Discusión.

Se determinaron las absorbancias a diferentes longitudes de onda, esto se hizo


con un espectrofotómetro Nanodro. Este equipo permite realizar medidas de
espectrofotometría en un amplio rango de longitudes de onda (220-750 nm) con
gran exactitud y reproducibilidad, sin necesidad de emplear cubetas. Tan sólo
requiere un volumen de muestra de 1-2 μl y gracias a su pequeño tamaño y fácil
manejo permite medir un gran número de muestras en poco tiempo. Su
funcionamiento se basa en el empleo de un sistema de retención de muestra que
aprovecha la tensión superficial para formar un puente de líquido entre el pedestal
inferior y un pedestal superior. En los espectrofotómetros NanoDrop el pedestal
superior es el extremo de una fibra óptica conectada a una fuente de emisión de
Xenon. Ambos pedestales definen un preciso y estrecho paso óptico cuya longitud
varía automáticamente con la concentración de la muestra, permitiendo hacer
mediciones en un rango muy amplio de concentraciones sin hacer diluciones. Esta
característica lo hace idóneo para determinar la concentración y pureza de los
ácidos nucleicos.

Al determinar las absorbancias de nuestra disolución de DNA (de 220 a 320 nm,
en intervalos de 10 nm) se pudieron realizar cálculos de concentración y pureza.

La pureza de la muestra está relacionada con el valor de máxima absorbacia de


los ácidos nucleicos detectada a una longitud de onda de 260 nm. La relación de
las absorbancias A260/A280 permite conocer si el ADN obtenido está
contaminado por la presencia de compuestos aromáticos ya que éstos absorben a
una longitud de onda de 280 nm. Esta relación es muy estable y en general se
considera que el DNA es de calidad óptima cuando la relación 260/280 es mayor
de 1.8. Una relación A260/A280 > 2.1 es indicativa de una presencia considerable
de ARN en la muestra. Por el contrario, si esta relación es baja (A260/280 < 1.6) la
muestra está contaminada por proteínas o fenoles. En el caso de contaminación
por proteínas será necesario llevar a cabo un tratamiento adicional para eliminar
las proteínas presentes en la solución de ADN (por ejemplo, adición de proteinasa
K). Si la contaminación se debe a la presencia de fenoles es necesario limpiar la
muestra con cloroformo, alcohol isoamílico y etanol. La relación de absorbancia
A260/230 se utiliza como medida adicional para determinar la pureza del ADN
puesto que a 230 nm se lee el enlace peptídico, esto se puede explicar por
análisis cristalográficos de pequeños péptidos con rayos X, que revelan que el
enlace entre el carbono carbonílico y el nitrógeno es más corto que un enlace
sencillo típico C—N, pero más largo que los dobles enlaces C=N típicos. Además,
el enlace entre el carbono carbonílico y el oxígeno es un poco mayor que el doble
enlace típico C=O. Esas mediciones indican que los enlaces peptídicos tienen
ciertas propiedades del enlace doble y se pueden representar mejor como un
híbrido de resonancia.
En los cálculos de pureza experimentales del equipo 6, con la relación A260/280
resulta una pureza de 1.9, pero con relación A260/230 la pureza resultante es de
0.49, lo que estaría mas cercano a la pureza real, es decir, en nuestra solución de
DNA había una gran cantidad de proteínas y péptidos, pero entre los residuos de
aminoácidos que los componen hay poca presencia de fenilalanina, tirosina y
triptófano, ya que la absorbancia a 230 nm es mucho mayor que la absorbancia a
280.

La concentración fue otro parámetro determinado a partir de la Absorbancia


obtenida a 260 nm. Para esto se emplearon dos vías, una con formula y otra con
una simple relación.
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑎 260𝑛𝑚
La fórmula que se uso fue: 𝑐 = ; donde c es la
𝐴𝑒 × 𝑏
concentración(g/mL), Ae es el índice de absorción específica(22,500 para el DNA),
y b es el paso de luz de la celda(cm).

Con dicha formula la concentración fue de 1.69 × 10−4 g/mL, es decir 169.02
μg/mL, mientras que con la relación; 1unidad de A260nm de DNA bicatenario= 50
g/mL de DNA de doble cadena, la concentración dio un total de 190.15 μg/mL.

Claramente son valores relativamente próximos entre si, pero no son exactamente
iguales ya que la relación nos proporciona un valor aproximado, pero la formula
toma en cuenta el índice de absorción especifica de la molécula de DNA, por lo
que nos proporciona un valor mas exacto a la verdadera concentración de DNA.

Los espectros de DNA realizados con los datos obtenidos nos revelan de mejor
forma la pureza de nuestra extracción. El espectro de equipo 5 muestra su
absorción máxima a 260nm, lo que nos demuestra la presencia de DNA, pero
debido a la baja absorción podemos dilucidar que la concentración de este es baja
en comparación con los demás equipos, y esto se explica por que el equipo 5 tuvo
un percance con su muestra al realizar la centrifugación. Además de que la
concentración es muy baja también se muestra presencia de proteínas, ya que las
absorbencias de 220, 230 y 240 nm se muestran sin varianza entre ellas y que la
absorbancia de estas es muy similar a la de 260, cuando teóricamente debe ser
considerablemente menor.

El espectro del equipo 5 también muestra su absorción máxima a 260nm, lo que


demuestra la presencia de DNA, y que la concentración de este es varias veces
mayor que el equipo anterior, y para la pureza podemos observar que la diferencia
entre Absorbancia a 230 y 260 es mayor, es decir, se puede decir que esta mas
libre de proteínas que el caso anterior, pero esta diferencia debe ser mucho mayor
para que se considere que está casi completamente sin presencia de proteínas.

En cuanto al espectro del equipo 6, se observa que hay una enorme cantidad de
proteínas, pero que estas tienen poca proporción de residuos de aminoácidos
aromáticos. La cantidad de DNA presente en la solución es muy baja, tanto, que
sería preferible repetir la extracción que utilizar métodos para eliminar las
proteínas de la solución.

Conclusiones

- Se logró aislar e identificar DNA cromosómico de E. coli W3350.


- Se estableció el espectro de absorción del DNA asilado
- Se determinó la concentración y grado de pureza del DNA de E.
coli W3350
- Se determinó la influencia de algunas características de la
secuencia del DNA sobre la desnaturalización empleando el
programa bioinformático DNAMAN

 Bibliografía.

 Castro, J. E. Z. (2005). Manual de técnicas básicas de biología molecular (Vol. 7). UADY.
Pp 31-32
 Horton H.R. (2006). Principios de bioquímica. Pearson Education. P.90. ISBN 0-13-
145306-8
 Benjamin A. Pierce. (2010) Genética, un enfoque conceptual, (Era edición). Ed.
Panamericana, pp 173-177