` degli Studi di Brescia Universita

` DI MEDICINA E CHIRURGIA FACOLTA Corso di studio in Fisiologia

Appunti non rivisti e non corretti dal docente

Dispensa per il corso di Fisiologia Cellulare

Autore:

Giorgio Maria Agazzi

I Edizione - Aprile 2012

Indice

Indice

I Fisiologia cellulare
1 Introduzione
1.1 Equilibrio idrico . . . . . . . . . . . 1.1.1 Compartimenti idrici . . . . . 1.1.2 Omeostasi . . . . . . . . . . . 1.1.3 Vie di controllo omeostatiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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2 La Diusione

2.1 Diusione semplice . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2 Le membrane . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2.2.1 Permeabilit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3.1 Propriet . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Meccanismo di selettivit 3.1.2 Gating . . . . . . . . . . . 3.1.3 Refrattariet . . . . . . . 3.1.4 Tutto o nulla . . . . . . . 3.2 Struttura . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Canali di tipo chimico . . 3.2.2 Le acquaporine . . . . . . 3.3 Carrier proteici . . . . . . . . . . 3.3.1 Regolazione . . . . . . . . 4.1 Il potenziale . . . . . . . . . . . 4.1.1 Potenziale di recettore . 4.1.2 Potenziale tutto o nulla 4.2 Potenziale a riposo . . . . . . . 4.3 Misura del potenziale . . . . . . 4.3.1 La pompa Na+/K+ . . 4.3.2 Analisi completa . . . . 4.4 Modello elettrico . . . . . . . . 4.5 Propriet passive . . . . . . . . 4.5.1 Sommazione temporale 4.5.2 Sommazione spaziale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

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3 Canali ionici

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4 Potenziale di membrana a riposo

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5 Potenziale d'azione

5.1 Caratteristiche . . . . . . . . . . . 5.1.1 Accomodazione . . . . . . . 5.1.2 Refrattariet . . . . . . . . 5.2 Meccanisimi ionici . . . . . . . . . 5.2.1 Canali voltaggio-dipendenti 5.2.2 Probabilit e inattivazione . 5.3 Propagazione e cinetica . . . . . . 5.3.1 Cinetica . . . . . . . . . . . 5.3.2 Propagazione . . . . . . . .

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6 Le sinapsi

6.1 Caratteristiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

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Indice 6.2 Sinapsi chimiche . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.2.1 Meccanismo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3 I 5 stadi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1 Legame e riconoscimento del neurotrasmettitore 6.3.2 Immagazzinamento del neurotrasmettitore . . . . 6.3.3 Tracking . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.4 Concentrazione del neurotrasmettitore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94 97 99 100 132 138 143

Bibliograa Elenco delle gure Elenco delle tabelle

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Appunti presi a lezione durante il corso di siologia cellulare (Prof Maioli esclusa la parte di siologia muscolare). La presente dispensa non deve essere vista ASSOLUTAMENTE come sostitutiva delle lezioni. Potrebbero essere presenti degli errori, potete segnalarli alla libreria CLUB per eventuali correzioni. Grazie

FISIOLOGIA CELLULARE

PARTE I

Introduzione
Indice

1.1 Equilibrio idrico . . . . . . . . . . . 1.1.1 Compartimenti idrici . . . . . 1.1.2 Omeostasi . . . . . . . . . . . 1.1.3 Vie di controllo omeostatiche

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Gli aspetti generali che riguardano lo studio della siologia sono diversi. La siologia lo studio del normale funzionamento di un organismo e delle parti che lo compongono. dicile e complesso lo studio della siologia perch ci sono due tipi di approccio fondamentali per lo studio importanti per arontarla nel modo giusto. Si ha un approccio di tipo integrativo: vogliamo sapere come funziona il corpo umano formato da molte parti, si parte dalla cellula no agli apparati con l'integrazione ultima tra questi. Lo studio verr diviso in pi parti con alcuni aspetti cellulari, si passer all'organizzazione dell'organo e si parler di apparato, che gi impone l'integrazione di concetti che derivano dal comportamento dei diversi organi, e inne si giunger all'integrazione funzionale tra i vari sistemi e apparati (liquidi extracellulari, pressione arteriosa ecc). Per questi tipi di regolazione non un solo apparato svolge il lavoro ma si ha l'integrazione tra i diversi apparati. Il sistema renale ad esempio ha un ruolo fondamentale per la regolazione della pressione arteriosa, cos come per il pH il rene e il sistema respiratorio. La dicolt sta nel riuscire a studiare le singole parti e poi fare uno sforzo nale di collegamento tra le diverse componenti. Siccome le modalit di risposta sono molto complesse soltanto una comprensione profonda di questi concetti e di queste nozioni aiuta a integrare il comportamento del nostro corpo in tante situazioni diverse. L'altro aspetto capire che bisogna avere un approccio di tipo meccanicistico, tutti i fenomeni degli organismi viventi per quanto complessi sono dipendenti da leggi siche e chimiche, bisogna capire il rapporto causa-eetto dei vari fenomeni siologici che si arontano. Bisogna sempre capire prima il come avvengono questi fenomeni e dopo il perch. Questo sembra banale ma non lo , ad esempio ci si pu chiedere perch aumenta la sudorazione durante l'esercizio sico. Spesso ci si accontenta di rispondere che necessario abbassare la temperatura e disperdere una quantit elevata di calore prodotto. Questo un approccio teleologico, si cerca di dare una spiegazione dei fenomeni in termini di fenomeni da raggiungere, il problema capire il 7

C a p i t o l o

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Introduzione

perch e il come aumenta la sudorazione in termini di rapporti causa-eetto. La pressione arteriosa viene mantenuta a livelli costanti ad esempio per consentire l'arrivo di sangue agli organi periferici e per vincere la resistenza dei vasi. Bisogna capire per se ci sono riessi o sistemi di controllo. Per la risposta siologica a questo quesito si evidenzia che si ha generazione di calore che provoca l'aumento di temperatura del sangue, si ha un aumento di termocettori ipotalamici, questo attraverso riessi ortosimpatici provoca un aumento di produzione di sudore nelle ghiandole sudoripare. Questo un approccio di tipo meccanicistico. Siamo organismi pluricellulari formati da tante cellule, ciascun gruppo di cellule svolge determinate funzioni, i globuli rossi ad esempio sono quasi pi di un terzo delle cellule del nostro organismo e sono capaci solo di trasportare l'ossigeno attraverso l'emoglobina che contengono, non potrebbero sopravvivere all'esterno del nostro organismo e sopravvivono perch l'organismo in toto in grado di dare sostentamento alle sue cellule. Le cellule sono specializzate e dipende dal corretto funzionamento di queste la salute dell'organismo nel suo complesso. I diversi tipi cellulari possiedono caratteristiche fondamentali comuni di tipo metabolico e non solo anche se hanno funzione e morfologia diversa. Tutte queste cellule sono molto poco tolleranti ad esempio a cambiamenti chimico-sici dell'ambiente extracellulare in cui vivono. Le necessit di tutte le nostre cellule sono simili, si ha bisogno di un ambiente circostante identico pressoch per tutti i tipi cellulari, non solo ma tutte queste cellule sono molto poco tolleranti a modicazioni anche piccole della composizione chimico sica dell'ambiente dove vivono.

Questo meccanismo stato compreso da Claude Bernard ed espresso come il concetto di mezzo interno. I sistemi siologici operano al ne di manenere all'interno del nostro corpo un ambiente costante nonostante il cambiamento delle condizioni esterne o di variazioni indotte. Questo concetto centrale per tutti i meccanismi siologici. Le cellule di fatto sono separate dalle inuenze esterne e sono protette dai uidi circolanti del corpo. Noi ci spostiamo nell'ambiente e quello che succede fuori dal nostro corpo molto vario, anche con cambiamenti drammatici ma essenziale che il nostro organismo a fronte di questi cambiamenti esterni riesca a mantenere l'ambiente interno (che corrisponde all'ambiente extracellulare delle cellule) il pi possibile costante. Il corpo separato dall'esterno da cellule tegumentarie protettive, esistono cellule di scambio che si trovano nei polmoni, nel'apparato digerente e nel rene attraverso le quali sostanze entrano ed escono dall'organismo, si ha all'interno un ambiente formato dal liquido extracellulare nel quale tutte le cellule del nostro organismo devono vivere. L'ambiente intracellulare organizzato dalla cellula stessa e la cellula pu organizzare il suo ambiente interno e l'esterno. Tutte le cellule del nostro organismo devono vivere in un ambiente extracellulare uguale in tutte le parti del nostro corpo. Fondamentalmente tutti i processi siologici sono in ultima analisi nalizzati a questo scopo, mantenere costante la composizione dell'ambiente extracellulare.

Figura 1.2: Azione del sistema cardiovascolare Figura 1.1: Scambio di liquidi a livello tissutale
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1.1. Equilibrio idrico

La centralit del sistema cardiovascolare

Questo possibile in un modo estremamente complesso ma il sistema cardiovascolare svolge un ruolo centrale. In tutte le parti del nostro corpo l'ambiente extracellulare ha composizioni molto simili anche se le cellule funzionano in modo molto diverso. Questo possibile perch il nostro sistema cardiovascolare assieme agli altri apparati che scambiano materie con l'esterno (i reni, l'apparato digerente e i polmoni) raggiunge cellule del nostro corpo che non distano pi di 50 m dal capillare pi vicino. I processi di scambio e diusione a livello capillare sono estremamente ecaci per distanze cos piccole, le cellule sono a una distanza dal vaso sufcientemente piccola per far si che la composizione dell'ambiente al di fuori di ogni cellula venga a mettersi in equilibrio con la composizione del plasma. Il plasma in altre parole ha una sua composizione mantenuta costante dai sistemi siologici e attraverso la circolazione sanguigna grazie alla rete capillare gli scambi sono talmente ecienti da fare in modo che la composizione del liquido extracellulare equipari quella plasmatica. Lo scopo ultimo si pu dire che sia quindi il mantenimento della composizione plasmatica prima e dei tessuti dopo. La circolazione elevata, nel nostro organismo abbiamo circa 5 litri di sangue e la gittata cardiaca di circa 5 litri al minuto a riposo, ogni minuto la massa circolante del sangue compie il giro intero dell'organismo e questa gittata pu aumentare di 5 o 6 volte durante l'esercizio sico. A questo punto possiamo chiederci qual il volume di liquido e di acqua che presente nei vari compartimenti del nostro organismo. Abbiamo un compartimento extracellulare che il mezzo interno che viene mantenuto costante, abbiamo un compartimento intracellulare che compito di ciascuna cellula e ogni cellula pensa a come gestirlo, abbiamo poi un compartimento plasmatico, il sangue che circola in equilibrio per gli scambi con l'ambiente e anche questo ha una sua compartimentazione all'interno del sistema cardiovascolare. Possiamo calcolare il volume di ciascun compartimento idrico dell'organismo per vedere i volumi relativi e le dicolt negli scambi.
1.1 Equilibrio idrico

volume. Se iniettiamo una quantit nota di sostanza in un sistema di cui ignoriamo il volume (volume x concentrazione) e aspettiamo che per processo diusivo questo liquido venga a occupare in modo uniforme l'intero volume del compartimento idrico avremo che per il principio della conservazione della massa la massa in A = alla massa in B raggiunto l'equilibrio, il volume dato dalla concentrazione diviso la massa. Volume A x concentrazione di A = volume B per concentrazione di B e si ricava la formula di cui sopra.

Massa acquosa
Ad esempio per la massa corporea totale di un individuo normopeso maschio di 70 chili la quota di acqua si pu misurare con il principio di diluizione. Si pu usare dell'acqua triziata radioattiva, in questo modo siamo sicuri che l'acqua si dionda liberamente in tutti i compartimenti, aspettiamo che la diusione sia completa e applichiamo il principio, vediamo che circa il 60% del volume coroporeo dato da acqua (ACT), l'acqua circa 42 litri su 70 chili per un individuo tipo. Se volessimo sapere la quota extracellulare e intracellulare di questa acqua dovremmo cercare una sostanza capace di diondere liberamente nell'ambiente extracellulare e che non sia capace di penetrare nelle cellule, si pu utilizzare ad esempio l'inulina, un polisaccaride esogeno sucientemente piccolo per diondere nell'ambiente extracellulare ma non in grado di entrare nelle cellule. L'acqua extracellulare (LEC) il 33% (14 litri) e il liquido intracellulare (LIC) il 66% circa (28 litri) di quest'acqua totale. Il sistema biologico deve mantenere costanti questi valori di LIC e LEC. Si pu ulteriormente analizzare quanta acqua diffonde nel sistema cardiovascolare, non esce dai vasi e non va nelle cellule, se prendiamo ad esempio Lalbumina marcata con iodio radioattivo, la iniettiamo e aspettiamo che si dionda vediamo che questa il 25% della LEC (3,5 litri). Applicando la formula dell'ematocrito, il rapporto fra parte corpuscolata e sangue totale che circa il 40% possiamo calcolare la quantit totale di sangue. Il plasma 3,5 litri, sapendo che l'ematocrito circa il 40% la quantit di sangue circolante circa 5 litri. In questo modo possiamo sapere il volume dei compartimenti idrici dell'organismo e quindi vediamo che il sistema corporeo tende siologicamente a mantenere costante la composizione dei 3,5 litri di plasma, il quale a sua volta attraverso la circolazione elevata mantiene costante la composizione del liquido extracellulare. Se andiamo a vedere la composizione per sommi capi del liquido intra ed extracellulare per la composizione ionica vediamo che quanto abbiamo detto corrisponde a realt. 9

1.1.1 Compartimenti idrici

Viene applicato il principio della diluizione per poter misurare il volume dei compartimenti idrici attraverso un procedimento semplice. Se riusciamo a iniettare in un contenitore (corpo) una certa quantit nota di sostanza capace di diondere liberamente in tutto il compartimento idrico di cui vogliamo misurarne il volume possiamo applicare la legge di conservazione della massa per misurarne appunto il

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Introduzione

Figura 1.3: Principio di diluizione

Figura 1.4: LIC e LEC

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1.1. Equilibrio idrico

Figura 1.5: LIC e LEC

variare il liquido extracellulare. Il sodio nel uido extracellulare elevato in concentrazione ed intorno ai 140-145 mM/litro mentre all'interno della cellula la concentrazione bassissima, variando da cellula a cellula. Per il potassio siamo all'opposto, all'esterno la concentrazione molto bassa, 4,4 mM mentre all'interno della cellula la concentrazione quasi uguale a quella del sodio all'esterno. Il calcio con una concentrazione esterna bassa intorno a 1,5 mM che per come rapporto di concentrazione molto superiore rispetto a quello delle cellule perch di calcio libero all'interno delle cellule non ce n' quasi (107 M). La concetrazione di calcio importante perch il calcio regola moltissime funzioni intracellulari.

Figura 1.6: Concentrazione ionica cellulare Concentrazione cationica

Possiamo osservare come la concentrazione di sodio, potassio, calcio, cloro, bicarbonato e altro sia praticamente quasi identica fra plasma e interstizio (misurata in milliequivalenti o mM/litro). Queste concentrazioni sono completamente diverse da quelle che troviamo all'interno delle cellule, ciascuna cellula provvede a mantenere le proprie concentrazioni interne particolari mentre il sistema non deve far

Concentrazioni anioniche
Analizzando le concentrazioni degli anioni il cloro molto abbondante all'esterno della cellula e quasi assente al suo interno, si ha un'inversione per quanto riguarda le proteine, all'interno della cellula gli anioni che devono controbilanciare i cationi presenti sono costituiti da proteine che in soluzione presentano cariche negative e costituiscono la fonte principale di anioni. Per questo le proteine sia per le loro dimensioni che per le loro cariche risultano intrappolate all'interno e non possono uscire dalla cellula. Esiste un'enorme dierenza di concentrazione ionica all'interno e all'esterno della cellula e in realt esiste un'identit tra plasma e liquido interstizia11

1.

