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Metodi per lanalisi microbiologica degli alimenti METODI E TERRENI COLTURALI PER

LANALISI MICROBIOLOGICA DEGLI ALIMENTI


1. PREPARAZIONE DEL CAMPIONE
Lo scopo della preparazione di un campione per unanalisi microbiologica quello di omogeneizzare il
prodotto mediante lutilizzo di un diluente senza danneggiare le forme microbiche presenti e che si
vogliono determinare. Si deve operare in sterilit al fine di evitare contaminazioni esterne che
potrebbero invalidare lanalisi. Le modalit di preparazione sono diverse a seconda della natura del
prodotto.
PRODOTTI SOLIDI
Pesare sterilmente una quantit sufficientemente rappresentativa del campione in esame (!"#$ g% in un
sacchetto sterile& aggiungere in ragione '! diluente sterile& quindi omogeneizzare.
Lomogeneizzazione viene effettuata con Stomacher& un apparecchio che grazie alla presenza di pedali
che si muovono in senso rototraslatorio schiaccia il campione e ne determina lo sfibramento( la durata
dellomogeneizzazione sar stabilita in base alla durezza e alla consistenza del campione. Lanalisi deve
essere eseguita subito& se ci) non fosse possibile& conservare in frigorifero (*+,% il campione diluito
(figura %. -n alcuni prodotti quali semi& leguminose ecc.& i microrganismi si dispongono sulla superficie
esterna per tanto& per questi prodotti& non necessario lutilizzo dello stomacher& ma sufficiente
lasciarli a contatto con il diluente per un tempo non superiore a ! minuti& meglio se in frigorifero& al
fine di permettere il distacco dei microrganismi dalla superficie& ma non la loro moltiplicazione.
PRODOTTI LIQUIDI
.on richiedono alcuna preparazione& ma si utilizzano direttamente tal quali (figura #%.
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microbiologica degli alimenti
/igura " Preparazione di un campione solido per lanalisi microbiologica
Semina
incorporamento
(1 ml)
spatolamento sup.
Terreno specifico
10
-1
Lettura
Incubazione
1 ml
10
-7
10
-2
10
-3
10
-4
10
-
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
10
-!
"tomac#er per 1-3 minuti
Diluente sterile (x 9)
"ale triptone
$in%er
&itrato 'i so'io
(c)ua triptonata
*esata in sacc#etto sterile
&ampione
10 %
+ ml
'iluente
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/igura # " 0odalit di semina di un prodotto liquido
10
-4
10
-3
10
-1
10
-2
+ ml
'iluente
1,1000
(10
-3
)
1,10
(10
-1
)
1,100
(10
-2
)
1,10000 (10
-4
)
1 ml
1 ml
1 ml
1 ml
,ampione (1al quale%
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2. TECNICHE DI SEMINA
SEMINA PER INCORPORAMENTO
Si procede& ponendo ml di unopportuna diluizione del campione in piastre Petri sterili del diametro di
3 cm quindi il terreno& preparato in precedenza e sciolto mediante ebollizione& una volta raggiunta la
temperatura di *$"$!+,& versato in ciascuna delle piastre seminate in ragione di !"# ml. 4uindi& al
fine di distribuire la sospensione microbica nel modo pi5 omogeneo possibile in tutto il terreno
addizionato& si effettuano delicati movimenti rotatori& orizzontali e verticali della piastra.
4uesto sistema pu) essere utilizzato per tutti i microrganismi
SEMINA PER SPATOLAMENTO SUPERFICIALE
Preparare il terreno specifico e dopo sterilizzazione versarlo nelle piastre e lasciare solidificare.
Seminare quindi !. ml della diluizione del campione& precedente a quella prescelta& al centro di una
piastra di Petri da 3 cm di diametro& contenente il terreno ben asciutto& preferibilmente preparato #* ore
prima. La sospensione microbica quindi distribuita su tutta la superficie mediante laiuto di una
spatola sterile a L& avendo cura di cambiare spatola per ogni diluizione oppure& iniziando a spatolare
dalla diluizione pi5 alta per evitare di trascinare microrganismi da una piastra allaltra. Per aumentare la
possibilit di recupero microbico (campioni con cariche molto basse% si consiglia un aumento del
volume da piastrare& quindi seminare ml in una piastra di * cm di diametro.
4uesto tecnica di semina suggerita per i microrganismi aerobi stretti oppure quando si vuole
evidenziare la morfologia delle colonie.
SEMINA IN DOPPIO STRATO
Seminare ml di unopportuna diluizione in piastre di Petri sterili. -l terreno& preparato in precedenza&
sciolto mediante ebollizione e& raggiunta la temperatura di *$"$!+,& distribuito in ciascuna delle
piastre seminate in ragione di !"# ml( una volta dispersa la sospensione microbica e& solidificazione
del terreno& si procede allaggiunta di un secondo strato di terreno& circa 6 ml& e si lascia solidificare.
4uesto sistema abitualmente utilizzato per i microrganismi anaerobi facoltativi.
SEMINA PER INFISSIONE
Prelevare con ago di platino sterilizzato una minima quantit di patina microbica da una coltura fresca e
perforare il terreno debolmente agarizzato e solidificato che si intende seminare. 4uesta tecnica
utilizzata per seminare microrganismi anaerobi facoltativi o quando& a fini tassonomici& si
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intende conoscere il metabolismo del microrganismo. Pu) essere effettuata sia in provetta che in piastra.
SEMINA IN ALTO STRATO
Sciogliere per ebollizione il terreno agarizzato distribuito in provette& lasciar raffreddare sino a $!+,
quindi& prima che il terreno si solidifichi nuovamente& seminare immergendo totalmente la pipetta nel
terreno per tutta la sua altezza e lasciare cadere il contenuto& mentre la pipetta stessa viene estratta. Si
evita in questo modo di introdurre aria. Lasciare quindi solidificare e coprire con un tappo di paraffina
sterile solida o di agar doppio al fine di creare le condizioni di anaerobiosi. 4uesta tecnica si utilizza per
i microrganismi anaerobi.
TECNICA DELLO STRISCIO
La sospensione o la patina microbica& prelevata sterilmente con unansa calibrata& distribuita sopra un
terreno agarizzato& facendo passare delicatamente per tutta la superficie lansa. La semina pu) essere
effettuata in provetta (becco di clarino o slant% quando lo scopo di conservare il ceppo microbico
oppure in piastre di Petri quando si vogliono differenziare le singole colonie.
3. TECNICHE DI CONTA
CONTA IN PIASTRA
Sono considerate solamente le piastre che contengono un numero di colonie non superiore a $! e
comunque non inferiore a !.
-l numero dei microrganismi in ml di prodotto& o in g& nel caso dei prodotti solidi& dato dalla
formula'
dove'
7,' la somma del numero di colonie contate
n

