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Sezione di MICROBIOLOGIA
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Codice identificativo del prodotto: Bactercline
Committente: Nanomaterials and Microdevices Technology (NM Tech),
6, Albemarle Street W1S 4HG London, ENGLAND
INDICE:
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INTRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEL PRODOTTO
Dalla Società NM Tech abbiamo ricevuto un campione del prodotto codificato come Bactercline
allo scopo di determinarne l’attività battericida.
Il prodotto si presenta sotto forma di una sospensione bianca trasparente di aspetto lattiginoso ed è
contenuto in una bottiglia di politene della capacità di 1 lt, contrassegnata con una etichetta sulla
quale è riportato il numero del lotto Bactercline / 10
Data di ricevimento del campione 02/05/2005.
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VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’
BATTERICIDA IN SOSPENSIONE.
METODO PER DILUIZIONE –
NEUTRALIZZAZIONE
(UNI – EN 1276, Aprile 2000)
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PROCEDURA SPERIMENTALE
1. SISTEMA DI SAGGIO
1.1 Microrganismi
Identificazione
Sono stati utilizzati i seguenti ceppi test:
Pseudomonas aeruginosa
Staphilococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Salmonella enteridis D1
Listeria monocytogenes
Centro di provenienza
I ceppi provengono dall’Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di
Microbiologia, dell’Università di Ferrara.
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2. TERRENI COLTURALI E REAGENTI
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3. APPARECCHIATURA
- Stufa per la sterilizzazione a secco
- Autoclave a vapore
- Termostato
- pHmetro
- Agitatore Vortex
- Cronometro
- Micropipette
- Filtri in cellulosa nitrato (dimensione dei pori: 0.45 µm)
- Supporti per filtri, applicabili a siringa
4. DISEGNO SPERIMENTALE
4.2 Concentrazioni
La sostanza in esame è stata testata alle concentrazioni seguenti:
25%-50%-80% (che risulta essere la massima concentrazione testabile).
4.5 Neutralizzante
E’ stata effettuata una neutralizzazione per filtrazione, utilizzando una siringa a cui è stato
applicato un supporto con membrana filtrante avente pori di 0.45 µm. Il filtro trattiene i batteri
mentre consente il passaggio delle nanoparticelle del disinfettante, di dimensioni medie pari a
15 nm. Il fitro contenente i batteri è stato poi rimosso dal supporto applicato alla siringa ed
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immerso in 10 ml di acqua triptonata; dopo accurata agitazione si è proceduto alle diluizioni ed
alla semina per inclusione in agar.
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5. ESECUZIONE DEL SAGGIO
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Esecuzione del saggio
Il campione di saggio, le sospensioni batteriche, le sostanze interferenti, l’acqua triptonata e
l’acqua distillata sono state preventivamente stabilizzate alla temperatura del test. Per ogni
ceppo batterico e per ogni concentrazione della sostanza in esame è stata allestita una provetta
contenente 1 ml di sostanza interferente e 1 ml di sospensione batterica avente una
concentrazione tra 1.5x108 e 5.0x108 ufc/ml alla temperatura prevista dal test.
Dopo un periodo di contatto di 2 minuti sono stati aggiunti 8 ml di sostanza in esame e lasciati a
contatto per i tempi stabiliti e alla temperatura di esecuzione del test.
Trascorso il tempo di contatto, la miscela è stata filtrata per mezzo di una siringa munita di un
supporto contenente una membrana filtrante da 0.45µm. In questo modo le cellule batteriche
sono trattenute dalla membrana filtrante mentre le nanoparticelle antibatteriche di cui è
costituito il prodotto Bactercline (dimensione di circa 15 nm) rimangono nella soluzione. La
membrana filtrante è stata rimossa quindi dal supporto applicato alla siringa e trasferita in una
provetta contenente 10 ml di acqua triptonata. La miscela è stata quindi agitata per favorire il
distacco dei microrganismi dalla membrana filtrante, e diluita con acqua triptonata con
diluizione seriale a 10-1. E’ stato quindi effettuato un conteggio in doppio per inclusione in
Agar.
Dopo un periodo di incubazione di 48 ore a 37°C ± 1°C è stato determinato il numero di
ufc/piastra e calcolato il valore di Na.
ufc/ml = C / (n x V x d)
Il conteggio è stato effettuato usando il numero delle colonie contate su entrambe le piastre.
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Solo le piastre contenenti da 15 a 300 colonie sono state usate per il calcolo dei risultati.
Nel saggio vero e proprio, dove il numero di ufc su tutte le piastre contate era < 15, è stato
registrato il numero di ufc/ml come < 1.5 x 102. Dove il numero di ufc su tutte le piastre contate
era > 300 è stato registrato il numero di ufc/ml come > 3.0 x 103.
R = (N x 10-1) / Na
dove:
R = riduzione della vitalità
N = conta batterica della sospensione test
Na = conta batterica della miscela test al termine del tempo di contatto
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CRITERI PER LA VALIDITA’ DEL SAGGIO
Verificare che:
N: sia compreso tra 1.5x108 e 5.0x108 ufc/ml
Nv: sia compreso tra 6.0x102 e 3.0x103 ufc/ml
A: sia uguale o maggiore di 0.05 volte Nv
dove:
La sostanza in esame è considerata battericida quando, per ogni ceppo batterico, a 20°C dopo un
tempo di contatto di 5 minuti, provoca una riduzione della vitalità di almeno 105.