Introduzione

le, tutti i processi siologici sono nalizzati a fare introduciamo in quantit di circa 10,5 g tramite la in modo che queste concentrazioni non varino come dieta ma questa quantit varia enormemente con la dieta che possiamo seguire. Le uscite sono tramicaratteristiche sico-chimiche. te urina, feci e sudore, il sudore non regolato e la sua produzione dipende dall'attivit sica, quello con le feci neanche perch non sottoposto ad Questo il concetto di omeostasi che deriva da quel- un controllo centrale, l'urina controllata e adatta lo di mezzo interno. La capacit di mantenere l'am- esattamente la quantit di sodio che ingeriamo con biente interno relativamente costante un meccani- la dieta espellendone la precisa controparte. A sesmo fondamentale degli organismi viventi e pren- conda della misura di positivit o negativit della de il nome di controllo omeostatico, nel nostro or- bilancia possiamo osservare eetti sistemici anche ganismo ci sono meccanismi creati per evitare che gravi. Legata alla quantit di sodio abbiamo legata parametri specici subiscano variazioni di rilievo. la quantit di acqua, si ha un aumento di espanQuesto pu avvenire grazie a un meccanismo sem- sione idrica e un aumento della pressione arteriosa plicato: qualunque cambiamento esterno produce per aumento della quantit di Na+. Non si parla in tendenzialmente un cambiamento interno il quale questo caso di concentrazione per di sodio ma di innesca una reazione che tende e ripristinare lo stato quantit totale. normale, ad annullare il cambiamento interno. Oltre a esserci un bilancio stabile occorre che ci siano meccanismi di controllo che verichino che la variabile non subisca cambiamenti di rilievo. Questi sono meccanismi di controllo a feedback negativo e tendono a stabilizzare la variabile in direzione opposta al cambiamento iniziale.

1.1.2 Omeostasi

Controllo a feedback negativo

Uno stimolo iniziale produce una risposta che tende a ridurre lo stimolo che l'ha provocata. Per mantenere costante la temperatura con un feedback negativo bisogna avere un sensore che misuri la temperatura, se non siamo in grado di misurarla non possiamo avere meccanismi di regolazione della variabile, abbiamo quindi recettori che misurano la variabile omeostatica da controllare. Questo parametro misurato dal recettore deve essere inviato da una via aerente nell'organismo, il pi delle volte queste sono vie nervose o sostanze circolanti. Il controllore un termostato chiamato centro di integrazione che potrebbe essere molto lontano rispetto alla posizione del sensore e del recettore, questo deve confrontare il valore misurato dal recettore con un parametro chiamato set point, un valore desiderato al quale bisogna mantenere il dato parametro. Il centro di integrazione quando il valore controllato si allontana dal set point produce un segnale di errore, si ha poi una via eerente che porta il segnale di correzione e un eettore che porter una risposta che antagonizza lo stimolo che ha prodotto la variazione. Questo schema si pu indicare con un comparatore che fa la dierenza tra un uscita richiesta e desiderata con un valore che misura l'uscita eettiva misurata da un recettore. Si ha un'operazione di sottrazione del segnale che viene sottratto dal comparatore. Sottraendo l'uscita richiesta dall'uscita eettiva avremo il segnale di errore misurato quantitativamente, questo viene inviato a un sistema di controllo (ad esempio l'ipotalamo), abbiamo un centro di controllo che genera molti segnali e controlli

Figura 1.7: Il concetto di bilancio

I principi fondamentali che permettono questa omeostasi sono diversi. Innanzitutto in generale ci deve essere un'equivalenza tra le entrate e le uscite di una determinata sostanza. Se introduciamo una sostanza senza eliminarla questa aumenta ovviamente di concentrazione all'interno dell'organismo, se la eliminiamo al contrario avremo un depauperamento di questa. Si parla di concetto di bilancia o bilancio omeostatico. Per il nostro organismo dobbiamo aggiungere una variabile, per alcune sostanze dobbiamo considerare che queste possono essere prodotte, il bilancio neutro quindi se la loro entrata e la loro produzione uguale alle loro uscite. Possiamo avere un bilancio quindi positivo, negativo o stabile a seconda se siano maggiori le entrate, le uscite o nessuna delle due. Per molte sostanze la produzione nulla e quindi non siamo in grado di produrle, ad esempio il sodio. Uno dei ruoli principali del rene fare in modo che il sodio rimanga costante in concentrazione all'interno del nostro organismo. La quantit di sodio che entra nell'organismo deve essere uguale a quella che esce, noi lo 12

1.1. Equilibrio idrico

Figura 1.8: Feedback negativo

inviati al sistema controllato che attivano degli effettori. Per la temperatura ad esempio si ha poi l'attivazione di tante risposte diverse (produzione di sudore ecc. . . ). po ultimo di tutti i sistemi siologici mantenere costanti le caratteristiche sico-chimiche del mezzo interno che corrisponde all'ambiente extracellulare dove vivono le cellule del nostro corpo. Supponiamo analizzando in un graco nel tempo di volere una certa uscita per una variabile prescelta regolata. Se improvvisamente abbiamo una perturbazione che agisce sul sistema controllato per un certo periodo di tempo questa tende in assenza di un segnale di feedback a spostare un'uscita a un valore molto superiore (assenza di sensori). Se invece questo sistema a feedback agisce abbiamo una risposta complessa, abbiamo spesso un'oscillazione dell'uscita che tende a scostarsi dal valore desiderato e poi questa viene corretta e tende a spostarsi a un valore nettamente pi vicino all'uscita richiesta che non in caso di assenza di feedback. Il sistema a feedback negativo riduce enormemente attraverso la correzione l'errore, la dierenza tra uscita richiesta e il valore che avremmo senza feedback, ma l'errore non viene annullato del tutto. Praticamente tutti i sistemi a feedback negativo con qualche piccola eccezione riducono il pi possibile l'errore ma non lo annullano mai completamente. Si introduce il concetto di guadagno del sistema come il rapporto tra 13

Figura 1.9: Errore nel feedback negativo

I sistemi di controllo a feedback negativo sono sistemi di controllo essenziali per mantenere l'omeostasi, per fare in modo che la variabile sotto controllo omeostatico si discosti il meno possibile da un valore desiderato chiamato set point. Questo un sistema di controllo fondamentale perch lo sco-

1.

Introduzione

l'entit della correzione e l'errore che rimane alla ne della correzione, un sistema a guadagno molto alto allo stato stazionario mantiene un piccolissimo errore, al contrario un sistema a guadagno basso. Ad esempio per la temperatura possiamo vericare che una perturbazione di circa 25-30in un sistema a feedback porta a uno spostamento di circa 1 grado centigrado. C' un errore perch la temperatura non rimane costante ma il guadagno del sistema di circa 25-30, una correzione di 25-30 in funzione di un errore residuo di un solo grado. Se andiamo a vedere la pressione arteriosa il guadagno soltanto di 2, di fronte a una correzione di 20 mmHg di pressione arteriosa media l'errore che rimane di circa 10 mmHg e ha un guadagno molto basso come sistema di correzione a breve termine. Ci sono poi per altri sistemi come per esempio il sistema renale che controlla il volume del liquido extracellulare e qui il guadagno elevatissimo, pu essere considerato innito, non lo ma talmente alto che l'errore residuo dopo giorni annullato ( un meccanismo per che come svantaggio ha quello di essere molto lento). Diversi sistemi di feedback hanno quindi guadagni molto diversi, alla ne comunque in ogni caso rimane un errore, il feedback negativo per sua natura non pu annullare completamente l'errore introdotto nella perturbazione del sistema.

livello quindi il guadagno fa pi danni che beneci. Anch il sistema sia in equilibrio le entrate devono essere uguali alle uscite, e nel caso del sodio l'uscita controllata dai reni che controllano il sodio in uscita espulso con le urine. Ipotizziamo diverse entrate di sodio in giorni diversi. Se somministriamo il doppio di sodio l'entrata doppia subito ma l'uscita cambia pi gradualmente e cambia poco per volta nei vari giorni successivi. Il rene un sistema molto potente ma con un tempo di reazione molto lento. Dal 4giorno in poi la quantit di sodio escreta uguale a quella di sodio ingerita, in quei giorni per in cui il fenomeno era instabile la quantit escreta era inferiore a quella ingerita e si sar avuto un accumulo di sodio progressivo all'interno del nostro organismo, si viene a creare un errore. Allo stato stazionario il rene quindi grado di eliminare il sodio ingerito ma questa aumentata escrezione di sodio mantenuta da questo errore della quantit di sodio totale che nei giorni precedenti era aumentata.

Controllo a feedback positivo

Esistono siologicamente anche sistemi di feedback di tipo positivo. Il segnale di feedback invece di sottrarsi al comparatore all'uscita richiesta si aggiunge. Questo sistema non ha pi una valenza quindi di tipo omeostatico, non riesce a mantenere costante una variabile ma al contrario un sistema che genera instabilit. Se si verica una perturbazione del sistema e uno stimolo iniziale che sposta l'uscita dal valore iniziale questa variazione produce un segnale di feedback che aggiungendosi allo stimolo iniziale produce un aumento continuo dell'uscita attraverso un meccanismo che si autogenera e si autoalimenta. La variabile di uscita deriva a valori sempre pi alti e nei sistemi biologici si ha un livello di saturazione oltre al quale non si pu andare. Ci sono molti sistemi siologici a feedback positivo, lo stimolo iniziale produce una risposta che aumenta lo stimolo ad azione positiva e il circuito si autoalimenta no a raggiungere un plateau, sono necessari fattori esterni per bloccare l'azione positiva e portare il sistema alla posizione originaria. Ad esempio se analizziamo il parto questo avviene per contrazione della muscolatura uterina, la distensione della cervice uterina portata dalla testa del feto stimola la produzione di ossitocina che a sua volta stimola le contrazioni ancora maggiormente. L'evento esterno che blocca questo meccanismo l'avvento del parto. Ad esempio il potenziale d'azione viene generato da meccanismi autorinforzanti del tipo tutto o nulla generati da feedback positivo. Le secrezioni gastriche di pepsina sono altri esempi di controllo a feedback positivo.

Figura 1.10: Errore nel feedback del sodio

Come mai allora tutti i sistemi non hanno un guadagno elevato? Una delle ragioni data dal fatto che quando il sistema a feedback viene attivato da una perturbazione improvvisa abbiamo un'oscillazione smorzata pi o meno rapidamente della variabile in uscita. Questo semplicando molto avviene perch i ritardi insiti nei sistemi biologici sono responsabili di questa risposta oscillatoria, ci vorr del tempo che in alcuni casi potr essere considerevole perch il sistema misuri la variazione, perch il segnale venga inviato ecc. . . le risposte quindi possono non essere molto congrue all'eetto voluto dato da questi ritardi e si ha un'instabilit del sistema (magari la temperatura nel mentre gi scesa a valori accettabili). Quanto pi il guadagno alto in presenza di ritardi di trasmissioni tanto maggiore sono queste oscillazioni e tanto pi rischiosa una situazione di instabilit del sistema. Oltre un certo 14

1.1. Equilibrio idrico

Figura 1.11: Feedback positivo

Figura 1.12: Feedforward Controllo a feedforward

Abbiamo un'altra situazione di controllo estremamente importante. La caratteristica del feedback negativo quella di correggere un errore una volta che questo si vericato quando l'errore non predicibile, quando il sistema non si aspetta una perturbazione. Vi sono moltissimi casi in cui l'organismo in grado di predire un'uscita e un errore in uscita dal sistema. Ad esempio la postura corretta mantiene il centro di massa all'interno della base dei piedi. Se una persona ci urta interviene un sistema miotatico di riesso a feedback negativo per cui lo spostamento stira i muscoli posteriori e questo il segnale generato dai fusi neuromuscolari che inviano l'informazione. Perturbazioni generate dal nostro stesso movimento vengono regolate prima di produrre errori. Se misuriamo l'attivit elettromiograca dei muscoli posteriori della gamba questi vengono attivati involontariamente prima ad esempio dei movimenti del braccio in anteroposizione, ci sono aggiustamenti anticipatori attivati ogni qual volta la perturbazione predicibile, il sistema non aspetta che la perturbazione si verichi ma anticipa la perturbazione dell'errore impedendo che l'errore si verichi. Siamo di fronte in questo caso a circuiti a feedforward o anticipatori, per poterli eettuare nel nostro caso il nostro sistema deve avere insito un modello interno del sistema sulla base del quale pu predire la perturbazione che una determinata azione avr sul sistema controllato. I sensori e i recettori sono importanti ma semplicemente per misurare le variabili di stato del sistema. Ci sono molti esempi di questo tipo. Ad esempio durante la corsa chemocettori prevedono l'aumento 15

1.

Introduzione

di CO2 e aumentano la ventilazione prima che la CO2 aumenti nel sangue. Solitamente coesistono i sistemi feedforward che danno una correzione grossolana e i sistemi a feedback negativo che danno una correzione ne del cambiamento. La regolazione della glicemia viene controllata dall'insulina, sicuramente le cellule del pancreas che producono insulina la producono quando la glicemia sale per riportare il livello di glucosio nel sangue alla norma. In realt quando un pasto ricco di glucidi raggiunge il duodeno, il duodeno secerne degli ormoni come colecistochinina e il GIP che hanno azione di stimolare direttamente le cellule di Langherans del pancreas, inducono aumento della secrezione di insulina prima che la glicemia si sia elevata, quando lo zucchero riconosciuto nel tratto intestinale. Il sistema a feedback negativo pi preciso interverr dopo in un secondo momento per dare origine a una risposta regolatoria pi ne. La risposta anticipatoria potrebbe non essere adeguata e i sistemi feedforward (o a catena aperta) sono soggetti a errori maggiori. La costanza di una variabile non deve essere intesa in valore assoluto, esiste un ambito di variabilit che pu essere considerato siologico, spesso questi sistemi agiscono per raggiungimento di una soglia di discostamento dal valore di controllo. A volte il sistema di controllo agisce cambiando il set point di una variabile. Attraverso un sistema a feedback negativo possiamo pilotare dei cambiamenti della variabile di uscita cambiando l'uscita richiesta, il set point. Si parla in questo caso di servocontrolli dal punto di vista della teoria dei sistemi. Anche nell'uomo, ma nella donna a maggior ragione, la temperatura nei vari momenti della giornata o nell'arco del ciclo mestruale cambia, nel periodo preovulatorio pi bassa che non nel periodo postovulatorio raggiungengo valori minimi prima del risveglio. La temperatura qui cambia non per un errore che non viene corretto ma perch il sistema impone un setpoint diverso nelle varie fasi della giornata o del mese, i centri ipotalamici controllano la temperatura e cambiano questo valore.

ottenuto attraverso meccanismi locali di metaboliti, ad esempio l'intervento dell'adenosina. Vi sono altri meccanismi che richiedono risposte riesse nei quali il sensore e il recettore sono situati in un punto, questo recettore attraverso vie aerenti lunghe, tipicamente le vie nervose, manda informazioni a un centro di controllo e da qui nasce una risposta che attraverso vie eerenti lunghe agisce su eettori magari lontani dal sensore che ha misurato lo scostamento. Ad esempio la pressione arteriosa media viene misurata da sensori situati nei seni carotidei o nell'arco dell'aorta. Questa informazione viene inviata all'encefalo e si inducono modicazioni della pressione agendo su tutto l'organismo inuenzando il calibro di vasi e arteriole.

