Sei sulla pagina 1di 66

Diagnostica virologica

arte e tecnica di formulare la diagnosi

Una rapida diagnosi della malattia e del suo agente


eziologico è alla base di un efficace trattamento e
cura di una patologia in atto.

Una rapida e precisa diagnosi di un’infezione virale


si fonda sull’analisi dei dati clinici e degli esami di
laboratorio.
METODI DIAGNOSTICI IN VIROLOGIA

• Determinazione DIRETTA: ricerca ed identificazione del


virus o dei suoi componenti nel campione ottenuto dal
paziente (sangue, liquor, biopsia, espettorato).

• Determinazione INDIRETTA: ricerca di anticorpi specifici


(risposta immunitaria) contro antigeni virali nell’organismo
potenzialmente infetto.
• Indagine virologica: ricerca nei materiali biologici del
virione o componenti di esso (proteine o acidi nucleici)
- Isolamento virale con crescita (secrezioni, biopsie,
sangue) su colture cellulari e successiva tipizzazione
(giorni)
- Identificazione diretta (secrezioni, biopsie, sangue):
ricerca di antigeni virali tramite saggi immunoenzimatici
(EIA) o radiometrici (RIA); ricerca di acidi nucleici virali
tramite Southern blot, Northern blot e reazione di
polimerizzazione a catena (PCR); identificazione diretta del
virus con tecniche di microscopia elettronica,
immunofluorescenza (ore)

• Indagine sierologica: ricerca di anticorpi specifici diretti


contro antigeni virali (su siero di pazienti) con tecniche:
western blot, saggi immunoenzimatici (EIA o ELISA) o
radiometrici (RIA), neutralizzazione, fissazione del
complemento, inibizione dell’emoagglutinazione (ore)
Indagine sierologica:

•Oggi si preferiscono usare saggi tipo EIA, ELISA e RIA, basati sulla reazione
antigene-anticorpo.

Possibilità di automazione, altamente sensibili, specifici, analisi quantitativa.

Possibilità di misurare l’aumento del titolo anticorpale durante l’infezione (indice


di infezione in atto).

Ove possibile si valutano la presenza di IgM che indicano solitamente


un’infezione recente o in atto.

Alternativa IgA, che offrono il vantaggio di non ricomparire nel siero durante le
reinfezioni.

Presenza di IgG, infezione pregressa, immunizzazione (vaccino, o guarigione),


ma anche infezione in atto.

Problema: difficoltà di individuare il sierotipo coinvolto nell’infezione in


famiglie di virus composite.
Indagine sierologica:
• Saggio di fissazione del complemento
Il campione di siero viene fatto reagire con quantità nota di virus e complemento.
L’anticoprpo specifico, se presente, forma un complesso con il virus o l’antigene
virale e fissa il complemento.
Successivamente alla miscela viene aggiunto un sistema di rilevazione di emazie
ed anticorpi anti-emazie.

Se l’anticorpo è presente non ci sarà la lisi delle emazie, non rilascio di


emoglobina, nessun segnale.

Se l’anticorpo è assente, il complemento libero fisserà l’immunocomplesso di


emazie-anticorpi antiemazie, causando la lisi delle emazie con rilascio di
emoglobina, che verrà misurata allo spettrofotometro.

Titolo di anticorpi fissanti il complemento: ultima diluizione alla quale si osserva


inibizione della lisi delle emazie.
• Indagine virologica: ricerca nei materiali biologici del
virione o componenti di esso (proteine o acidi nucleici)

- Isolamento virale con crescita (secrezioni, biopsie, sangue)


su colture cellulari e successiva tipizzazione (giorni)

- Identificazione diretta (secrezioni, biopsie, sangue): ricerca


di antigeni virali tramite saggi immunoenzimatici (EIA) o
radiometrici (RIA); ricerca di acidi nucleici virali tramite
Southern blot, Northern blot e reazione di polimerizzazione a
catena (PCR); identificazione diretta del virus con tecniche di
microscopia elettronica, immunofluorescenza (ore)
La scelta del campione è in relazione alla sede dell’infezione.
Riconoscimento della moltiplicazione virale in colture cellulari

• Attraverso l’effetto citopatico (evidenza diretta): comparsa di


alterazioni cellulari (necrosi, apoptosi, citofagia, agglutinazione
cellulare, formazione di sincizi). Osservabile al microscopio a
piccolo ingrandimento. Molto frequente.

