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Presentan:
Hernández Arenas Aranza Gisell
Huerta Reséndiz Daniel Alejandro
García Mondragón José Luis
5QV2 Equipo 6
Profesores:
Verónica Pérez Enríquez
Español Español Francisco Javier
03 /09/18
Introducción.
LISIS CELULAR
Durante el proceso de lisis las interacciones entre las moléculas que conforman la
pared, la membrana celular y nuclear se modifican o destruyen permitiendo que
los ácidos nucleicos se liberen. Se utilizan soluciones básicas, detergentes o
agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como
inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el ADN. Muchas soluciones
de lisis contienen también EDTA, que forma un complejo con los iones de Mg2+ e
impide el funcionamiento de las DNAsas.
Este método permite obtener un alto rendimiento pero es frecuente que restos de
solventes orgánicos contaminen la muestra. Además, el uso de estas sustancias
tóxicas para la salud hace necesario que todo el proceso se lleve a cabo siguiendo
las buenas practicas del laboratorio.
Después de que son eliminados los lípidos y las proteínas, se recupera el ADN.
Para ello, se adiciona etanol y soluciones con altas concentraciones de iones de
sodio o amonio que se unen a los grupos fosfato, esta mezcla reduce las fuerzas
repulsivas entre las cadenas y permite que el ADN se pliegue sobre sí mismo
haciéndolo insoluble.
Una vez que se ha eliminado el etanol, el paso siguiente es hidratar el ADN para
mantenerlo en solución. En el caso de emplear agua, el pH debe ser de 7 para
permitir la redisolución completa del ADN y evitar una hidrólisis ácida. Cuando se
utiliza una solución amortiguadora, es preferible utilizar una solución de Tris-HCl a
10mM y EDTA a 0.1M a un pH de 8.0 (low TE) para almacenar el material.
Objetivos.
a) Aislar DNA cromosómico de alto peso molecular, a partir de un cultivo
bacteriano.
b) Establecer el espectro de absorción del DNA aislado
c) Determinar la influencia de algunas características de la secuencia del DNA
sobre su desnaturalización empleando el programa bioinformático
DNAMAN.
Resultados.
Tabla 1. Absorbancia, pureza y concentración de DNA extraído de E. coli W3350.
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Longitud de Onda (nm)
Gráfica 1.Espectro e absorción del DNA extraído de E. coli W3350 elaborado con los datos obtenidos por el
equipo 4
Espectro de Absorción de DNA de E. Coli W3350 (Equipo 5)
7
5
Absorbancia
0
220 230 240 250 260 270 280 290 300 3120 320
Longitud de Onda (nm)
5
4
3
2
1
0
220 210 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Longtud de onda (nm)
Gráfica 2 Espectro e absorción del DNA extraído de E. coli W3350 elaborado con los datos obtenidos por el equipo 6
Longitud de onda 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320
Absorbancia 0.138 7.782 5.231 4.479 3.803 3.083 2.001 0.917 0.379 0.208 0.138
Tabla 2. Absorbancias obtenidas de la disolución de DNA del equipo 6 en diez longitudes de onda distintas
Ilustración 1. espectros de absorción de cantidades equimolares de ácido poliadenílico y ácido
poliuridílico. la curva superior se refiere a los mononucleótidos obtenidos por hidrólisis alcalina.
Análisis de los oligos: Se realizaron tres oligonucleotidos de 40 residuos cada uno, con la
misma relación GC/AT pero con diferentes secuencias de nucleótidos, se observó que la
secuencia influye sobre cada oligonucleótido, por ejemplo; en dos de los oligonucleotidos
donde los primeros 20 nucleotidos eran GC y despues 20 de AT y viceversa, presentaron
ambos una Tm muy cercana entre uno del otro, en cambio el oligonucleotido donde se
distribuyeron a lo largo de toda la cadena de forma homogenea las bases nitrogenadas,
tuvo una mayor Tm significativamente, que en los dos oligos anteriores, esto porque las
fuerzas que presentan los tres puentes de hidrogeno de GC se distribuyen a lo largo de la
cadena, “igualando” de cierta forma la estabilidad de la misma, por lo tanto se necesita
mayor energía para desnaturalizarla, y se ve reflejado en una mayor Tm en cambio en los
oligos donde no estaban distribuidos los nucleotidos, dejaban partes vulnerables donde
sólo habia AT y partes más fuertes donde había GC, pero esta diferencia de fuerza, hace
menos estable a la cadena y por lo tanto se necesita una menor energía para
desnaturalizarla, lo cual presentan una menor Tm.
Análisis de los oligos: Se diseñaron tres oligonucleótidos con la misma relación de GC/AT,
pero con diferente tamaño, fueron de 20, 30 y 60 nucleótidos; Se observó que, al ir
aumentando el tamaño de la cadena, fue aumentando la Tm de cada oligo, esto porque al
haber mayor número de nucleótidos, también hay mayor número de enlaces, por lo tanto
se necesita mayor energía para desnaturalizar una cadena y se ve reflejado en una mayor
Tm, a esto hay que sumarle los factores del experimento anterior, ya que también hay
influencia de la secuencia u orden de los nucleótidos, así que en este experimento hay
que considerar ambas cosas para llegar a una conclusión.
Al determinar las absorbancias de nuestra disolución de DNA (de 220 a 320 nm,
en intervalos de 10 nm) se pudieron realizar cálculos de concentración y pureza.
Con dicha formula la concentración fue de 1.69 × 10−4 g/mL, es decir 169.02
μg/mL, mientras que con la relación; 1unidad de A260nm de DNA bicatenario= 50
g/mL de DNA de doble cadena, la concentración dio un total de 190.15 μg/mL.
Claramente son valores relativamente próximos entre si, pero no son exactamente
iguales ya que la relación nos proporciona un valor aproximado, pero la formula
toma en cuenta el índice de absorción especifica de la molécula de DNA, por lo
que nos proporciona un valor mas exacto a la verdadera concentración de DNA.
Los espectros de DNA realizados con los datos obtenidos nos revelan de mejor
forma la pureza de nuestra extracción. El espectro de equipo 5 muestra su
absorción máxima a 260nm, lo que nos demuestra la presencia de DNA, pero
debido a la baja absorción podemos dilucidar que la concentración de este es baja
en comparación con los demás equipos, y esto se explica por que el equipo 5 tuvo
un percance con su muestra al realizar la centrifugación. Además de que la
concentración es muy baja también se muestra presencia de proteínas, ya que las
absorbencias de 220, 230 y 240 nm se muestran sin varianza entre ellas y que la
absorbancia de estas es muy similar a la de 260, cuando teóricamente debe ser
considerablemente menor.
En cuanto al espectro del equipo 6, se observa que hay una enorme cantidad de
proteínas, pero que estas tienen poca proporción de residuos de aminoácidos
aromáticos. La cantidad de DNA presente en la solución es muy baja, tanto, que
sería preferible repetir la extracción que utilizar métodos para eliminar las
proteínas de la solución.
Conclusiones
Bibliografía.
Castro, J. E. Z. (2005). Manual de técnicas básicas de biología molecular (Vol. 7). UADY.
Pp 31-32
Horton H.R. (2006). Principios de bioquímica. Pearson Education. P.90. ISBN 0-13-
145306-8
Benjamin A. Pierce. (2010) Genética, un enfoque conceptual, (Era edición). Ed.
Panamericana, pp 173-177