1.1.3 Vie di controllo omeostatiche

Dal punto di vista dell'implementazione sica di questi sistemi possiamo distinguere due grandi categorie di sistemi di controllo, sistemi di controllo locale e sistemi di controllo riesso o a lunga distanza. Nel controllo locale il meccanismo a feedback negativo si estrinseca in una parte ristretta di tessuto, localmente il tessuto e i sensori misurano una variabile e modicano la risposta nelle immediate vicinanze dello stimolo e della perturbazione. Per esempio l'irrorazione sanguigna di un tessuto dipende dal metabolismo locale, se il metabolismo aumenta l'irrorazione locale aumenta anch'essa, questo viene 16

Figura 1.14: Comunicazione cellulare Meccanismi di comunicazione

Per poter produrre queste risposte locali o riesse evidente che ci devono essere dei meccanismi di comunicazione cellulare. Risposte locali si basano sui vari tipi di comunicazione intercellulari, in particolare le cellule rilasciano sostanze chimiche all'esterno che diondono nell'ambiente circostante e vanno ad agire o sulla stessa cellula o su cellule vicine, in particolare sulle cellule con recettori sulla membrana in grado di riconoscere la sostanza rilasciata. Si

1.1. Equilibrio idrico

Figura 1.13: Vie di controllo omeostatiche

parla di meccanismi autocrini o paracrini a seconda che il recettore agisca sulla stessa cellula o sulle cellule vicine. Questi sono ovviamente meccanismi di controllo locali perch il messaggero non pu agire su grandi distanze (ad esempio l'irrorazione sanguigna che si adatta al metabolismo locale). I meccanismi riessi richiedono altri sistemi, i fondamentali sono il sistema di trasmissione ormonale e il sistema nervoso. Il segnale nel sistema ormonale viene rilasciato da una cellula endocrina ed un segnale chimico (ormone), passa nel torrente circolatorio e raggiunge tutte le cellule del nostro organismo, la risposta sar soltanto a carico di quelle cellule che avranno un recettore in grado di riconoscere questo segnale. Le cellule senza un recettore adeguato non risponderanno. Questo un segnale potente perch da un solo punto si pu raggiungere tutto l'organismo ma lo svantaggio che il sistema molto lento. Molte volte abbiamo bisogno di risposte molto pi rapide e in questo caso agisce il sistema nervoso, il meccanismo analogo con l'utilizzo di sostanze chimiche rilasciate e queste agiscono su cellule con recettori in grado di riconoscerle. Il segnale rilasciato a livello locale tramite le sinapsi, la risposta localizzata ed ha il vantaggio di essere estremamente rapida. Si ha anche la trasmissione neuroormonale, nell'iposi posteriore ci sono dei neuroni che rilasciano come fosse un neurotrasmettitore una sostanza nel torrente, un ormone che va ad agire su tutto il nostro organismo. La risposta del bersaglio dipende dal tipo di recettore. La risposta sempre determinata non dalla sostanza chimica che agisce come neurotrasmettitore o come ormone ma dal recettore situato sulla cellula che riconosce questo segnale chimico. L'informazione non di per s eccitatoria o inibitoria ma il sistema pu essere eccitatorio su alcuni organi e inibitorio su altri perch la risposta non determinata dalla sostanza ma dal recettore che la riconosce. L'adrenalina ha nella maggior parte dei casi azione vasocostrittrice perch molti vasi hanno recettori di tipo , altri vasi hanno recettori che riconoscono sempre l'adrenalina ma l'eetto sar vasodilatazione. Se un sistema nervoso ha un'azione di un tipo non si deve pensare che non possa avere azione opposta. L'azione simpatica fondamentalmente costrittrice sulla muscolatura liscia dei vasi per contrazione della tonaca muscolare. L'azione pu essere anche per vasodilatatoria perch molti sistemi possiedono un tono di attivazione di base, a riposo senza interventi dall'esterno il simpatico produce una scarica tonica che produce un livello intermedio di contrazione dei vasi. Se aumentiamo il tono simpatico produciamo 17

1.

Introduzione

Figura 1.15: La risposta dipende dal recettore

Figura 1.16: Azioni del sistema nervoso

18

1.1. Equilibrio idrico vasocostrizione, se riduciamo il livello di attivazione tonica abbiamo una vasodilatazione. Nella maggior parte dei casi abbiamo questa regolazione quando abbiamo un tono medio mantenuto nel tempo che pu essere aumentato o diminuito.

19

La Diffusione
Indice

2.1 Diusione semplice . . . . . . . . . . . 21 2.2 Le membrane . . . . . . . . . . . . . . 23 2.2.1 Permeabilit . . . . . . . . . . 23

Figura 2.1: La diusione semplice

2.1

Diffusione semplice

Il primo processo che andiamo a considerare il processo della diusione semplice, un processo importante che coinvolge tantissimi fenomeni siologici, il processo di gran lunga principalmente coinvolto attraverso il quale le sostanze entrano e raggiungono le cellule, attraverso il quale i neurotrasmettitori raggiungono le cellule sinaptiche e i gas vengono scambiati a livello del polmone. Il processo di diusione il processo per il quale se abbiamo una dierenza di concentrazione di una sostanza in due ambienti spontaneamente avviene che questa si sposti dall'ambiente a pi alta concentrazione a quello a pi bassa concentrazione, ad esempio come accade per un soluto in una soluzione. Questo no a quando la concentrazione del soluto non la stessa in tutti i punti della soluzione. Ci si ha per un motivo semplice e intuitivo. A causa del calore e della temperatura presente nella soluzione tutte le particelle di soluto e solvente si muovono in tutte le direzioni, si parla di agitazione termica delle particelle, un moto browniano perch casuale. Supponiamo di avere una situazione inziale con due compartimenti e il soluto tutto in un compartimento 1 e assente in un compartimento 2. Se le 21

C a p i t o l o

2.

La Diffusione

particelle si muovono ci sar un numero di particelle che sconneranno dal compartimento 1 a quello 2. Questi movimenti casuali fanno si che una certa quantit di soluto si sposti con un usso netto tra il compartimento a maggior concentrazione a quello a minore concentrazione. Questo usso spontaneo di particelle che sar tanto pi elevato tanto maggiore la temperatura perch gli spostamenti sono pi veloci far si che la concentrazione nel compartimento 1 tenda a diminuire e nel compartimento 2 invece ad aumentare. Nella fase intermedia avremo particelle che andranno da entrambi i compartimenti in quello opposto. Statisticamente saranno pi le particelle che andranno da quelle a maggior concentrazione a quelle a minore che non il contrario no a che le due concentrazioni non saranno uguali. Il usso a questo punto non cessa ma i due ussi statisticamente sono equivalenti, arriveremo a una situazione di equilibrio dinamico, parliamo di usso netto di soluto e non di usso. Il usso netto sar uguale a 0 nel caso di equilibrio ma il usso non sar zero, sar invece uguale per entrambi i versi.

Figura 2.2: Velocit di diusione

La legge di Fick

radice quadrata del peso molecolare. Una molecoLa legge che misura l'entit di questo usso data la pi grossa dionde pi lentamente di una pi piccola a parit dalla legge di Fick, il usso netto dato da di altre condizioni. A la supercie di scambio, D il coeciente di diusione e dipende dalle caratteristiche del soluto e del solvente e viene moltiplicato per la dierenza di concentrazione, si ha un dierenziale perch la variazione di frequenza continua, nel nostro caso se la dierenza un usso netto si utilizza un c su x. Il fatto che una molecola dionda pi o meno facilmente dipende da una formula RT proporzionale all'energia cinetica delle molecole. Al denominatore vediamo una costante, quanto pi la molecola piccola tanto pi elevata la velocit del processo diusivo, tanto maggiore la quantit di soluto che si sposta a parit di dierenze di concentrazione. Le molecole di soluto hanno collisioni continue con le molecole di solvente, se il solvente molto denso gli urti saranno pi frequenti invece che in un ambiente meno viscoso come l'aria. L'ossigeno nell'aria dionde molto pi rapidamente di quanto non faccia ad esempio nel plasma.
D = RT /(6r ) = (f lussonetto) = AD(dc/dx) V el 1/ P M

C' un grandissimo numero di scambi nel nostro organismo che avvengono per processi diusivi, per esempio a livello dei tessuti una sostanza uisce dai capillari alla cellula solo se nella cellula c' una concentrazione inferiore a quella che c' nel plasma, vero anche il contrario, certe sostanze uiscono dal citoplasma al capillare e all'interstizio. Il glucosio viene consumato dalla cellula, diminuisce la concentrazione e il gradiente di concentrazione favorisce il usso dal capillare dove la concentrazione pi elevata verso la cellula dove la concentrazione meno elevata. Il meccanismo ecace o ci sono delle limitazioni? La limitazione principale unicamente la distanza, i processi di diusione semplice sono estremamente veloci ed ecienti quando le distanze in gioco sono piccole. La relazione di Einstein determina che il tempo medio che impiega una molecola di soluto a spostarsi da un punto all'altro funzione del quadrato della distanza
T 1/2 = X 2 1/2/D

La legge di Graham
Un'altra legge per la diusione la legge di Graham sulla diusione. Questa si applica soprattutto per la diusione di gas in aria e nell'ambiente. Il gas espande nell'ambiente e si pu dimostrare che la velocit di questa diusione proporzionale inversamente alle dimensioni della molecola ma alla 22

Se la distanza raddoppia quindi il tempo medio di spostamento diventa quattro volte maggiore. Questo ha un'implicazione molto importante. Prendiamo il coeciente di diusione per esempio di una molecola di ossigeno. Il tempo di diffusione medio per una cellula di 10 m di circa 50 msec. La distanza massima di una cellula dal capillare 50 m, per percorrere queste distanze nell'ordine delle decine di m il tempo impiegato

2.2. Le membrane di poche decine di millisecondi. Mediamente il sangue impiega circa un secondo a percorrere un capillare. Bastano poche decine di millisecondi anch avvengano gli scambi e quindi per queste distanze lo scambio per i processi diusivi estremamente eciente. In condizioni siologiche il processo diffusivo non mai fattore limitante per gli scambi tissutali date le piccole distanze che entrano in gioco. Se andiamo a distanze maggiori e passiamo a mm o cm siccome il tempo di diusione aumenta con il quadrato i tempi si dilatano in modo abnorme, il sistema cardiovascolare per compensa questa limitazione. In una sinapsi lo spazio dell'ordine del decimo di m e anche qui lo spostamento avviene per diusione no a raggiungere il recettore. Gli spazi sono talmente piccoli che i tempi sono dell'ordine di pochi microsecondi. Ad ogni sinapsi si ha un ritardo di un millisecondo ma questo non dovuto a processi diusivi perch in 5 microsecondi il neurotrasmettitore in grado di diondere dal bottone sinaptico alla cellula postsinaptica.
2.2 Le membrane

2.2.1 Permeabilit
Tutto ci detto nora si riferisce alla diusione in assenza di barriere. Quando parliamo di cellule o capillari questi sono separati da delle barriere, per le cellule ad esempio la membrana cellulare composta per la maggior parte da lipidi. Fondamentalmente una membrana formata da molecole lipoliche o idrofobiche, grassi o fosfolipidi con testa polare all'esterno e coda idrofobica all'interno. Anch una certa sostanza possa diondere attraverso una membrana occorre che questa molecola possa sciogliersi all'interno del doppio strato Figura 2.3: Diusione attraverso le membrane lipidico, deve essere quindi una sostanza idrofobica o lipolica. Una molecola polare come uno ione o un AA, che presenta un accumulo di cariche sulla supercie non in grado di passare il doppio strato lipidico e ha maggiore dicolt a passare. La legge di Fick deve essere adattata alla diusione quando questa avviene attraverso le membrane plasmatiche. Entra in gioco un parametro importante che la liposolubilit delle sostanze. Si misura il coeciente di membrana in funzione della liposulibilit e viene utilizzata come unit di misura il coeciente di ripartizione tra acqua e olio di oliva, se una sostanza si scioglie meglio in olio liposolubile mentre se si scioglie nell'acqua idrosolubile. Operativamente si mette in un contenitore sia acqua che olio e si vede dove questa si scioglie meglio. Il coeciente di permeabilit aumenta tanto maggiore il coeciente di distribuzione tra olio e acqua, l'urea meno liposolubile ad esempio dell'etanolo (come graco sulle y abbiamo il coeciente Figura 2.4: Graco del coeciente di ripartizione permeabilit in mxs1 , sulle x il k cio il coe23

2.

La Diffusione

ciente di ripartizione). A parit di liposolubilit le Va aggiunto che il fatto che ai lati di una memmolecole pi piccole sono pi diusive. brana o di una barriera di diusione ci sia una difQuando applichiamo la legge di Fick alla ferenza di concentrazione di un certo soluto, questo rappresenta una sorta di energia potenziale chimica membrana abbiamo una formula corretta che responsabile del fatto che si venga a creare = A P (Cest Cint ) Non abbiamo pi un dierenziale perch le con- spontaneamente il usso da un ambiente a pi alcentrazioni sono discrete e ci basta considerare la ta concentrazione a uno a pi bassa concentrazione. dierenza di concentrazione dato che questa cambia Questa una energia potenziale chiamata potenziain modo brusco. P il coeciente di permeabilit le chimico direttamente proporzionale al logaritmo naturale della concentrazione. della membrana ed dato da
P = (kDm)/d = RT (ln(C 1) ln(C 2))

D il coeciente di diusione attraverso i lipidi di membrana della sostanza ed proporzionale a k che il coeciente di ripartizione tra olio di oliva e acqua e al grado di liposolubilit fratto d che lo spessore della membrana. Se la membrana spessa la sua permeabilit sar inferiore che non per una membrana sottile. Possiamo concludere che P direttamente proporzionale alla solubilit nei lipidi e inversamente proporzionale alla dimensione della molecola. Ossigeno e CO2 sono molecole molto piccole e molto liposolubili perch hanno un'elevata permeabilit di membrana, il glucosio o le sostanze polari sono poco liposolubili e grandi, attraversano la membrana con molta dicolt. La legge di Fick sulla diusione semplice si applica alla membrana cellulare tipica e viene modicata nel caso di membrane lipidiche. Il usso dipende dalla dierenza di concentrazione, dalla supercie e da P che il coeciente di permeabilit della membrana nel quale oltre al coeciente di diusione compare k, il coeciente di liposolubilit della sostanza, la facilit con cui la sostanza pu sciogliersi all'interno del doppio strato lipidico. Il k inversamente proporzionale al raggio, la permeabilit quindi direttamente proporzionale alla solubilit nei lipidi e inversamente proporzionale alla dimensione della molecola, tanto pi questa piccola tanto pi facilmente passa attraverso alla membrana. Quando parliamo di usso attraverso membrane noi ci riferiamo e sottintendiamo sempre un usso netto, in quanto abbiamo gi sottolineato che in realt le molecole di soluto continuano a passare in entrambe le direzioni della membrana perch passano tramite movimenti browniani di agitazione termica per cui c' sempre una certa quantit di soluto che passa dall'ambiente a pi alta contentrazione a quello a pi bassa e una quantit che lo fa nel verso opposto. Ovviamente per motivi statistici la quantit di soluto che passa dall'ambiente a pi alta concentrazione a quello a pi bassa concentrazione nettamente maggiore e dalla sottrazione dei due ussi abbiamo il usso netto, il usso misurato dalla legge di Fick. Quando parliamo di usso attraverso la membrana ci riferiamo sempre al usso netto tenendo presente che il passaggio di sostanza avviene sempre in entrambe le direzioni. 24

oppure Questo pu essere interpretato come il lavoro necessario da compiere per trasportare una mole di soluto dal compartimento a pi bassa concentrazione a quello a pi alta concentrazione. Con una dierenza di concentrazione il potenziale tende a produrre spontaneamente senza utilizzo di energia passaggio di sostanze tra i due compartimenti, questa andr per nel tempo a dissiparsi e si raggiunger un equilibrio con parit di concentrazione in entrambi i compartimenti. Se in un sistema biologico viene mantenuta nel tempo questa dierenza di concentrazione questo deve essere un sistema attivo che consumando energia metabolica continua a mantenere questa dierenza di concentrazione nel tempo. Il lavoro che questo meccanismo attivo spesso chiamato pompa metabolica deve fare misurato da una dierenza di potenziale chimico. Una dierenza di concentrazione produce un usso di sostanza passivo ma evidente che questa pu essere mantenuta solo se esiste un meccanismo attivo che consumando energia mantiene nel tempo questo gradiente di concentrazione. Questa equazione sar molto importante per capire come viene generato il potenziale di membrana in tutte le nostre cellule. Consideriamo l'equazione di Fick, k rappresenta la solubilit nei lipidi, soltanto le sostanze liposolubili possono passare pi o meno facilmente attraverso la membrana. Nel nostro organismo ci sono molte sostanze di grande interesse biologico come gli ioni che sono molto poco liposolubili, ioni che possono essere scambiati dai vari lati della membrana ed grazie a questi che sono possibili i fenomeni elettrici cellulari. I nutrienti come glucosio, aminoacidi e urea presentano cariche elettriche sulla loro supercie e quindi necessariamente hanno una scarsa solubilit nei lipidi, sono idroli e hanno molta dicolt a passare attraverso il doppio strato fosfolipidico. Se andiamo a vedere la permeabilit di alcune sostanze idroliche in una membrana sintetica costruita in laboratorio con fosfolipidi senza strutture proteiche vediamo che eettivamente la permeabilit della membrana sintetica fatta solo da fosfolipidi bassissima (1011 , 1010 ). Se andiamo a vedere per la permeabilit di membrana in una membrana biologica, ad esempio la membrana eritrocitaria,
C1 = RT (ln C 2)