• Attraverso evidenza indiretta (non apprezzabile all’osservazione


microscopica delle cellule): saggiando la presenza di potere
agglutinante nel liquido di coltura, la presenza di antigeni virali
(mediante immunofluorescenza), emoadsorbimento, interferenza,
ecc.

L’esame al microscopio elettronico permette sia la conta delle


particelle virali sia la loro caratterizzazione morfologica.
Disruption of astrocytic monolayer induced by exposure
to supernatants from HIV-infected macrophages

AA BB CC

Representative photomicrographs (optical microscopy 340x) of astrocyte cell


monolayers: after 6 days of exposure to supernatants of mock-infected M/M (A), after 6
days (B), and after 10 days (C) of exposure to supernatants of HIV-infected M/M.
Cytopathic effect (CPE) resulting from virus infection. The center
portion of the figure shows monkey (Vero) cells rounding up and
detaching from the substrate after infection with Herpes simplex virus
1 (HSV-1). A normal monolayer of cells is visible around the focus of
CPE. The cells were fixed with methanol and stained with Giemsa
stain. Micrograph courtesy of M. Kosz-Vnenchak.
Coltivazione e titolazione dei Virus
Essendo i virus parassiti intracellulari obbligati,
per poterne ottenere la moltiplicazione in
laboratorio è necessario disporre di cellule viventi
(animali da laboratorio o colture cellulari) sensibili
(deve far entrare il virus) e permissive (deve far
replicare il virus).
.
• I primi isolamenti di virus furono fatti coltivandoli in
topini neonati (mancanti ancora di difese immunitarie) o
in embrioni di pollo.

• Nell’embrione di pollo i virus vengono inoculati


attraverso appositi fori praticati nel guscio, nei liquidi
contenuti in una delle cavità (allantoidea o amniotica) o
sulla membrana corion-allantoidea. I virus crescono nelle
cellule delimitanti le cavità. La moltiplicazione virale si
osserva in seguito alla morte dell’embrione, o alla
comparsa di potere agglutinante nei liquidi embrionali o
di lesioni sulla membrana. (virus dell’influenza, poxvirus,
virus erpetici).

• Il topino neonato viene ancora usato per l’isolamento di


alcuni virus (coxsackievirus, togavirus) e viene inoculato
per via intracerebrale o intraperitoneale. La
moltiplicazione virale si appalesa con segni morbosi
(tremori, paralisi, rigidità) o morte dell’animale.
Titolazione
Per stabilire la quantità di virus (titolo virale) in un materiale il metodo più
usato consiste nella determinazione del titolo infettante del materiale in
esame (che è direttamente proporzionale al numero di virioni completi
presenti).

Metodo Diretto: attraverso la conta in un monostrato di cellule delle


placche di citolisi o delle lesioni provocate sulla membrana corionallantoidea
(poxvirus ed herpesvirus) prodotte da una sospensione virale diluita (in serie
logaritmica).
Titolazione con metodo indiretto: attraverso il calcolo con semplici metodi statistici del
numero di dosi infettanti il 50% degli ospiti inoculati presenti per unità di volume,
attraverso l’individuazione della diluizione massima del materiale (diluito in serie
progressiva) capace di provocare un effetto virus-specifico (distruzione cellulare, o morte
o comparsa di lesioni negli animali) in almeno uno degli ospiti impiegati.
Emoagglutinazione: Molti virus sono provvisti di proteine di superficie in grado
di legarsi alla membrana di eritrociti di diverse specie animali formando dei ponti
tra gli eritrociti (agglutinazione). Eritrociti agglutinati sedimentano al fondo di
provette in modo irregolare occupando tutto il pozzetto rispetto agli eritrociti non
agglutinati, che formano sul fondo del pozzetto un dischetto compatto.