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RISULTATI
Di seguito sono riportati i valori di riduzione di vitalità (R) alle diverse concentrazioni di
Bactercline:
CONCLUSIONI
Sulla base dei risultati ottenuti, rispettati i criteri di validità del saggio, la sostanza in esame
Bactercline è risultata BATTERICIDA nei confronti di Pseudomonas aeruginosa, Escherichia
coli, Enterococcus faecalis, Staphilococcus aureus, Salmonella enteridis D1, Listeria
monocytogenes, alle concentrazioni del 50 e 80% (che risulta essere la concentrazione massima
testabile) dopo 5 minuti di contatto in presenza di albumina bovina alla concentrazione finale 0.3%,
secondo quanto previsto dalla UNI EN 1276, Aprile 2000.
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VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’
BATTERICIDA IN SOSPENSIONE.
METODO PER DILUIZIONE –
NEUTRALIZZAZIONE
(UNI – EN 1276, Aprile 2000)
APPENDICE
SAGGIO PRELIMINARE
MICRORG. N Nv A
TEST
Staphylococcus 10-6 = NC-NC Vc: 107-117 Vc: 113-119
aureus 10-7 = 44-54
N = 4.90x108 Nv = 1.15x103 A = 1.16x103
Pseudomonas 10-6 = 180-188 Vc: 128-132 Vc: 133-137
aeruginosa 10-7 = 19-33
N = 1.84x108 Nv = 1.30x103 A = 1.35x103
Escherichia coli 10-6 = 151-167 Vc: 158-162 Vc: 151-157
10-7 = 16-20
N = 1.80x108 Nv = 1.60x103 A = 1.54x103
Enterococcus 10-6 = 282-294 Vc: 112-118 Vc: 108-112
faecalis 10-7 = 36-40
N = 3.80x108 Nv = 1.15x103 A = 1.10x103
Salmonella 10-6 = 293-299 Vc: 141-159 Vc: 148-152
enteridis D1 10-7 = 31-39
N = 3.50x108 Nv = 1.50x103 A = 1.50x103
Listeria 10-6 = 290-300 Vc: 84-94 Vc: 81-87
monocytogenes 10-7 = 21-29
N = 2.50x108 Nv = 8.90x102 A = 8.50x102
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SAGGIO VERO E PROPRIO
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VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’
BATTERICIDA:
TEST DI SUPERFICIE
(UNI – EN 13697, Dicembre 2001)
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PROCEDURA SPERIMENTALE
1. SISTEMA DI SAGGIO
1.2 Microrganismi
Identificazione
Sono stati utilizzati i seguenti ceppi test:
Pseudomonas aeruginosa
Staphilococcus aureus
Enterococcus faecalis
Escherichia coli
Salmonella enteridis D1
Listeria monocytogenes
Centro di provenienza
I ceppi provengono dall’Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica, Sezione di
Microbiologia, dell’Università di Ferrara.
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2. TERRENI COLTURALI E REAGENTI
2.2 Diluente
Triptone, digestione
pancreatica di caseina 1.0 g
NaCl 8.5 g
Acqua distillata q.b. 1000 ml
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3. APPARECCHIATURA
- Stufa per la sterilizzazione a secco
- Autoclave a vapore
- Termostato
- pHmetro
- Agitatore Vortex
- Cronometro
- Micropipette
4. DISEGNO SPERIMENTALE
4.2 Concentrazioni
La sostanza in esame è stata testata come tale, senza diluizione (100%).
4.5 Neutralizzante
Non è necessario l’utilizzo di un agente neutralizzante in quanto, trascorsi i 5 minuti di contatto,
il prodotto viene diluito di 100 volte (100µl di prodotto vengono infatti trasferiti in una provetta
contenente 10 ml di acqua triptonata), ed è stato verificato che il prodotto Bactercline diluito
anche al 10% non esplica attività battericida.
4.6 Carrier
Per l’esecuzione del saggio sono stati utilizzati dei supporti in vetro di 2.5 cm di lato.
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5. ESECUZIONE DEL SAGGIO
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stesso terreno mantenuto a 45°C ± 1°C. Tutte le piastre sono state incubate a 37°C ± 1°C per 48
ore.
E’ stato registrato il numero di unità formanti colonia / piastra (a, a’) per ogni diluizione.; è stato
calcolato il valore di Nc e Nd.
E’ stato registrato il numero di unità formanti colonia (Nts) rimaste sulla superficie del
supporto.
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6. CALCOLO ED ESPRESSIONE DEI RISULTATI
d = fattore di diluizione
d = fattore di diluizione
ME = Nc - Nd
Verificare che:
N – Nc minore o uguale a 2 log
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RISULTATI
CONCLUSIONI
Sulla base dei risultati ottenuti, rispettati i criteri di validità del saggio, la sostanza in esame
Bactercline nelle condizioni sperimentali adottate è risultata BATTERICIDA nei confronti di
Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Staphilococcus aureus, Salmonella Enteridis D1,
Listeria Monocytogenes, Enterococcus faecalis alla concentrazione del 100% dopo 5 minuti di
contatto in presenza di albumina bovina alla concentrazione finale 0.3%, secondo quanto previsto
dalla UNI EN 13697, Dicembre 2001.
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VALUTAZIONE DELL’ATTIVITA’ BATTERICIDA:
TEST DI SUPERFICIE
(UNI EN 13697, Dicembre 2001)
TABELLE
Logaritmo delle colonie contate per il test di superficie ai diversi tempi di contatto e alle
diverse concentrazioni.
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APPENDICE: saggio vero e proprio (ufc/piastra)
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Prof. Alfredo Corallini
Cattedra di Microbiologia
Dipartimento di Medicina Sperimentale e Diagnostica,
sezione di Microbiologia
Università degli Studi di Ferrara
Ferrara, 23/03/2006
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