2.2. Le membrane vediamo che la permeabilit aumenta enormemente (104 , 105 rispettivamente per cloro e glucosio). Le membrane biologiche hanno quindi la possibilit di far passare le sostanze polari idroliche che non possono passare attraverso la membrana direttamente come ossigeno, anidride carbonica e colesterolo. La membrana riesce a far passare queste sostanze grazie a strutture proteiche specializzate che permettono il passaggio anche di sostanze idroliche, si tratta di capire i meccanismi di base attraverso i quali le sostanze idroliche riescono a passare attraverso le membrane biologiche. Dobbiamo considerare due classi di sistemi di trasporto. idrolico nel quale uno ione pu passare. Questa una struttura semplicata batterica ma i pori hanno la caratteristica comunque di poter permettere il passaggio di una sostanza polare senza modicazioni di struttura, una volta che questo canale aperto per conformazione la molecola polare in grado di passare questo poro senza che la proteina subisca nessuna modicazione strutturale. La caratteristica di questi canali non quella di far passare o meno sostanze ma di produrre una notevole selettibilit, far passare alcuni ioni piuttosto che altri. Questa possibilit di selezionare alcune sostanze escludendone altre, in particolare ioni perch questi canali sono utilizzati unicamente per far passare ioni e acqua (acquaporine) consentita solo per ioni di piccole dimensioni e sostanze piccole. possibile per esempio selezionare il potassio piuttosto che il calcio ma quando passiamo a sostanze polari pi grosse e complesse come glucosio e AA il problema diventa pi serio perch non soltanto il canale dovrebbe riconoscere la sostanza ma dovrebbe inoltre impedire il passaggio indiscriminato di altre sostanze piccole. Esiste quindi un altro meccanismo di trasporto chiamato trasporto mediato da carrier proteici che sono molecole di membrana molto pi grosse che hanno la caratteristica di permettere il passaggio delle sostanze polari attraverso un cambiamento conformazionale della loro struttura. Abbiamo molecole che al loro interno presentano un recettore in grado di riconoscere specicamente una data sostanza o molecola ed escludere dal legame molecole diverse, una volta che la molecola trova il suo sito recettoriale e deve essere trasportata nella proteina questa induce un cambiamento conformazionale della proteina che apre il suo interno dall'altra parte della membrana e permette il passaggio della sostanza. I due sistemi sono molto diversi, il secondo permette selettivit notevole anche per molecole di grosse dimensioni ma il meccanismo di cambiamento conformazionale fa si che il passaggio di sostanze sia estremamente pi lento rispetto a quello che si pu ottenere nei canali ionici, una volta che lo ione trova il canale la velocit con cui pu passare estremamente elevata.

Figura 2.5: Struttura della gramidicina

I primi sono i canali proteici o canali ionici, strutture proteiche inserite nella membrana nel doppio strato lipidicio che fondamentalmente fungono da poro idrolico attraverso il quale una sostanza polare pu passare attraverso la membrana. La gramidicina presenta ad esempio domini non polari all'esterno della catena che si interfacciano con il doppio strato fosfolipidico e nella membrana interna sono presenti residui polari che presentano un ambiente 25

Canali ionici
Indice
3.1 Propriet

3.1 Propriet . . . . . . . . . . . . . 3.1.1 Meccanismo di selettivit 3.1.2 Gating . . . . . . . . . . . 3.1.3 Refrattariet . . . . . . . 3.1.4 Tutto o nulla . . . . . . . 3.2 Struttura . . . . . . . . . . . . . 3.2.1 Canali di tipo chimico . . 3.2.2 Le acquaporine . . . . . . 3.3 Carrier proteici . . . . . . . . . . 3.3.1 Regolazione . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

. . . . . . . . . .

27 28 30 32 32 32 32 37 38 40

Nelle nostre cellule i canali ionici sono presenti in decine di tipi diversi ma tutti hanno una struttura pi complessa rispetto alla semplice elica vista per la struttura della gramidicina. Normalmente i canali ionici hanno una struttura composta da pi subunit, da 4 a 6, che si associano a formare un poro al loro interno. Abbiamo quindi in questo caso domini transmembranari con una notevole ricchezza di residui AA non polari che permettono l'inserimento della struttura all'interno della membrana cellulare e all'interno le subunit si dislocano in modo da presentare un poro. Queste subunit possono essere tutte diverse, tutte uguali o a volte sono pseudosubunit, cio la stessa proteina che presenta normalmente 4 domini quasi identici (omo o eteropolimeri) che si ripetono a formare il poro, le quattro subunit sono legate da catene peptidiche e non sono separate e si parla quindi di pseudosubunit. Queste sono strutture che favoriscono il passaggio di sostanze dalla membrana che altrimenti non potrebbero mai passare, ma la forza che spinge lo ione in questo caso attraverso il canale sempre una forza che dipende dal gradiente di concentrazione, questi canali sono bidirezionali e permettono nella maggior parte dei casi il passaggio da una direzione e dall'altra, permettono il passaggio di sostanze polari ma deve esserci una forza transmembranaria che tende a spingere lo ione attraverso la membrana (energia potenziale di tipo chimico per dierenza di concentrazione). Quando parliamo di ioni per che presentano una carica elettrica dobbiamo considerare un'altra forza importante che il campo elettrico, essendo gli ioni cationi o anioni tenderanno ad allontanarsi da cariche simili e andare verso cariche opposte. Per quanto riguarda gli ioni attraverso i canali ionici dobbiamo in ogni caso sommare e tenere presente la forza di concentrazione dovuta a quella del gradiente elettrico presente ai capi della membrana, si parla non pi di gradiente di concentrazione ma di gradiente elettrochimico che considera entrambi le componenti, chimica ed

27

C a p i t o l o

3.

Canali ionici

Inne bisogna ricordare che esiste un meccanismo di gating attraverso il quale l'apertura e la chiusura del canale pu essere determinata da un numero molto elevato di fattori di natura elettrica, chimica o meccanica. Il fatto che ci sia un canale non signica che sia sempre aperto ma nella stragrande maggioranza dei casi controllato da una grande natura di fattori per cui la permeabilit della membrana a uno ione pu variare a seconda delle necessit funzionali.

3.1.1 Meccanismo di selettivit

Un primo pensiero potrebbe per quanto riguarda la selettivit essere rivolto alle dimensioni degli ioni, ci sono per canali che fanno passare ioni grossi come il potassio e bloccano perfettamente lo ione sodio che come diametro nettamente pi piccolo, il meccanismo non quindi basato semplicemente sulla dimensione dello ione. Il problema complicato dal fatto che gli ioni in soluzione sono liberi perch si legano a molecole di acqua polari e gli ioni attirano a s un certo numero di molecole di acqua chiamata acqua di idratazione che permette allo ione di entrare in soluzione. La quantit di molecole d'acqua attirate dallo ione inversamente proporzionale al diametro dello ione anidro senza corona d'acqua, uno ione piccolo ha una carica concentrata in un punto e questa molto pi vicina all'acqua di idratazione attirata, uno ione grosso ha molecole d'acqua a una distanza maggiore rispetto alla supercie e presenta una corona di acqua di idratazione pi piccola. Uno ione piccolo quindi attira una corona di acqua di idratazione maggiore. Il sodio ha un raggio anidro ad esempio di 0,98 pi piccolo di quello del potassio (1,33 ) ma grazie alla capacit del sodio di attirare l'acqua in maniera maggiore il raggio idrato del sodio maggiore rispetto a quello del potassio. Dovrebbe essere quindi pi facile far passare uno ione con un raggio idrato minore che non uno con un raggio idrato maggiore. Si dimostrato che l'interno del canale ionico presenta esso stesso delle cariche elettriche o delle zone polari, soprattutto prodotte da atomi di ossigeno che presenta un eccesso di carica negativa che permettono un legame energeticamente favorevole allo ione per cui questo perde la sua acqua di idratazione perch trova possibilit di legame energeticamente pi favorevole all'interno del canale stesso. Anch lo ione possa passare attraverso un canale necessario che perda l'acqua di idratazione e che trovi all'interno del poro un legame sterico identico ed energeticamente favorevole quando ci avviene. Questo avviene per ogni canale solo per una precisa dimensione, un atomo di sodio ad esempio per un canale del potassio anche se perdesse la corona di idratazione non avrebbe un ingombro sterico adeguato per legarsi al sito del

Figura 3.1: Esempi di canali ionici

elettrica. Quando esiste un gradiente elettrochimico favorevole lo ione pu passare attraverso il canale seguendo passivamente il suo gradiente elettrochimico senza consumo energetico, questo usso un usso che pu essere invertito per inversione del gradiente (inversione del segno). La velocit con la quale gli ioni passano attraverso il canale estremamente elevata, 107 108 ioni al secondo, sempre in presenza di un gradiente elettrochimico favorevole. Un'altra propriet importante il ltro di selettivit, il fatto di come il poro riesca a far passare alcune specie ioniche e a bloccarne altre. Il canale non un semplice foro attraverso il quale gli ioni possono passare ma sono strutture complesse che riescono a discriminare uno ione rispetto a un altro. 28

3.1. Propriet

Figura 3.2: Selettivit dei canali ionici

Figura 3.3: Meccanismo di selettivit

29

3.

Canali ionici

Figura 3.4: Meccanismo di selettivit 2

ltro di selettivit del canale stesso perch di dimensione pi piccola. Il legame non pi quindi energeticamente favorevole, cosa che avveniva invece per il potassio. Lo ione per poter passare quindi attraverso il poro deve perdere parte dell'acqua di idratazione e una volta nel poro riesce a trovare un ingombro sterico favorevole che gli permette di passare all'interno del canale. Si formano quindi legami labili estremamente rapidi che sono la chiave per il ltro di selettivit stesso, questo perch il usso ionico molto elevato e veloce. All'interno di un canale normalmente ci sono molti siti di legame per cui gli ioni passano in la indiana saltando da un sito di legame all'altro all'interno del canale, soltanto il canale con l'ingombro sterico preciso per gli ioni interessati ne permette il passaggio. La selettivit ionica per i canali molto variabile, ci sono canali estremamente selettivi e canali non tanto selettivi, alcuni canali fanno per esempio passare tutti gli anioni e bloccano i cationi. turazione, un usso massimo oltre il quale gli ioni non possono passare dal canale, il usso per cos elevato che siologicamente non permette la saturazione del canale, il gradiente elettrochimico non pu essere elevato all'innito in situazioni siologiche. Il fatto che ci sia un equilibrio dinamico dato dal fatto che i canali sono bidirezionali, statisticamente favorito per il passaggio di ioni secondo gradiente elettrochimico.

3.1.2 Gating
Il canale ionico non sempre aperto ma si apre o si chiude a seconda di molti fattori esterni.

Canali ligando-dipendenti

Abbiamo canali ionici detti ligando-dipendenti, canali ionici, proteine che possono presentare dei siti recettoriali sulla loro supercie, sulla supercie interna ed esterna cellulare, in grado di riconoscere Questo porta di conseguenza una cinetica di sa- un ligando che essendo all'esterno il pi delle volte

30

3.1. Propriet specica su alcuni canali ionici, attraverso fosforilazione e legame covalente passiamo da una struttura chiusa a una aperta, in modo opposto operer una fosfatasi con una defosforilazione.

Figura 3.6: Recettori e agonisti Canali voltaggio-dipendenti

Altro meccanismo di gating la voltaggiodipendenza, tutte le nostre cellule presentano una dierenza di potenziale di membrana a riposo, i cambiamenti di voltaggio di potenziale di membrana in molte cellule eccitabili e nei neuroni, tessuto muscolare, sono in grado di modicare lo stato del canale trasformandolo da chiuso e aperto e viceversa. Quando il potenziale si riduce il canale cambia attivit e passa dallo stato chiuso e aperto, questi canali sono fondamentali per la genesi del potenziale elettrico a distanza.

Figura 3.5: Gating dei canali ionici

un neurotrasmettitore e quando questo ligando si lega al canale ionico questo cambia conformazione e da chiuso diventa aperto innescando il meccanismo di passaggio degli ioni. Si possono avere siti allosterici che producono legami deboli anche all'interno della cellula stessa, ci sono molti messaggeri intracellulari come calcio, cGMP e cAMP che legandosi alla parte interna del canale possono cambiare la conformazione del poro da aperto a chiuso. Questi sono canali fondamentali per la trasmissione sinaptica, sono canali che si aprono e si chiudono solo in presenza di neurotrasmettitori, normalmente questi canali sono per regolati da molti eettori e il comportamento pu essere regolato da cellula a cellula. Altri canali sono regolati da legami covalenti forti, il meccanismo pi frequente di attivazione del canale la fosforilazione di una sua parte, ci sono protein chinasi all'interno della cellula che hanno un'azione

Canali meccanici
Un altro meccanismo dato dal gating meccanico, in alcuni casi i canali sono legati da bre alla membrana per cui le modicazioni meccaniche della membrana sono in grado di modicare meccanicamente il canale che da chiuso diventa aperto. Questo importante per molti recettori presenti nel nostro organismo, ad esempio i recettori tattili, in questo caso il recettore riesce a generare un segnale elettrico trasmesso al SNC grazie alla presenza di canali di questo tipo che cambiano la permeabilit ionica in funzione di meccanismi esterni (cellule uditive, vestibolari e altre ancora). Il fatto che molti canali possano essere regolati da sostanze chimiche rende possibile il controllo della permeabilit ionica attraverso sostanze endogene o esogene come farmaci. Abbiamo decine e decine di canali ionici regolati chimicamente, a volte la stessa sostanza chimica fa aprire canali ionici diversi con propriet diverse e il sito recettoriale della sostanza 31

3.