Differenziazione tra
Virus dell’influenza (A, B, C)
(con l’emaglutinina)
e
i virus erpetici (D)
(senza l’emaglutinina)

Indagine sierologica:
Saggio di inbizione dell’emoagglutinazione
Opportune diluizioni di siero vengono fatte reagire con una quantità nota di virus.
Incubazione 1h 37°C, reazione antigene-anticorpo. Aggiunti eritrociti a
concentrazioni definite. Presenza di anticorpo: non agglutinazione, assenza di
anticorpo:emoagglutinazione.
Il titolo emoagglutinante è anch’esso proporzionale alla
concentrazione di virioni nel campione in esame.

Tuttavia, mentre un solo virione infettante può essere evidenziato


mediante la titolazione del potere infettante, nei test di
emoagglutinazione è necessario un alto numero di particelle virali
(es 10 milioni nel caso di virus influenzale) per avere
l’agglutinazione evidente di un adeguato numero di eritrociti (in
genere 0,25 ml di una sopsensione del 1%).
Le colture cellulari servono sia ad isolare e moltiplicare
i virus, sia ad osservare le alterazioni cellulari dovute
all’infezione virale e a studiare i meccanismi di
replicazione e danno cellulare a livello biomolecolare.
Oggi si usano soprattutto colture di cellule cresciute in
terreni di coltura arricchiti di aminoacidi, vitamine, siero di
sangue e antibiotici (che consentono la riduzione della
distruzione delle colture stesse ad opera di contaminazioni
microbiche).

Per l’allestimento di colture cellulari primarie, frammenti


di tessuto vengono dissociati mediante trattamento con
enzimi proteolitici (tripsina, collagenasi, DNAsi) e messi in
piastra.

Le cellule di coltura primaria hanno le stesse


caratteristiche delle cellule presenti nell’organo di origine,
sono diploidi, e possono essere mantenute in vitro mediante
passaggi seriali (staccate con tripsina) per una decina di
generazioni al massimo, andando poi incontro a senescenza
cellulare e morte .
• Alcune cellule, in genere di origine tumorale o
prodottesi per mutazione di uno stipite diploide,
diventano capaci di riprodursi illimitatamente in
vitro (immortalizzazione), dando origine a una linea
cellulare, con corredo aneuploide. Alcune linee
cellulari (HeLa, Kb, Hep2) allestite da carcinomi
umani sono molto usate nello studio dei virus umani.

• Le cellule in coltura sono in genere o sottili e


allungate dette similfibroblastiche, o poligonali
dette similepiteliali.

• Le cellule possono essere conservate per anni


mediante congelamento. Sospensioni di cellule
vengono mescolate con glicerolo o dimetisulfossido
e portate gradualmente a temperature molto basse
(-80ºC o in azoto liquido, -196ºC).
Establishment of human adult astrocyte cultures

- Tissue was collected from autopsy (3hr


post-mortem) or biopsy ( 24hr) brain tissue of frontal
pole (cortex-subcortex
- Divided in white and in grey matter region)
- incubated in HBSS medium + trypsin
+EDTA +glucose+DNase for 40 minutes
in shaker water-bath at 37°C.
Separation of neural
- To remove meningeal and blood macrophage
cells from adherent
cells, cell suspensions were plated in uncoated
cells
175 cm2 flasks for 2 h in incubator 37°C.