' rappresenta in numero di piastre utilizzate per la prima diluizione
n
#
' rappresenta in numero di piastre utilizzate per la seconda diluizione
7'
(n) * %+) n$,d
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d' il fattore di diluizione relativo ai primi conteggi effettuati
8rrotondare il risultato a due cifre significative( il valore finale sar quindi espresso come numero
compreso tra .! e 3.3 moltiplicato per lopportuna potenza di dieci (diluizione considerata%.
.el caso in cui tutte le conte della colonie risultassero inferiori a dieci& esprimere il numero di
microrganismi per grammo o ml come 9meno di ! : ;d<& dove d il valore corrispondente alla prima
diluizione piastrata.
Se tutte le conte fossero superiori a $!& esprimere il risultato come numero presuntivo di colonie&
stimandolo in base al numero di colonie identificabili nella piastra pi5 diluita.
8d esempio'
Sono state seminate le piastre in doppio e dalla conta delle colonie si sono ottenuti i seguenti valori'
nella prima diluizione (!
"#
%' 62 e 3= colonie
nella seconda (!
"2
%' 2 e ! colonie
,nn7>(&%#! ? 623=2!#!#!#>>>>@A(.%B ? #!2!!##. ? 32C d
-l risultato sar quindi espresso sulla base dellapprossimazione consigliata come 3. : !
2
TECNICA DEL MUST PROBABLE NUMBER
,iascuna diluizione viene seminata in triplo& quindi per la lettura& si considerano le ultime tre diluizioni
in cui si verificata crescita e& per ciascuna diluizione si riporta il numero di provette positive& si ottiene
cosD un numero caratteristico. Si ricerca sulle tavole di 0c EadF (tabella % questo numero che
corrisponder ad un certo quantitativo di microrganismi& tale numero deve essere moltiplicato per il
reciproco della prima diluizione considerata nella lettura. -l valore ottenuto sar il numero di
microrganismi per g o ml di prodotto. La figura 2 riporta un esempio di lettura.
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/igura 2 " Gsempio di lettura con 0HS1 PEIJ8JLG .H0JGE
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microbiologica degli alimenti
1abella " 1abella di 0c. EadF
N,*#$ "&#&--*#!(-!"$ N,*#$ .! !"#$/! N,*#$ "&#&--*#!(-!"$ N,*#$ .! !"#$/!
000
!.!
222 2.$
001 !.2
223 *.!
010 !.2 230 2.!
011
!.C
231 2.$
020 !.C 232 *.!
100 !.* 300 #.$
101 !.= 301 *.!
102 . 302 C.$
110 !.= 310 *.$
111 . 311 =.$
120 . 312 .$
121 .$ 313 C.!
130 .C 320 3.$
200 !.3 321 $.!
201 .* 322 #!.!
202 #.! 323 2!.!
210 .$ 330 #$.!
211 #.! 331 *$.!
212 2.! 332 !.!
220 #.! 333 *!.!
221 2.!