Canali ionici

chimica come glutammato o GABA ha delle dierenze da canale a canale pur questi riconoscendo sempre la stessa sostanza. Anche l'eetto che si ha sulla conduttanza ionica diverso. Un meccanismo ecace per studiare la diversit dei canali ionici e di gating quello di utilizzare sostanze che fungono o da agonisti o da antagonisti rispetto al ligando endogeno introdotto nel nostro corpo. Si parla di sostanza agonista quando questa ha una conformazione rispetto al ligando endogeno simile e attiva comunque il canale, una parte della molecola mimetizza da vicino la forma del recettore originario producendo apertura del canale ionico. Si parla in questo caso di agonista competitivo che mima gli stessi eetti del ligando endogeno. Vi sono altre situazioni in cui la conformazione della sostanza introdotta assomiglia ad esempio a quella dell'acetilcolina e pu legarsi al recettore ma non a sucienza per far aprire il canale stesso. Questa sostanza si lega al sito recettoriale, non fa aprire il canale ma inibisce comunque il legame della sostanza endogena. Questa una sostanza antagonista che non in grado di aprire il canale e impedisce la funzione normale dei neurotrasmettitori (ad esempio il curaro con l'acetilcolina).

sito recettoriale all'interno del canale che lo inattiva nuovamente no a quando il calcio non viene rimosso dall'interno della cellula. A volte l'apertura fa si che si inneschino meccanismi intracellulari che coinvolgono secondi messaggeri che attraverso meccanismi di fosforilazione del canale portano alla sua inattivazione.

3.1.4 Tutto o nulla

Un'altra caratteristica fondamentale dei canali che si aprono con un meccanismo del tipo tutto o nulla. Il canale quando aperto fa passare il massimo usso ionico e quando chiuso si blocca completamente. Si pu analizzare un canale voltaggio dipendente con tecniche elettrosiologiche che misurano la corrente elettrica di un singolo canale con micropipette appoggiate alla membrana in modo da bloccare un canale singolo. Si pu depolarizzare un singolo canale e farlo aprire se questo voltaggio dipendente. La corrente prodotta viene registrata e il canale non sempre aperto o chiuso, semplicemente quando viene depolarizzato aumenta la probabilit di apertura, di passare dallo stato chiuso allo stato aperto, pi depolarizziamo la membrana pi la probabilit che il canale sia aperto aumenta, quindi il canale continua a passare allo stato di apertura o chiusura in modo probabilistico. Anche il tempo di apertura varia ma quando aperto la corrente che passa sempre la stessa, si parla di corrente unitaria caratteristica del canale. vero che la permeabilit della membrana a un determinato ione varia in modo continuo, questo non dovuto al fatto che il singolo canale diventa pi o meno permeabile ma al fatto che il numero di canali che in un determinato stato aperto maggiore e minore. Le variazioni continue sono date dal fatto che si aprono in modo statistico pi o meno canali ciascuno dei quali si apre in modo tutto o nulla.
3.2 Struttura

3.1.3 Refrattariet
Un altro aspetto importante dato dal fatto che i canali non presentano solo due conformazioni, canale aperto e chiuso, esiste un terzo stato in cui pu entrare il canale che detto di refrattariet o di inattivazione. Il canale pu trovarsi quindi in tre stati, aperto, chiuso e refrattario o inattivato, non tutti i canali ionici presentano questo terzo stato, importante sottolineare come le possibilit di diversit dei canali sono molto estese perch ciascun canale ha le proprie caratteristiche. Molti dei canali importanti per poter generare il potenziale d'azione possono entrare in questa situazione, una volta aperti per esempio dalla depolarizzazione con un certo ritardo spontaneamente senza alcun intervento esterno, solo per il fatto che la depolarizzazione viene mantenuta il canale si chiude ma non torna alla situazione iniziale, entra in un terzo stato dove una diversa parte del canale cambia conformazione e impedisce allo ione di passare. Questo un meccanismo spontaneo dalla cinetica di attivazione pi lenta per questa porta che non rispetto alla porta di apertura per cui l'inattivazione sorge con un certo ritardo rispetto all'apertura. Questo meccanismo di inattivazione pu essere dovuto a tanti fattori diversi, ogni sistema cellulare e ogni canale ha le sue peculiarit, ad esempio i neuroni, in questo caso agisce la depolarizzazione. In alcuni casi, frequentemente per lo ione calcio, l'aumento di concentrazione di calcio all'interno della cellula fa si che venga legato il calcio stesso a un 32

I canali ionici sono composti da pi subunit che si dispongono attorno a un poro centrale. Esistono varie classi di canali. Possiamo avere eteropolimeri, strutture dove abbiamo subunit diverse che formano il canale, situazioni dove abbiamo subunit uguali o pseudosubunit, un'unica proteina che si ripete in modo identico pi volte a formare subunit che si inseriscono nella membrana e che formano il poro.

3.2.1 Canali di tipo chimico

Analizziamo ad esempio un eteropolimero. Un gran numero di questi canali costituito da cinque subunit che possono essere diverse o uguali a seconda dei casi, o avere alcune subunit uguali, che vanno a formare per l'appunto il poro centrale. Alcu-

3.2. Struttura

Figura 3.7: Refrattariet

33

3.

Canali ionici

Figura 3.8: Patch-clamp

Figura 3.9: Struttura dei canali ionici

34

3.2. Struttura

Figura 3.10: Canali di tipo chimico

ne di queste subunit (le due ) presentano sulla parte esterna della cellula il sito recettoriale per il neurotrasmettitore che ne determina l'apertura. Se andiamo a vedere la struttura di ciascuna di queste subunit vediamo che la catena peptidica che compone questa subunit ha una struttura particolare. I canali sono stati isolati e sequenziati, prendendo la sequenza aminoacidica di una subunit e andando a misurare in un graco la sua lipolit vediamo che esistono in tutte queste subunit quattro sequenze aminoacidiche di circa 15-20 residui idrofobici che si ripetono e vanno a formare quattro eliche che sono la parte della molecola in grado di inserirsi all'interno della membrana, solo la parte priva di cariche pu inserirsi all'interno della membrana. Questi quattro domini transmembrana idrofobici M1-M4 si ripetono con una certa regolarit e permettono l'inserimento del canale all'interno della membrana. Abbiamo una parte della proteina che si sviluppa all'interno e all'esterno della membrana e queste parti formano i siti recettoriali per le sostanze chimiche che devono regolare il canale, sia all'interno che esterno. regolati chimicamente presenti in molte sinapsi, canali per acetilcolina, GABA, glicina, glutammato, vediamo che in tutti i canali e nelle loro subunit i 4 domini idrofobici si riscontrano in tutte queste catene, tutte queste proteine derivano da un gene ancestrale comune che si poi modicato a seconda dei diversi canali. La struttura generale di tutti questi canali regolati chimicamente la stessa, sono canali formati da cinque subunit che si dispongono a formare il poro e ciascuna subunit presenta 4 domini transmembranari idrofobici che permettono l'inserimento nella membrana.

Canali per il glutammato

Sono dierenti rispetto a questa struttura a cinque subunit una classe importante di canali regolati dal glutammato che hanno una struttura simile nel senso che ciascuna subunit presenta quattro domini, il dominio M2 in realt in questa classe di canali non attraversa completamente la membrana ma ha una forma a forcina e i canali con questo tipo di forcina sono importanti per determinare la selettivit ionica del canale stesso, la forcina viene presentata all'inSe andiamo a vedere la struttura di tanti canali terno del poro senza attraversare completamente la 35

3.

Canali ionici

Figura 3.11: Connessoni e altri canali

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3.2. Struttura membrana e contribuisce in modo fondamentale a sio abbiamo quattro proteine separate identiche che determinarne la selettivit per diverse speci ioniche. formano una struttura analoga con una forcina. Sono inoltre formati da quattro subunit invece che da 5.

Connessoni
Altre due classi di canali ionici sono i connessoni, canali ionici importanti per le giunzioni comunicanti, canali ionici che in realt sono poco selettivi essendo molto grossi, sono situati nelle giunzioni strette che uniscono anche molti neuroni, ma soprattutto cellule muscolari lisce e cardiache. Sono formati da due emicanali ciascuno sulla membrana di ciascuna cellula e quando i canali si aacciano a formare un unico canale si forma un poro di dimensioni molto grandi molto poco selettivo, questi canali sono presenti in tanti sistemi cellulari ma derivano da un unico tipo di canale ancenstrale, sono composti da sei subunit identiche chiamate connessine che formano poi lo stesso canale. Questi canali sono indispensabili per caratterizzare cellule eccitabili che genereranno un potenziale di azione.

Canali voltaggio dipendenti

Ci sono canali voltaggio dipendenti composti da quattro subunit, ciascuna subunit dei quali ha sei domini transmembranari S1-S6 pi un altro dominio chiamato Pi che non attraversa completamente la membrana ma ha una struttura a forcina, entra nello spessore e torna indietro (importante per la selettivit ionica). Nella maggior parte dei casi (sodio) queste subunit sono pseudosubunit, un'unica molecola proteica si ripete identica e le subunit sono collegate da catene peptidiche pi o meno complesse. Ciascuna subunit ha i suoi sei domini transmembranari pi la struttura a forcina che viene esposta all'interno del canale, tutte queste quattro forcine vanno a determinare il ltro di selettivit del canale che fa passare il sodio ad esempio ma non il potassio. Di queste sei subunit una di queste, la 4 piena di cariche elettriche positive, AA con residui positivi come arginina e istidina ed essendo questi carichi positivamente non possono entrare in contatto con la membrana ma vengono nascosti dalle altre subunit della membrana. Questa struttura responsabile della voltaggio dipendenza di questo canale. Cambiando il voltaggio devono esserci quindi sensori di voltaggio, cambiando voltaggio la struttura cambia riconoscendo la variazione e il canale da chiuso diventa aperto. Se cambia polarit le cariche nuove positive che si formano portano il dominio S4 a spostarsi verso l'esterno del canale e questo cambia la conformazione del canale che da chiuso diventa aperto. La struttura generale la stessa per i vari canali voltaggio dipendenti, mentre per tutti i canali abbiamo pseudosubunit, parti ripetute della stessa proteina, per i canali del potas-

Figura 3.13: Canali per il potassio

Parliamo ad esempio dei neuroni, ciascun neurone ha un comportamento suo proprio che pu essere molto complesso, le peculiarit elettriche di ciascun neurone dipendono dal corredo di canali che ciascun neurone ha sulla sua membrana. Di canali ce ne sono di tantissimi tipi, di canali voltaggio dipendenti per il potassio ad esempio ce ne sono molti diversi. Ad esempio per i canali voltaggio dipendenti del potassio abbiamo canali che si depolarizzano, alcuni si depolarizzano ma non si inattivano, altri presentano sia la voltaggio dipendenza che l'inattivazione successiva, altri si depolarizzano ma per aprirsi hanno bisogno anche della presenza di calcio intracellulare perch hanno un sito intracellulare del calcio, altri vengono attivati da nucleotidi ciclici come cAMP o cGMP, altri canali hanno un comportamento retticante, sono canali che fanno passare facilmente la corrente in una direzione ma non nell'altra. Ci sono anche canali regolati dalla presenza o meno del magnesio.

3.2.2 Le acquaporine
Tutti i concetti espressi nora in linea di massima valgono per i canali che fanno passare l'acqua, anche l'acqua una molecola polare e di per s fa fatica a passare attraverso la membrana fosfolipidica, per poterla attraversare deve passare attraverso strut37

3.

Canali ionici

Figura 3.12: Canali voltaggio-dipendenti

ture proteiche a questo deputate dette acquaporine che sono molto simili ai canali ionici. Le acquaporine sono canali proteici molto ecienti, un canale K+ fa passare 108 ioni mentre le acquaporine sono tipicamente 10 volte pi ecienti. Nonostante questo sono estramamente selettivi, fanno passare solo l'acqua, lo ione idronio ad esempio non passa (H3 O+). Sono sempre regolati da gradiente e il trasporto passivo, si parla in questo caso non tanto di gradiente di concentrazione ma di gradiente osmotico, l'acqua passa dall'ambiente a pi bassa osmolarit verso quello a pi alta osmolarit che ha una bassa concentrazione di acqua. Sono presenti in tutti gli esseri viventi, nell'uomo ce ne sono circa 10 tipi diversi. Ci sono malattie molto rare in cui il difetto in uno specico tipo di acquaporina. rapidi tra l'acqua e l'interno del poro. L'acquaporina ha sei siti di legame deboli, due al centro, due all'interno e due all'esterno. Le molecole di acqua entrano in la indiana saltando da un sito di legame all'altro e l'acqua statisticamente uisce a seconda del gradiente osmotico. Le acquaporine non sono mai presenti singolarmente ma sotto forma di tetrameri, l'acquaporina completa fatta da quattro acquaporine singole ciascuna con il suo poro, ci sono quindi quattro pori nei quali pu passare l'acqua. Ci sono situazioni dove le acquaporine vengono aumentate di numero per aumentare la permeabilit dell'acqua, importante questo nel rene.
3.3 Carrier proteici

Struttura ACQ1
Tutte quante le acquaporine hanno pi o meno la stessa struttura, ciascuna proteina ha 6 domini transmembranari ripetuti a coppie pi due domini transmembranari incompleti a forcina che vengono mostrati all'interno del poro e sono importanti per la selettivit dell'acqua per queste strutture proteiche. Abbiamo la formazione di legami deboli molto 38

Impostiamo in modo generale l'altro tipo di trasporto non mediato dai canali ionici ma dai carrier proteici, mediato da proteine che per poter operare necessitano un cambiamento conformazionale permettendo selettivit di molecole molto grosse entro un certo limite, questo fa si per che la velocit di trasporto ne risulti notevolmente ridotta. Si parla di trasporto facilitato o di trasporto attivo. Il trasporto facilitato quel meccanismo generale per cui il trasporto avviene soltanto secondo gradiente di concentrazione. Il trasporto facilitato

3.3. Carrier proteici te elettrochimico prodotto da un trasporto attivo primario utilizzando questa energia potenziale per trasportare molecole contro gradiente di concentrazione. Tipicamente viene sfruttato il gradiente di concentrazione del sodio che al di fuori della cellula molto concentrato, l'energia potenziale tende a far entrare il sodio e ci viene sfruttato per trasportare contro gradiente un'altra sostanza, per esempio glucosio. L'energia non consumata direttamente ma il suo trasporto contro gradiente avviene perch sfrutta un gradiente di concentrazione creato da un'altra pompa, se la pompa smette di funzionare il meccanismo di trasporto cessa. Entrambi i trasporti hanno un'elevata velocit rispetto alla diusione semplice ma questa di molto inferiore rispetto ai canali ionici, hanno una cinetica di saturazione, hanno specicit chimica e un meccanismo di inibizione competitiva e non competitiva. Sulla competizione e sulla selettivit abbiamo un esempio per quanto riguarda il glucosio, i trasportatori facilitati GLUT1-4 riconoscono il glucosio ma non soltanto il glucosio, questo lo legano pi facilmente ma legano anche il galattosio e in certa misura riescono a legare il maltosio ma non riescono a trasportarlo, abbiamo una competizione per cui se c' solo il glucosio il trasporto elevato, se presente anche il galattosio i due zuccheri competono per lo stesso trasportatore e il trasporto di glucoFigura 3.14: Struttura ACQ1 sio sar ridotto a scapito di una parte di trasporto del galattosio, si ha inibizione competitiva. Per il maltosio si ha inibizione competitiva ma questo non permette il passaggio di molecole che altrimenti non passa, blocca solamente il trasporto. potrebbero mai passare attraverso il doppio strato fosfolipidico ma questo avviene in entrambe le direzioni seguendo un gradiente chimico, non richiede consumo di energia ed quindi passivo, la sostanza va sempre dall'ambiente a pi alta concentrazione a quello a pi bassa concentrazione e si ferma all'equilibrio. Diverso il caso del trasporto attivo nel quale il trasporto di soluto avviene contro gradiente di concentrazione, per far questo dobbiamo vincere il potenziale chimico che dipende dal logaritmo del rapporto delle concentrazioni e per questo si consuma energia metabolica normalmente generata dalla scissione dell'ATP. Il trasporto attivo fondamentale, la dierenza di concentrazione nel trasporto passivo permette il passaggio di molecole ma nel tempo questa va dissipandosi a meno che non ci siano trasporti attivi che la ripristinano o la mantengono. Il trasporto attivo pu essere diviso in due gruppi, attivo primario o secondario. Il trasporto attivo primario quello prodotto da proteine trasportatrici che hanno un'attivit intrinseca di tipo ATPasico, loro stesse consumano ATP e ne utilizzano l'enerFigura 3.16: Graco della saturazione gia liberata per produrre il trasporto, ad esempio la pompa sodio-potassio. Il trasporto attivo secondario diverso perch la molecola trasportatrice non Per quanto riguarda la saturazione il usso pi di ha attivit ATPasica diretta ma sfrutta il gradien- tanto non pu aumentare e la permeabilit dipende 39

3.