- Supernatants containing suspension cells were primary cell culture:


transferred to 25cm2 poly-L-lysine-coated flask outgrowth of adherent
and left in incubator at 37°C for several days. cell colonies

- The cells were able to proliferate for 12 Expansion


passages and could be frozen and recultured

Phase Vimentin GFAP

Detection of astrocyte
marker antigens
Microscopia a piccolo ingrandimento
Normal and poliovirus-infected monkey kidney cells in culture (cells neither fixed nor stained; *150).
A: Monolayer of normal unstained monkey kidney cell in culture. B: Unstained monkey kidney cell
culture showing early stage of cytopathic effect typical of poliovirus infection. Approximately 25% of
the cytopathic effect (especially rounding) indicative of virus multiplication (1+ cytopathic effect
score). C: Unstained monkey kidney culture illustrating more advancedcytopathic effect (3+ to 4+
cytopathic effect). Almost 100% of the cells are affected, and most of the cell sheet has come loose
from the wall of the culture tube. (From ref. 207, with permission.)
In situ hybridization detection of the location of viral nucleic acids in infected cells.
Monkey cells infected with HSV-1 were fixed in formaldehyde, permeabilized in acetone,
and incubated with biotin-labeled HSV DNA. The cultures were heated to denature the
cellular DNA and the probe, and the culture and solution were allowed to cool. The cells
were then reacted with mouse anti-ICP4 monoclonal antibody followed by rhodamine-
conjugated goat antimouse immunoglobulin antibody and fluorescein-conjugated avidin.
A: Rhodamine fluorescence showing the location of the HSV trans-activator protein
ICP4. B: Fluorescein fluorescence showing the location of HSV DNA in the infected
cells. Micrograph courtesy of S. Rice.
Altered localization of viral proteins in cells infected with recombinant SV5 expressing an HN protein with a
truncated cytoplasmic tail. In wild-type recombinant SV5 (rSV5)-infected cells, HN was found in highly localized
patches on the cell surface, and it is likely that these patches are the sites of budding virus. In contrast, in cells
infected with rSV5 HNd2–9, a recombinant SV5 lacking residues two to nine of the HN cytoplasmic tail, a striking
redistribution of the HN staining pattern was observed, with HN being distributed all across the cell surface.
Concomitant with the altered HN staining pattern in cells infected with rSV5 HNd2–9, a redistribution of the M
protein straining pattern was observed. The similarity of HN and M staining patterns suggests that targeting of M
protein into presumptive budding sites at the cell surface depends on the presence
Electron micrographs of virions and infected cells. A: Purified St. Louis encephalitis (SLE) virus negatively stained with
ammonium molybdate (472). Surface projections appear as a very thin, indistinct layer. (Courtesy of Dr. Frederick A.
Murphy.)B: Thin section of a BHK-21 cell at 48 hours after infection showing SLE virions in the cisternae of the
endoplasmic reticulum (765). (Courtesy of Frederick A. Murphy, Sylvia G. Whitfield, and A. K. Harrison.) C: Para-
crystalline array of SLE virus in a Culex pipiens mosquito salivary gland cell 25 days after blood-meal-feeding on an
infected suckling mouse. (Courtesy of Sylvia G. Whitfield, Frederick A. Murphy, and W. Daniel Sudia.) D: Classical
swine fever virus (CSFV) virions negatively stained with uranyl acetate. (Courtesy of Dr. Frank Weiland.)E: Ultrathin
section of STE cells infected with CSFV and immunostained with Erns-specific monoclonal antibody (MAb) 24/16 and
colloidal gold. Bar = 100 nm. (From ref. 746, with permission.) F: Thin section showing virus-like particles (arrows) in
HPBALL cells harvested 14 days after infection with
HCV (632). Particles measured approximately 50 nm in diameter. (Courtesy of Dr. Yokho Shimizu.)
Electron micrograph of vesicular stomatitis virus (VSV), negatively stained with
phosphotungstic acid. Disrupted virions show the helical nucleocapsid core. The
surface of intact virions shows protruding glycoprotein spikes.
Electron micrographs of representative virion particles.
Figure 7-9 Electron microscope visualization of nuclear inclusion areas. The filled
triangles denote the electron-translucent nuclear inclusion area in a human HEp-2 cell
infected with HSV-1. The filled arrows indicate full capsids, and the unfilled arrows
indicate empty capsids. The unfilled triangles indicate host chromatin compressed to
the periphery of the nucleus, apparently by the nuclear inclusion. Micrograph courtesy
of D. Furlong and B. Roizman.
Electron microscope visualization of cytoplasmic “factories” in a cell infected
with reovirus. Micrograph courtesy
Microscopia elettronica