Canali ionici

Figura 3.15: GLUT

dal numero di trasportatori presenti sulla membrana stessa. Per le acquaporine la velocit massima di circa 109 ioni al secondo, per la pompa sodiopotassio si ha una velocit di 300 cicli al secondo circa. presenza di insulina si trasforma molto glucosio in glucosio6P e la concentrazione intracellulare di glucosio si abbassa consentendo entrata di glucosio nella cellula per gradiente di concentrazione. Quando l'epatocita deve rilasciare glucosio l'insulina manca, viene stimolata la glicogenolisi e la gluconeogenesi che aumenta la concentrazione intracellulare di glucosio, gli stessi trasportatori di prima producono un usso di glucosio in direzione opposta perch il gradiente di concentrazione invertito. Questi sono quindi trasportatori passivi e reagiscono soltato in presenza di una concentrazione favorevole. Nel trasporto attivo primario ogni tre ioni sodio buttati fuori due ioni K+ vengono portati dentro con idrolisi di una molecola di ATP. Trasporto attivo secondario da fare da soli.

3.3.1 Regolazione
A parit di gradiente di concentrazione il usso pu essere aumentato o diminuito cambiando il numero di trasportatori presenti sulla membrana. Questo spesso un meccanismo soggetto a controllo, per esempio l'entrata di glucosio in alcune cellule come le cellule muscolari, lipidiche ed epatiche, determinata dalla presenza di trasportatori il cui numero regolato dalla presenza dell'insulina prodotta dal pancreas. L'azione dell'insulina attraverso una cascata di secondi messaggeri fa si che alcuni trasportatori GLUT4 vengano inseriti per esocitosi sulla membrana per cui il numero di trasportatori viene aumentato o diminuito. L'altro meccanismo dell'insulina sugli epatociti dimostra come in realt il passaggio di glucosio sia bidirezionale e segua solo il gradiente di concentrazione. Il fegato ha la funzione di accumulare glucosio ed eventualmente trasformarlo in glicogeno o produrre glucosio tramite glicogenolisi quando c' carenza di quest'ultimo. Questo processo regolato dall'insulina in modo completamente diverso, attraverso una regolazione dell'esochinasi che trasforma glucosio in glucosio6P l'insulina varia la concentrazione di glucosio intracellulare. Se l'esochinasi funziona in modo elevato per 40

Trasportatori per il glucosio Vi sono anche

per il glucosio dei trasportatori facilitati secondari che sono attivi e presenti in alcuni sistemi cellulari, nella maggior parte delle cellule il glucosio come altre sostanze polari entra solo per gradiente di concentrazione, ci sono alcune occasioni dove bisogna invece trasportarlo contro gradiente, per esempio a livello renale dove il glucosio ltrato dal glomerulo viene riassorbito. A livello intestinale il glucosio prodotto nella digestione deve essere assorbito e bisogna operare contro gradiente perch nel lume intestinale di glucosio non ce n' molto. Quando necessario un trasporto attivo di una sostanza contro gradiente tranne in pochi casi si utilizzano trasporti attivi secondari e si sfrutta il gradiente tipicamen-

3.3. Carrier proteici

Figura 3.17: Trasporto del glucosio

te del sodio o di idrogenioni generato dalla pompa sodio-potassio consumando energia per trasportare contro gradiente altre sostanze. In cellule epiteliali intestinali bisogna fare in modo che tutto il glucosio del lume passi nel liquido interstiziale. Questa operazione viene compiuta da un elevato numero di trasportatori con trasporti facilitati, attivi primari e secondari che coprono alla stessa nalit. A livello della membrana apicale abbiamo un trasporto attivo secondario perch tutto il glucosio deve essere assorbito contro gradiente e questo viene fatto accoppiando il gradiente del sodio. Con trasporti attivi secondari si aumenta il glucosio intracellulare, perci a livello basale abbiamo un gradiente elevato intracellulare e dall'altro lato della membrana avremo un trasporto facilitato passivo che opera in base al gradiente di concentrazione prodotto a livello apicale. Tutto questo funziona solamente con spesa di energia, infatti il gradiente di sodio deve essere mantenuto attraverso una pompa Na+/K+ attiva primaria che consumando energia ripristina o mantiene basso il sodio intracitoplasmatico. I tre trasporti coprono e lavorano insieme per produrre completo riassorbimento di glucosio dal lume verso l'interstizio.

41

Potenziale di membrana a riposo

Indice
4.1 Il potenziale

4.1 Il potenziale . . . . . . . . . . . 4.1.1 Potenziale di recettore . 4.1.2 Potenziale tutto o nulla 4.2 Potenziale a riposo . . . . . . . 4.3 Misura del potenziale . . . . . . 4.3.1 La pompa Na+/K+ . . 4.3.2 Analisi completa . . . . 4.4 Modello elettrico . . . . . . . . 4.5 Propriet passive . . . . . . . . 4.5.1 Sommazione temporale 4.5.2 Sommazione spaziale . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

. . . . . . . . . . .

43 45 47 47 51 53 55 57 60 60 61

Inquadriamo il potenziale di membrana nell'ambito dei meccanismi che le cellule hanno per comunicare una con l'altra. Ci sono vari tipi di vie di controllo omeostatico, alcune locali dove la variazione induce la risposta e la risposta si esaurisce nelle vicinanze e altre situazioni di risposte riesse dove l'informazione viene raccolta da recettori lontani, queste informazioni vengono inviate su lunghe distanze no al centro di controllo del SNC e le vie eerenti devono viaggiare per lunghe distanze. Uno dei meccanismi delle modalit principali attraverso le quali avvengono scambi di informazioni su lunghe distanze sono le vie nervose che hanno la caratteristica di essere molto rapide in sistemi biologici rispetto per esempio nei sistemi endocrini. Le vie nervose inviano queste informazioni attraverso segnali elettrici che vengono generati in un punto del neurone e trasmessi anche per lunghe distanze, questi segnali elettrici non sono altro che variazioni di una dierenza di potenziale che tutte le cellule del nostro organismo hanno ai lati della membrana. Tutte le cellule, non soltanto le bre nervose e i neuroni o le bre muscolari, anche un eritrocita o un broblasto ha una dierenza di potenziale ai lati della membrana con un eccesso di cariche negative all'interno nel compartimento citoplasmatico rispetto all'esterno dove ci sar un eccesso di cariche positive. L'esistenza del potenziale si pu dimostrare ponendo una cellula in un bagno, misuriamo con una micropipetta il potenziale (diametro inferiore al m), dentro la pipetta inseriamo una sostanza ionica elettrolitica che conduce elettricit e misuriamo attraverso un elettrodo il potenziale della punta della micropipetta rispetto a un elettrodo di riferimento. Il potenziale sempre calcolato non come potenziale puro ma come una dierenza di potenziale, misuriamo il potenziale della punta rispetto per esempio al potenziale di un elettrodo di riferimento. Sino a quando la punta della pipetta all'esterno della cellula misureremo un potenziale uguale 0, la punta avr lo stesso potenziale del-

43

C a p i t o l o

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.1: Esistenza del potenziale

l'elettrodo di riferimento. Nel momento in cui la punta riesce a entrare nella cellula introducendo un danno minimo, nel momento in cui la punta entra andiamo nell'ambiente intracellulare e il potenziale della punta dell'elettrodo diventa estremamente negativo, quanto negativo dipende dalla cellula, non esiste un potenziale di membrana uguale in tutte le cellule, una cellula nervosa ha un potenziale compreso tra -60 e -75 mV. Le cellule che presentano un potenziale di membrana pi ampio sono le cellule scheletriche muscolari e cardiache dove abbiamo un potenziale di membrana di -90 mV. In tutte le cellule riscontriamo che l'interno della membrana ha un eccesso negativo rispetto all'esterno e abbiamo un potenziale quindi negativo, negativo perch per convenzione si misura sempre il potenziale dall'interno all'esterno. I segnali elettrici inviati lungo le bre nervose e muscolari non sono altro che una variazione di questo potenziale di membrana a riposo, il potenziale non sso ma pu cambiare e queste variazioni vengono trasferite per una certa distanza lungo la membrana e costituiscono i segnali nervosi utilizzati per inviare le informazioni prima citate. Questi segnali nervosi sono di tanti tipi perch una stessa cellula nelle sue diverse parti genera diversi tipi di segnali elettrici che non sono gli stessi in tutti i punti della cellula. 44 Facciamo un esempio di un riesso semplice utile per inquadrare la natura e il signicato funzionale generale di questi segnali. Analizziamo un riesso essorio, se camminiamo su una supercie che presenta uno stimolo potenzialmente nocivo, nel momento stesso in cui il soggetto appoggia la pianta del piede sullo stimolo che pu indurre danno tissutale vengono stimolate bre aerenti nocicettive. Queste cominciano a scaricare e mandano segnali aerenti no al midollo a livello del quale attraverso una rete nervosa abbastanza semplice con interneuroni vengono attivati dei motoneuroni che a loro volta inviano questa informazione verso gli eettori che in questo caso sono muscoli. Abbiamo quindi un sensore, un recettore, delle vie aerenti che portano informazioni al centro integrativo in questo caso contenuto interamente nel midollo spinale (riesso involontario, si allontana il piede prima di sentire il dolore cosciente). Si invia l'informazione al centro integrativo che avvia una via eerente con motoneuroni che attivano i muscoli, il essore del ginocchio o i essori dell'anca e della caviglia. L'eetto di questa attivazione una essione generalizzata dell'arto che porta allontanamento del piede dalla sorgente nocicettiva, questo un riesso omeostatico perch lo stimolo uno stimolo che o induce una lesione del tessuto o potenzialmente una lesione, la risposta essoria atta a preserva-

4.1. Il potenziale

Figura 4.2: Esempio di riesso semplice

re la cute del piede, il riesso mantiene l'omeostasi tissutale del piede. Un altro esempio di riesso spinale il riesso miotatico, la stimolazione con un martelletto del tendine rotuleo produce come risposta la contrazione del muscolo quadricipite e un rilasciamento degli antagonisti del quadricipite come il bicipite femorale. Producendo lo stiramento del tendine rotuleo questo stiramento breve data la sensibilit dei tendini viene misurato dai fusi neuromuscolari che misurano l'allungamento del muscolo. Questo segnale viene inviato al centro integrativo del midollo e la risposta consiste in una contrazione del quadricipite che porta a una lunghezza siologica del muscolo originaria. In realt il riesso agisce a livello dell'articolazione e quindi si ha il rilascio dei muscoli antagonisti oltre alla contrazione del quadricipite. A noi importa capire come viene registrato il tipo di segnale elettrico e come questo venga inviato al centro integrativo. una variazione del potenziale di membrana a riposo che tutte le cellule possiedono. Una pressione che induce la variazione del potenziale cambiando la parte distale del recettore induce una variazione del potenziale in senso depolarizzante, il potenziale di membrana che normalmente da -60 a -70 mV si depolarizza in seguito allo stimolo ecace che induce la risposta. Questa depolarizzazione rispecchia abbastanza fedelmente le caratteristiche di durata e ampiezza degli stimoli che l'hanno provocata. La depolarizzazione raddoppia per stimoli doppi e la durata della variazione del potenziale varia a seconda della durata dello stimolo, si parla quindi di risposta graduata, le cui caratteristiche di ampiezza e durata dipendono dalle caratteristiche dello stimolo che l'ha creata. Questa risposta graduata rispecchia in realt non in modo preciso le caratteristiche dello stimolo, abbastanza in termine di ampiezza ma meno in termini di durata, se lo stimolo viene mantenuto costante la risposta tende comunque a diminuire, alcuni neuroni si adattano molto rapidamente altri invece riescono a mantenere la depolarizzazione costante per periodi pi lunghi adattandosi quindi meno rapidamente. Le caratteristiche della variazione di potenziale, in questo caso potenziale di recettore dipendono dalle caratteristiche siche dello stimolo che l'ha provocato in termine di ampiezza e durata. Questa informazione opportuno inviarla al SNC, per i sistemi articiali che costruiamo dei sistemi di controllo eettivamente l'informazione di tipo analogico viene presa e inviata anche a distanze elevate no al centro di controllo che eettua il confronto 45

4.1.1 Potenziale di recettore

Il neurone aerente si chiama sensoriale perch all'estremit distale presenta una specializzazione di membrana atta a trasdurre uno stimolo sico in attivit nervosa, cio un recettore, un sensore che misura per esempio nel caso del fuso neuromuscolare la lunghezza del muscolo, nel caso di un recettore tattile l'entit della pressione esercitata sulla cute e via di seguito. Tutte queste informazioni devono essere trasformate in un'attivit elettrica, il segnale elettrico viene trasmesso lungo le bre e questo

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.3: Neurone aerente sensoriale

e determina la risposta. Questo non possibile nei sistemi biologici e nei nostri nervi perch questa informazione generata sino adesso si attenua con la distanza, teoricamente se le vie aerenti fossero costituite da materiale con una elevata conducibilit elettrica e bassissima resistenza e i materiali fossero perfettamente isolati l'informazione cos come descritta no adesso con potenziali di recettori potrebbe essere inviata tale e quale al SNC per lunghe distanze. All'interno dei nostri nervi per esiste un mezzo conduttore elettrolitico come il citoplasma che ha una buona conducibilit ma anche una notevole resistenza, le bre sono poi molto piccole e si ha una notevole resistenza al passaggio di corrente dovuta alla loro dimensione, inoltre l'isolamento lontano dall'essere perfetto, l'ambiente extracellulare pure un ambiente elettrolitico e l'isolamento tra citoplasma e ambiente esterno c' ma non cos buono. Queste correnti generate a livello del sensore e del recettore dovrebbero poter uire sino alla terminazione sinaptica ma vengono disperse lungo la strada, parte delle cariche tendono a uscire e a disperdersi nell'ambiente circostante. Queste bre proprio perch sono imperfette conducono questi segnali elettrici con decremento, man mano che ci spostiamo lungo l'assone il segnale magari anche 46 ampio si attenua sempre di pi. Nella maggior parte delle bre nervose nell'ambito di pochi mm il segnale va a 0. Questa informazione generata a livello del recettore che rispecchia abbastanza fedelmente le caratteristiche dello stimolo che l'ha provocata viene persa e non pu raggiungere il SNC o pu essere propagata per pochi mm. L'evoluzione ha fatto si che venisse generato un nuovo tipo di segnale, il potenziale d'azione che ha caratteristiche opposte al potenziale di recettore appena descritto. Questo segnale una volta generato si propaga senza decremento per tutta la lunghezza della bra che ha a disposizione ma le caratteristiche di ampiezza e durata non dipendono dalle caratteristiche dello stimolo che l'ha prodotto. Il segnale di potenziale non graduato ma del tipo tutto o nulla, una volta che si ha lo stimolo per la depolarizzazione, la depolarizzazione sotto una certa soglia detta soglia del potenziale non si attiva, quando si supera il livello di soglia vengono generati potenziali tutti uguali tra di loro indipendentemente dallo stimolo che li ha creati. Il potenziale varia da -80 a +20 mV, ha un'ampiezza di circa 100 mV, la durata in una bra tipicamente intorno a 1 ms e tutti i potenziali hanno questa ampiezza e questa durata a prescindere dal tipo di stimolo che li ha

4.2. Potenziale a riposo indotti. Hanno la caratteristica per che una volta per qualsiasi cellula nervosa che riceve sinapsi da algenerati si propagano senza modicazione per tutta tre cellule. Anche nel neurone successivo abbiamo la lunghezza della bra. che gran parte della membrana del neurone non in grado di generare potenziali d'azione, in particolare normalmente il soma cellulare del neurone e tutta l'arborizzazione dendritica non hanno i canali ionici adeguati per poter generare potenziali d'azione, Si potrebbe pensare di avere perdita di informazione hanno la capacit di rispondere al rilascio di neucon questo meccanismo ma in realt l'informazione rotrasmettitori da un numero elevatissimo di bre non si perde, in realt cambia il codice attraverso aerenti che raggiungono un motoneurone (anche il quale l'informazione viene inviata. Se nel poten- 10000 contatti), tutte rilasciano una certa quantit ziale di recettore l'informazione di intensit viene di neurotrasmettitore che induce nella membrana adata all'ampiezza di depolarizzazione quando il del soma e dei dendriti dei segnali graduati la cui segnale si trasforma in potenziale d'azione questa ampiezza dipende dalla quantit di neurotrasmettiinformazione viene codicata dalla frequenza con la tore. Questi segnali graduati si chiamano potenziali quale i potenziali d'azione vengono generati. Tan- sinaptici ma dal punto di vista qualitativo hanno le to pi ampia la depolarizzazione indotta dal re- stesse caratteristiche, sono potenziali di piccola amcettore tanto maggiore la frequenza con la quale piezza o la cui ampiezza dipende in modo graduai potenziali vengono generati, il numero di poten- to dallo stimolo che fondamentalmente si attenuano ziali d'azione per unit di tempo. Uno stimolo di con la distanza e non possono essere trasferiti lungo bassa intensit produrr un piccolo potenziale che la membrana se non per pochi mm. Anche nei neuprodurr potenziali a frequenza pi bassa, si passa roni centrali questo segnale pu essere trasferito per quindi da un potenziale di ampiezza a un potenziale lunghe distanze attraverso i potenziali e anche qui di frequenza di segnali tutti uguali. Questa trasfor- avremo zone di innesco che corrispondono al cono di mazione avviene nel neurone in una zona chiamata emergenza dell'assone, a questo livello le propriet zona integrativa che nelle bre nervose mielinizza- della membrana cambiano, il corredo di canali ionici te corrisponde all'inizio del primo nodo di Ranvier diverso e compaiono canali in grado di generare un dove abbiamo che le caratteristiche della membrana treno di potenziali d'azione (frequenza di scarica del in termini di corredo di canali ionici cambia per cui neurone) che una volta generati vengono trasmesse la membrana in grado di produrre un potenzia- si analogamente ad altri neuroni e questa sequenza le graduato a questo livello nella zona di innesco si continua a ripetersi per tutti i neuroni. ha la capacit da parte della bra di generare poLe diverse parti della membrana sono capaci di tenziale d'azione e trasformare codice di ampiezza generare segnali diversi e questa diversit dipenin codice di frequenza. I potenziali viaggiano poi de dal corredo di canali ionici delle varie cellule, per tutta la bra no ad arrivare alla sinapsi e qui bisogna capire i meccanismi ionici che producoabbiamo un altro passaggio di codica. no questi segnali e i meccanismi che determinano I potenziali non sono in grado di passare da una attenuazione o meno dei segnali sulla distanza. cellula all'altra perch abbiamo una soluzione di I segnali sono modicazioni del potenziale di ricontinuit con un gap sinaptico che separa il neuposo e dobbiamo capire quali sono i fenomeni ionici rone pre-sinaptico dal post-sinaptico. Le variazioni che permettono la formazione di un potenziale a non possono essere trasferite direttamente ma queriposo. ste vengono adate ad un segnale graduato analogico che la quantit di neurotrasmettitore che la sinapsi rilascia nello spazio sinaptico, proporzionale 4.2 Potenziale a riposo al numero di potenziali che invadono la terminazione sinaptica. Se il numero di potenziali elevato Come abbiamo gi visto l'ambiente intracellulare e vengono rilasciati tanti neurotrasmettitori mentre quello extracellulare possiedono concentrazioni iose poco elevato vengono rilasciati meno neurotra- niche diverse, l'ambiente extracellulare il mezzo smettitori e in questo modo l'informazione passa interno mantenuto costante da tutti i sistemi omeoalla cellula successiva. statici ed pi o meno lo stesso in tutte le parti La sequenza di eventi appena descritta per il re- del nostro corpo, inoltre ha composizione diversa da cettore si ripete con le stesse caratteristiche in tutte quello intracellulare gestito dalla cellula stessa. Per le cellule nervose del nostro organismo, i meccani- quanto riguarda gli ioni presenti l'ambiente cellulare smi sono generali ma fondamentalmente dal punto esterno presenta abbondanza di ioni sodio (pi abdi vista qualitativo questa serie di eventi si ripete bondante) e cloro, all'interno della cellula abbiamo tale e quale. Nel caso del riesso di stiramento la un'elevata concentrazione di ioni potassio e bassa bra sensoriale ha un contatto diretto con il moto- di sodio mentre gli anioni sono costituiti dai grosneurone che poi attiva il muscolo. Questo che de- si anioni organici come proteine e composti ad alto scriviamo per il motoneurone potremmo descriverlo PM con cariche negative sulla supercie. Questi

4.1.2 Potenziale tutto o nulla

47

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.4: Trasmissione dei segnali nelle varie cellule

Figura 4.5: Situazione ionica cellulare

48

4.2. Potenziale a riposo anioni sono intrappolati all'interno della cellula, ci sono canali che consentono il passaggio di piccoli ioni ma queste grosse molecole non possono uscire, i canali ionici permettono il passaggio di ioni attraverso la membrana ma sono molto selettivi. Di canali ionici sulla membrana di qualunque cellula ce ne sono decine. Per capire come viene generato un potenziale di membrana facciamo una semplicazione, supponiamo per il momento che sulla membrana sia presente un solo tipo di canale ionico permeabile al potassio, in realt ci saranno altri tipi di canali per i vari ioni con diverse specicit. Se la membrana fosse selettivamente permeabile solo al potassio e a nessun altro ione con un canale sempre aperto per lo ione potassio esisterebbe un gradiente di concentrazione di potassio che tenderebbe a farlo uscire dalla cellula. Il sodio non potrebbe entrare e gli anioni non potrebbero uscire, se per gradiente una quota di potassio (ne bastano pochi ioni) esce dalla cellula per movimenti casuali (il canale bidirezionale) necessariamente all'esterno si viene a creare un eccesso di carica positiva rispetto all'interno perch il K+ si aggiunge alle cariche positive presenti fuori e non seguito da cariche opposte analoghe che escono in simporto. Questo passaggio per gradiente produce un eccesso di carica positiva all'esterno e l'interno diventa negativo. Gli ioni sono cariche elettriche polari e presentano una carica elettrica sulla supercie, lo ione ovviamente viene spinto attraverso la membrana non solo da una forza di tipo chimico ma soggetto anche a forze di tipo elettrico, se si crea una dierenza di potenziale di membrana questa genera un campo che tender a essere repulso dalla parte esterna positiva, ci saranno due tipi di forza, una forza chimica dovuta al gradiente chimico che tende a spingere verso l'esterno lo ione e una forza elettrica che tender a spostare lo ione all'interno. Bisogna vedere come queste due forze si bilanciano per determinare il usso ionico, non si parla di gradiente chimico ma di gradiente elettrochimico, un sistema nel quale si sommano algebricamente le forze chimiche a quelle elettriche. Partiamo da una situazione semplicata con due compartimenti e assumiamo che questa membrana separata sia permeabile soltanto al potassio e a nessun altro ione. Avremo una situazione particolare, il sodio non passa e il potassio tende a passare all'altro compartimento, questo genera una dierenza di potenziale che produrr una forza opposta che tender a spostare il K+ da 1 a 2. Inizialmente la quantit di K+ talmente piccola che la forza elettrica sar piccola per ostacolare il potassio, si generer poi una dierenza di potenziale maggiore sino a quando la forza chimica che tende a fare uscire il potassio verso l'esterno sar controbilanciata da una forza elettrica che tender a far entrare il potassio e l'interno della cellula diventer pi negativo. Allo

Figura 4.7: Situazione sperimentale

stadio nale avremo una situazione di equilibrio nel quale la forza chimica ed elettrica saranno controbilanciate per cui i due ussi di potassio in entrata e in uscita saranno equivalenti. Il usso netto uguale a 0, in questa situazione non si ha non passaggio di potassio ma i ussi nelle due direzioni saranno controbilanciati ma non nulli. Questa situazione si crea grazie alla dierenza di concentrazione del potassio e al fatto che la membrana permeabile solo a questo ione. La dierenza di potenziale creata viene mantenuta senza spesa energetica autonomamente perch siamo all'equilibrio, il problema come si crea la dierenza di potenziale. Partendo dal presupposto che la membrana permeabile solo a uno ione e la dierenza di concentrazione esiste si crea una dierenza di potenziale che si mantiene passivamente nel tempo senza spesa energetica. Il valore di potenziale che permette il raggiungimento di questo equilibrio particolare. Richiamiamo il concetto di lavoro chimico, il fatto che ci sia una dierenza di concentrazione tra due compartimenti fa si che ci sia un potenziale chimico proporzionale al logaritmo del rapporto delle concentrazioni (diusione). Il lavoro elettrico per la sica in presenza di una carica in un campo uguale a zF (valenza dello ione e costante di Faraday) moltiplicato per la dierenza di potenziale. I lavori chimico 49

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.6: Misurazione della permeabilit al potassio

ed elettrico sono lavori da compiere per spostare una mole di soluto contro gradiente elettrochimico. All'equilibrio avremo che il lavoro uguale al lavoro chimico, la somma dei due lavori uguale a 0, la forza elettrica controbilanciata esattamente dalla forza chimica. In questo caso abbiamo visto che i ussi di ioni nelle due direzioni si equivalgono per cui il usso netto uguale a 0. Se poniamo i due lavori uguali a 0 in quest'equazione ricaviamo l'equazione di Nernst fondamentale per spiegare questo fenomeno, viene calcolato il potenziale di equilibrio di uno ione in presenza di un gradiente di concentrazione in una membrana permeabile
E=

membrana, la membrana deve essere permeabile allo ione in qualche misura, ma che sia poco o tanto permeabile non ha nessuna inuenza sul potenziale di equilibrio di Nernst che dipende solo dal rapporto di concentrazione. La permeabilit inuenza solo la velocit dell'equilibrio, non il valore di potenziale. Questo potenziale teorico considerando la membrana come permeabile solo a una determinata specie ionica. La membrana di fatto non permeabile a una sola specie ma a pi speci ioniche. L'equazione di Nernst si pu applicare per qualunque ione che si presenta con una dierenza di concentrazione nella membrana. Per ciascuno ione importante il rapporto di concentrazione, il potassio poco concentrato all'esterno e molto all'interno, il sodio molto all'interno e poco all'esterno, per il calcio le concentrazioni sono molto pi piccole, all'esterno abbiamo una concentrazione di circa 2 mM, la concentrazione di calcio interna 107 M, qualcosa di piccolo. Siccome quello che conta il rapporto di concentrazione abbiamo un rapporto enorme per far si che il potenziale del calcio sia estremamente elevato. Per K+, Na+ e Cl- possiamo calcolare i potenziali degli ioni se la membrana fosse permeabile solo a questi ioni, per K+ il po-

Questo intuitivo, il potenziale al quale si raggiunge l'equilibrio tanto maggiore tanto pi grande il rapporto di concentrazioni, se abbiamo una grande dierenza di concentrazione l'equilibrio viene raggiunto da un potenziale di Nernst maggiore, occorrer un maggiore campo elettrico per bilanciare il gradiente chimico. Il potenziale di equilibrio che si raggiunge nel sistema proporzionale al logaritmo del rapporto delle concentrazioni. Il potenziale di equilibrio di Nernst non dipende da quanto lo ione considerato permeabile la 50

RT nF

Cest ln C int

4.3. Misura del potenziale tenziale vale -97 mV, per Na+ +66 mV e per Cl-90 mV. Per il sodio il potenziale invertito perch pi concentrato all'esterno e non all'interno, entrando produrrebbe un aumento di potenziale positivo interno no a raggiungere l'equilibrio. Il cloro pi concentrato all'esterno ma una carica negativa quindi l'entrata di cloro per gradiente porterebbe a un eccesso di cariche negative all'interno della cellula. Questi sono per tutti potenziali teorici.
4.3 Misura del potenziale

Torniamo all'esperimento del bagno con la cellula in un ambiente controllato come concentrazione ionica in vitro. Possiamo cambiare la concentrazione dello ione potassio all'esterno che normalmente circa 4 mM, possiamo portarla sperimentalmente a 20 mM, misuriamo con un elettrodo come cambia il potenziale di membrana al variare di concentrazione del potassio. La cellula mantiene la sua concentrazione interna costante, per l'equazione di Nernst il potenziale di membrana dovrebbe essere funzione lineare del logaritmo del rapporto di concentrazione, riducendo la concentrazione esterna del potassio il potenziale di Nernst diventerebbe negativo, aumenta la dierenza di concentrazione e il potenziale quindi pi negativo. Se invece aumento la concentrazione di potassio all'esterno il potenziale diventer meno negativo, sempre pi piccolo perch l'equilibrio lo otteniamo a un potenziale minore. Questo potenziale teorico lo misureremmo se la membrana fosse permeabile solo al potassio. Se aumentiamo la concentrazione di potassio esterno il potenziale diventa meno negativo, questo valore non corrisponde esattamente al potenziale di Nernst ma si discosta tanto di pi tanto pi bassa la concentrazione di potassio all'esterno. Se la membrana fosse permeabile solo al potassio i potenziali sperimentali e teorici corrisponderebbero ma ai valori siologici di 4 mM/L il potenziale di membrana leggermente meno negativo del valore di Nernst di circa 10 mV. La spiegazione che la membrana a riposo soprattutto permeabile al potassio ma non esclusivamente a questo, permeabile in misura minore ad altri ioni e questo fa si che il potenziale di membrana si discosti poco dal potenziale di Nernst, poco perch la somma di potenziale degli altri ioni piccola rispetto al potenziale del potassio. Se in un graco in ascissa mettiamo il usso di ioni attraverso la membrana (K+) abbiamo in alto valori di eusso e in basso valori di ausso, sulla y il potenziale. Se il potenziale di equilibrio fosse uguale al valore atteso il usso di membrana sarebbe 0, se ci allontanassimo da questo valore di equilibrio il usso netto dello ione attraverso la membrana sarebbe in eccesso in uscita o in entrata a seconda di quale delle due forze prevarrebbe. Questa quantit