Formazione di vacuoli in macrofagi


infetti con HIV-1

HIV-1 budding durante infezione di un


linfocita
Microscopia elettronica

HIV budding durante un infezione di un linfocita


Microscopia elettronica

Formazione di vacuoli in macrofagi infetti con HIV


Diagnostica molecolare infezioni virali

Analisi qualitativa e quantitativa degli acidi nucleici virali:

viremia per HIV, HBV, HCV


Metodiche: PCR, RT-PCR, NASBA

Analisi genotipica delle resistenza ai farmaci in particolare


per HIV, HBV, HCV
Metodiche: sequenziamento DNA, interpretazione algoritmica

Terapia antivirale genotipo guidata


Metodiche Molecolari
• La rivelazione degli acidi nucleici virali è un altro
saggio che può essere utilizzato sia per verificare la
presenza di un virus in un determinato campione
biologico, sia per studiare in maniera dettagliata le fasi
del suo ciclo di replicazione.
Ricerca diretta degli acidi nucleici virali

• E’ possibile eseguire tale rivelazione se si seguono le


seguenti condizioni:
1) l’acido nucleico virale deve poter essere estratto dai
campioni biologici su cui si vuol eseguire il saggio (colture
cellulari, biopsie, siero, ecc.)
2) deve essere disponibile una sonda di acido nucleico per
l’identificazione del virus.
IBRIDAZIONE I

• Saggio che prevede di trattare il materiale estratto dal


campione con una sonda oligonucleotidica con una
sequenza complementare alla regione virale specifica che
si vuole identificare. La sonda è sempre marcata o con un
isotopo radioattivo, o con un marcatore enzimatico,
fluorescente o chemioluminescente.
Tecniche di ibridazione
IBRIDAZIONE II
• Northern blot analisi effettuata su RNA (genomico o
RNAm).
• Southern blot analisi effettuata su DNA.

In entrambi i casi il saggio prevede estrazione, purificazione e


denaturazione del DNA o RNA e una corsa elettroforetica che
comporta la separazione degli acidi nucleici virali in base alla
loro lunghezza, seguita da un trasferimento su filtri idonei a far
avvenire la successiva fase di ibridazione.
Southern blot
Saggi di amplificazione degli acidi nucleici

• Reazione di amplificazione a catena (PCR) permette di


amplificare (DNA-polimerasi) un determinato frammento
di acido nucleico.

• Cicli ripetuti di denaturazione, ibridazione e


polimerizzazione fanno sì che la sequenza virale, se
presente, venga amplificata in maniera esponenziale.

• Trattando il materiale estratto con trascrittasi inversa per


trascrivere l’RNA in DNA, la PCR può essere usata anche
con virus a RNA (RT-PCR).
Schematic of PCR

Each cycle doubles the copy number of the target


PCR: Amplificazione DNA

dNTPs
Primers

DNA polimerasi

DNA
PCR

E’ realizzata ripetendo più cicli di amplificazione


(20-40 cicli)
-Denaturazione : Separazione delle due eliche di DNA
(95°C), 30 sec. da amplificare

-Ibridazione: I primers si ibridano con le sequenze


(55–60°C), 30 sec. complementari del DNA “target”

-Estensione: Sintesi dei due nuovi filamenti di DNA


(72°C), tempo variabile complementari alla sequenza bersaglio
a seconda della grandezza
dell’amplificato. mediante la DNA polimerasi
PCR: Analisi del prodotto di amplificazione

1) Gel di agarosio al 2%.

2) Elettroforesi: 100~150 volt.

3) Analizzare su un transilluminatore

UV la banda del prodotto di

amplificazione
PCR: Analisi del prodotto di amplificazione

M C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8

200 bp
Informazioni importanti !!!
• L'uso della PCR nella routine richiede una cura particolare nell'evitare
contaminazioni da amplificati di DNA, attraverso l'adozione di pratiche
laboratoristiche rigorose.

• L’approccio migliore all’uso della PCR nella routine è quello di adottare pratiche di
laboratorio adeguate: separazione rigorosa dei reagenti pre e post amplificazione;
linee guida specifiche per il campione manipolato; il personale laboratoristico
dovrebbe essere costantemente cosciente delle fonti di contaminazione possibili:
- carryover da campione a campione
- contaminazione inavvertita dei campioni durante l’aliquotazione e la
distribuzione
- presenza di sequenze bersaglio clonate nei laboratori che hanno isolato e
caratterizzato le stesse sequenze che ricercano.

• L’approccio migliore in assoluto è quello di includere reazioni di controllo


negative per ognuno dei passaggi principali nel trattamento dei campioni.
PCR: Limiti

PCR

- Falsi positivi
- Analisi qualitativa

Nuove prospettive

PCR real-time

- Analisi quantitativa
Una PCR quantitativa permette di determinare in un campione la
quantità di DNA presente per unità di volume.
PCR real-time

Utilizza un sistema che permette l’amplificazione e la


quantificazione ON-LINE con rilevazione in
fluorescenza dei prodotti di PCR

L’amplificazione e la rilevazione fluorescente


avvengono all’interno dello stesso capillare (in vetro
borosilicato) eliminando il problema della
contaminazione
PCR real-time
DNA
polimerasi dNTPs

Primers

Sonde
fluorescenti

DNA
PCR real-time

E’ in grado di analizzare diversi tipi di


fluorescenza emessa da:

FLUOROFORI INTERCALANTI IL DNA (SYBR GREEN)

SONDE DI IBRIDAZIONE (FRET)

SONDE DI IDROLISI (TAQMAN)

Rapidità di esecuzione : 20’per 30 cicli


PCR real-time: Analisi quantitativa

Monitorare real time-

on line l’andamento

della reazione di

amplificazione
PCR real-time: Vantaggi

Semplicità di automazione

Flessibilità

Rapidità di esecuzione

Elevate sensibilità e specificità

Elevata riproducibilità
Analisi quantitativa
• NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)
Utilizzando 3 enzimi (RNA polimerasi T7, RT, RNASi H) e 2
primer specifici si consente l’amplificazione sia di RNA sia di DNA
in maniera esponenziale.
Si basa sullo schema di trasferimento dell’informazione genica
caratteristico del meccanismo di replicazione dei genomi dei
retrovirus: da RNA a DNA e, di nuovo, RNA.
Si usa contemporaneamente la miscela di enzimi che funzioneranno
a temperatura costante per ottenere la replicazione dell’acido
nucleico.
Due oligo, uno (A) funziona come
molecola ibrida con due distinti
domini e funzioni: la prima è
complementare alla sequenza target,
mentre la seconda contiene un
promotore per una RNA polimerasi.
I enzima RT che sintetizza DNA a
partire dall’RNA. Ibrido RNA_DNA.
II enzima RNAsi-H degrada RNA e
quindi il secondo oligo (B) si lega al
DNA ed inizia la sintesi del cDNA.
III enzima T7 RNA polimerasi (DNA
dipendente) trascrive il doppio
filamento di DNA partendo dal
promotore presente sul primo”ibrido”
primer .

Il prodotto della reazione NASBA è un RNA a singolo filamento,


che rappresenta 106-109 volte la sequenza bersaglio, sembra
fornire maggiori garanzie di specificità.
branched DNA
• Utilizzando speciali sonde chemioluminescenti
ibridazione sensibile che amplifica il segnale di
rivelazione in maniera lineare.
• Questa tecnica offre la possibilità di
quantificare gli acidi nucleici virali riducendo i
rischi di contaminazioni.
• Vengono utilizzati per studiare pazienti in corso
di infezione da HIV, HBV, HCV.
Amplificazione del segnale: branched DNA

• Metodo quantitativo che utilizza speciali sonde chemioluminescenti


che si legano specificatamente alla sequenza di acido nucleico da
identificare, creando una struttura ramificata “branched
DNA”(bDNA). Il segnale ottenuto alla fine della reazione è
proporzionale alla quantità di bersaglio presente nel campione.

• Quantifica sia DNA che RNA: l’acido nucleico legato ad un set di


sonde specifiche (ibridazione) sul pozzetto di una micropiastra; un
altro set di sonde, con una sequenza complementare ad un’altra
porzione del target, viene utilizzato per la rivelazione. A queste
sonde vengono successivamente legate le molecole di DNA
“ramificate” , che amplificano il segnale generato da ciascuna
molecola target. L’aggiunta di sonde marcate con fosfatasi alcalina,
complementari a tre diversi siti di legame su ciascun ramo della
molecola, e di un substrato chemiluminescente genera emissione di
luce.
I step) LISI VIRALE E CATTURA DEL TARGET

Lisi virale RNA o DNA target

Rilascio genoma

Capture Probes e Target Probes con sequenze complementari al target

Capture Probes e Target Probes si Target RNA or DNA


ibridano al target e Target Probes *

si legano al fondo del micro- Capture


pozzetto ricoperto. Probes
Solid Phase Capture Probes

Microwell

* components containing Iso-C/Iso-G


II) PREAMPLIFICAZIONE

Ogni Preamplifier si ibrida a 2 Target Probes

Preamplifiers*

Target RNA or DNA


Target Probes *

Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes

Microwell

* components containing Iso-C/Iso-G


III) AMPLIFICAZIONE

Amplifiers *

L’Amplifier si lega al Preamplifier

Preamplifiers*

Target RNA or DNA


Target Probes*

Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes

Microwell

* components containing Iso-C/Iso-G


IV) IBRIDAZIONE DELLA SONDA
MARCATA

Amplifiers * with
hybridized
Label Probes*

Sonde marcate con Fosfatasi Alcalina si legano


agli Amplifier
Preamplifiers *

Target RNA or DNA


Target Probes *

Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes

Microwell

* components containing Iso-C/Iso-G


V) GENERAZIONE DEL SEGNALE

Amplifiers * with
hybridized
Label Probes*

La luce ottenuta dall’idrolisi del


diossietano condotta dalla F.A. è

proporzionale alla concentrazione


iniziale del target
Preamplifiers *

Target RNA or DNA


Target Probes *

Capture
Probes
Solid Phase Capture Probes

Microwell

* components containing Iso-C/Iso-G


Applicazioni delle tecniche di
amplificazione degli acidi nucleici
Sequenziamento

ƒ Il sequenziamento dei prodotti amplificati può fornire


una valida informazione sia sull’identità di un virus il cui
acido nucleico è stato amplificato sia sulla presenza di
mutanti virali associati a resistenza ai farmaci antivirali.

ƒ La sua principale applicazione nella diagnostica virale è


il rilevamento del sottotipo virale (HBV, HCV, HPV,
HIV) e della resistenza ai farmaci anti-HIV e anti-HBV
da campioni di plasma da pazienti trattati in fallimento
terapeutico.