Figura 4.8: Graco

di usso di ione data dall'equazione di Ohm, il usso dipende dalla forza netta che spinge lo ione attraverso la membrana (i canali sono passivi) moltiplicato per la permeabilit. Se abbiamo quindi una forza piccola per una grande permeabilit abbiamo un usso notevole, cos come per una forza grande e una piccola permeabilit. Se ci discostiamo dal potenziale di equilibrio di Nernst e andiamo per esempio verso valori pi positivi il potassio tender a uscire perch prevale il gradiente chimico su quello elettrico. Il gradiente chimico tende a farlo uscire e il gradiente elettrico a farlo entrare, se il potenziale leggermente positivo la forza elettrica debole per contrastare la forza chimica e il potassio tende a uscire, in una situazione a pi bassa concentrazione la forza elettrica non suciente a contrastare il potenziale chimico. Il contrario per valori pi negativi, la forza elettrica sar superiore a quella chimica e il potassio tender a entrare. La pendenza con la quale cambia il usso di potassio al variare del voltaggio dipende dalla permeabilit, se la membrana molto permeabile la retta avr una pendenza elevata e se la membrana sar poco permeabile la retta sar meno inclinata, allontanandoci dal potenziale di equilibrio dello ione avremo necessariamente un usso netto e l'entit dipender da quanto sar permeabile la membrana allo ione. Inseriamo ora il sodio sullo stesso graco e supponiamo che la membrana sia permeabile solo al sodio e al potassio, cosa non vera perch la membrana permeabile anche al cloro e al calcio, supponiamo per semplicit (questo non si discosta molto per le bre aerenti nervose) che la membrana sia molto permeabile al potassio e poco al sodio, per il sodio 51

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.9: Permeabilit sodio-potassio

52

4.3. Misura del potenziale la situazione analoga ma invertita, il potenziale di equilibrio positivo e se la membrana fosse portata a +55 il usso del sodio sarebbe uguale a 0 per controbilanciamento di gradiente chimico e elettrico. Discostandoci da questo valore avremo o ausso o eusso, chiaramente invertito dal caso precedente ma la pendenza della retta sar molto inferiore rispetto a quella del potassio, il sodio ha una permeabilit inferiore rispetto a quella del potassio. Se la membrana permeabile molto per il potassio e poco per il sodio la membrana si fermer a un potenziale costante nel quale il usso netto di sodio in una direzione sar uguale al usso netto di potassio in direzione opposta. Se non fosse cos e ci fosse un usso netto di carica o uscente o entrante il potenziale non sarebbe costante e cambierebbe a valori positivi o negativi, se ci fosse entrata di ioni positivi il potenziale diventerebbe sempre pi positivo. Se esiste un potenziale costante il usso netto uguale esattamente a zero e cio l'equivalenza agli ioni in uscita e in entrata. Si ha la somma algebrica di queste due rette, esiste un potenziale di circa -60mV nel quale la distanza della retta del sodio uguale alla distanza della retta del potassio, il usso in uscita di potassio uguale al usso in ingresso di sodio. Il usso netto degli ioni uguale a 0 e il usso di ciascuna specie ionica non uguale a 0 perch non siamo al potenziale di membrana di Nernst per queste speci ioniche. A ogni valore del potenziale di membrana diverso dal potenziale di equilibrio di Nernst avremo che gli ioni non sono in equilibrio, avremo passaggio netto di ioni da una direzione all'altra. Il punto di stato stazionario sar il potenziale al quale il usso in uscita di ioni positivi sar controbilanciato da un usso in entrata di ioni positivi. Siccome la permeabilit del sodio molto bassa rispetto a quella del potassio per avere un usso di sodio che controbilancia perfettamente l'uscita di potassio dovremo spostarci molto di pi dal potenziale di equilibrio, a valori vicini a quello del potassio avremo un usso dei due ioni uguale e contrario, il potassio esce e avremo un piccolo gradiente per il potassio che lo spinge a uscire ma questa uscita sar uguale a una grossa entrata di sodio ottenuta da una grande forza elettrica, siccome la permeabilit piccola per il usso sar piccolo e esattamente uguale a quello del potassio che esce. Siamo in condizione di stato stazionario in cui il potenziale di membrana rimane costante ma non siamo in una situazione di equilibrio perch il usso netto degli ioni uguale a 0 ma questo usso continuo con continua perdita di potassio e continua entrata di sodio. A lungo andare questo porter a una dissipazione del gradiente elettrochimico e avremmo una situazione di stato stazionario ma non di equilibrio. Il potenziale di Nernst una situazione di equilibrio mentre il potenziale di membrana non una situazione di equilibrio perch non pu essere mantenuta se non introduciamo sistemi che mantengono il gradiente di concentrazione. Altri fattori consumando energia metabolica sono in grado di mantenere nel tempo il gradiente di concentrazione. Nel caso del potassio la forza chimica quasi uguale a quella elettrica ma la forza elettrica leggermente minore, questo per spinge il potassio attraverso una grande permeabilit. Per il sodio la forza chimica tende a spostare il sodio all'interno, siamo a una forza elettrica molto elevata a una differenza di concentrazione pi bassa, la membrana poco permeabile e il sodio entra in maniera analoga al potassio.

4.3.1 La pompa Na+/K+

Lo stato stazionario pu essere mantenuto a lungo tempo soltanto a una condizione, che vi sia un meccanismo attivo che consumi energia metabolica che continui a riportare dentro la cellula il potassio che esce e fuori dalla cellula il sodio che continua a entrare. Questo meccanismo deve spostare il sodio e il potassio contro gradiente di concentrazione. Questo meccanismo la pompa sodio-potassio ed indispensabile, se nella membrana abbiamo canali selettivi per sodio e potassio lo stato stazionario avviene per dissipazione di gradiente, la pompa prende il sodio che entra e il potassio che esce e ristabilisce le concentrazioni. La pompa sodio-potassio l'unica che permette di mantenere i gradienti costanti che altrimenti andrebbero dissipandosi per il fatto che il potenziale mantenuto appunto da questi gradienti in dislivello. La pompa ha una struttura particolare ed asimmetrica, per ogni tre ioni sodio che escono entrano solo due ioni potassio, questo fa si che siccome si ha consumo di energia e di ATP si genera una corrente elettrica, se a ogni ciclo l'uscita di carica maggiore in modo attivo la pompa elettrogenica, ha un usso ionico asimmetrico. La dierenza per estremamente piccola, alla ne il usso netto totale del sistema generato dai ussi netti singoli di questi meccanismi deve essere uguale a zero, questo signica che la pompa non neutra per la genesi del potenziale ma producendo una piccola corrente in uscita abbassa leggermente il potenziale rispetto a quello che avremmo considerando solo i canali del sodio e del potassio. Il potenziale quindi leggermente pi negativo rispetto a quello che avremmo se la pompa fosse neutra poich questa elettrogenica, nella maggior parte delle cellule questa dierenza di pochi mV perch lo sbilanciamento conta poco. In alcune cellule in cui la pompa sodio-potassio molto attiva maggiore la capacit di abbassare il potenziale di membrana, soprattutto se la cellula piccola, l'eetto pu essere nettamente superiore a 10 mV. Ad esempio nel cuore questo avviene e si 53

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.10: Potenziali e ussi

Figura 4.11: Pompa sodio-potassio

54

4.3. Misura del potenziale hanno implicazioni funzionali importanti per questo motivo. Nella maggior parte delle cellule per l'eetto non importante, fondamentale per per il mantenimento del potenziale.

4.3.2 Analisi completa

Abbiamo cominciato a descrivere le basi ioniche del potenziale di membrana riposo, fondamentale per la trasduzione dei segnali dei neuroni che sono variazioni del potenziale. Abbiamo distinto tra potenziale di equilibrio di Nernst che sarebbe raggiunto dalla membrana se fosse permeabile solo a uno ione e questo dipende solo dal gradiente di concentrazione del rapporto interno ed esterno e abbiamo parlato del fatto che il potenziale di membrana a riposo determinato da una membrana permeabile a pi speci ioniche. In questo caso il potenziale di membrana non corrisponder a nessuno dei potenziali di Nernst dei diversi ioni ma avr un valore intermedio, il potenziale di membrana nel quale la corrente netta di membrana uguale a 0, se il potenziale stabile la corrente netta ionica attraverso la membrana uguale a 0, se ci fossero cariche in spostamento il potenziale cambierebbe. La corrente in uscita di potassio deve essere uguale a quella entrante di sodio nonostante il potenziale di potassio sia vicino a quello del suo equilibrio mentre per il sodio questo risulta molto lontano dal suo potenziale di equilibrio che positivo. Il potenziale di membrana molto vicino a quello del potassio perch la permeabilit a riposo della membrana elevata per il potassio e molto bassa per il sodio, indicativamente in rapporto 20 a 1. Il sodio ha una elevata forza elettrochimica che deve vincere una elevata resistenza e una bassa permeabilit. Abbiamo introdotto il concetto di pompa sodio-potassio elettrogenica che mantiene nel tempo il gradiente di concentrazione, nel tempo in assenza di una pompa avremmo una continua perdita di potassio verso l'esterno e una continua entrata di sodio che a lungo andare diminuirebbe il gradiente di concentrazione no ad annullarlo del tutto.

Figura 4.12: Equazione di Goldman

la membrana fosse permeabile a un solo ione, se poniamo le permeabilit uguali a 0 si semplicano le permeabilit e si arriva all'equazione di Nernst con Z=1. Per semplicare se ignoriamo il contenuto di cloro, in alcuni casi si pu fare per certe ragioni, se semplichiamo l'equazione di Goldman in una situazione senza cloro e rimodelliamo la parte di destra dividendo numeratore e denominatore per PK abbiamo un'altra equazione con la concentrazione di Nernst per il potassio che viene corretta in base al gradiente di concentrazione di sodio che entra attraverso un rapporto di permeabilit tra sodio e potassio che molto piccolo in condizioni di riposo perch PN a 1/20 di PK . Il potenziale quindi vicino al potenziale di Nernst del potassio corretto di una piccola quota che tiene conto del rapporto di permeabilit per il sodio. Il potenziale di membrana sar tanto pi vicino a quello del dato ione tanto maggiore sar la permeabilit della membrana allo ione e gli altri ioni a permeabilit piccola contribuiranno poco. Questo analogamente si pu fare per tutti gli altri ioni per cui la membrana permeabile come il cloro e il calcio. I rapporti di concentrazione sono per il sodio e potassio numeratore esterno e denominatore esterno, invertito per il cloro perch per poterla costruire abbiamo tolto la valenza dello ione Z alla sinistra dell'equazione che vale 1 sia per il cloro che per gli altri ioni ma per il cloro essendo anione la valenza -1, siccome siamo sotto logaritmo per poter mantenere l'equazione corretta bisogna invertire il rapporto di concentrazione. Abbiamo quindi capito come si originano i segnali elettrici, parlando in generale dei canali ionici la maggior parte dei canali ionici sono regolati nella loro apertura da tanti fattori: chimici, voltaggiodipendenti e meccanici e la membrana non quindi una struttura costante ma cambia caratteristiche chimico-siche a seconda di tanti fattori e a seconda della parte di neurone dove ci troviamo. Se cambiamo la permeabilit di membrana per un dato ione questo contribuir maggiormente a determinare il potenziale di membrana, se la permeabilit aumenta il potenziale verr spostato verso il potenziale di equilibrio di Nernst per il dato ione. In condizioni di riposo la permeabilit del potassio elevata rispetto a quella del sodio e quindi questo tira di pi il potenziale, se improvvisamente la permeabilit al sodio dovesse aumentare (succede in molte cellule 55

Equazione di Goldman
Per calcolare il potenziale di membrana in una situazione reale in cui la membrana permeabile a pi speci ioniche non possiamo utilizzare l'equazione di Nernst che vale solo in una situazione ideale ma dobbiamo considerare le permeabilit dei diversi ioni. Il potenziale di equilibrio non dipende dalla permeabilit per lo ione ma solo dal gradiente, quando calcoliamo il potenziale in una situazione in cui pi ioni sono permeabili dobbiamo inserire valori di permeabilit. Abbiamo quindi l'equazione di Goldman Questa equazione in realt molto simile a quella di Nernst, diventerebbe quella di Nernst nel caso

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.13: Cambiamento di potenziale e depolarizzazione

dirante il potenziale) l'improvviso aumento rende pi forte il tiraggio del potenziale verso il sodio a +30 mV e questo determina spostamento del potenziale, questa variazione dura molto poco e ci spiega perch questo evento duri un tempo molto ridotto, pochi millisecondi. Questo discorso vale per qualunque ione, ad esempio per il calcio o il cloro avremo che il potenziale cambier e verr, come descritto nella legge di Goldman, spostato verso il potenziale di equilibrio dello ione per il quale permeabilit aumenta. In molte cellule la permeabilit al sodio diventa circa 20 volte superiore rispetto a quella del potassio, si inverte il rapporto di permeabilit e questo potenziale verr tirato verso il potenziale ideale ma non lo raggiunger perch ci sar l'inuenza seppur piccola della permeabilit degli altri ioni. trazione se il gradiente di concentrazione elevato si ha entrata di cloro perch intracellularmente bassa la concentrazione di cloro. Questo continuer a entrare no a che il rapporto di concentrazione non sar controbilanciato dal potenziale di membrana e dal gradiente elettrico. Se il gradiente al contrario fosse elevato uscirebbe verso l'esterno no a che il gradiente di concentrazione non sarebbe uguale al gradiente elettrico raggiungendo il potenziale di equilibrio. Il cloro eettivamente al suo potenziale di Nernst in una situazione di equilibrio (-70, -75 mV) uguale a quella del potenziale di membrana a riposo. Possiamo quindi tralasciare il cloro dal potenziale di membrana di Goldman.

Il cloro
La permeabilit del cloro abbastanza elevata in tutte le cellule, spesso tendiamo a ignorare il contenuto del cloro e in alcuni casi si pu fare. In molte cellule il cloro viene distribuito passivamente senza trasporto attivo quindi il gradiente di concentrazione non regolato come per la pompa sodio-potassio, non esistendo un trasportatore attivo ma dei canali passivi il cloro si distribuisce passivamente attraverso la membrana. Nelle cellule in cui non si ha un trasportatore specico il cloro va in equilibrio perch se il potenziale di membrana non fosse corrispondente a quello di equilibrio del cloro questo entrerebbe o uscirebbe dalla cellula. Extracellularmente la concentrazione rimane a 120 mM ma all'interno della cellula se non se ne regola la concen56

Figura 4.14: Trasportatori del cloro

4.4. Modello elettrico Ci sono cellule in cui esiste per un trasportatore del cloro, ce ne sono tanti tipi, nell'ippocampo e nella corteccia cerebrale il trasportatore viene espresso in modo dierente dal neonato all'adulto. Ci sono trasportatori attivi secondari, non ATPasi di membrana, sono trasportatori che sfruttano un alto gradiente di concentrazione del sodio per cui il sodio tende ad entrare attraverso il gradiente e si ha un cotrasporto e in questo per ogni sodio che entra vengono portati dentro un cloro e un potassio, la pompa elettroneutra nel suo insieme. Questa pompa tende ad aumentare la concentrazione di cloro all'interno, in questa cellula il cloro non distribuito passivamente, esiste un meccanismo attivo secondario che aumenta la concentrazione di cloro all'interno della cellula, solitamente in queste cellule c' un altro trasporatore che lavora in modo opposto e utilizza il gradiente del potassio, questo gradiente porta fuori in simporto il cloro con il potassio. Questo trasportatore tende a far diminuire il cloro intracellulare mentre il primo a farlo aumentare. Nel neonato esiste una concentrazione di cloro maggiore all'interno della cellula che non all'esterno, prevale quindi il primo sistema e il potenziale di equilibrio del cloro tende e a essere pi positivo del potenziale di membrana e contribuisce al potenziale tendendo a depolarizzarla, il gradiente di concentrazione maggiore dentro e minore fuori dalla cellula. Nell'adulto la seconda pompa che tende a portare fuori cloro espressa in modo maggiore rispetto a quella che porta cloro internamente e avremo una concentrazione di cloro pi bassa rispetto a quella che ci aspetteremmo in condizioni di trasporti passivi, si tende quindi a spostare il valore di potenziale verso valori pi negativi e inferiori. La situazione diventa molto complicata, discorso analogo si pu fare per il calcio, pu cambiare il potenziale sia istante per istante sia nel caso della maturazione dei singoli tessuti. Dobbiamo sempre vedere la membrana come costituita da un corredo ionico complesso con questi ioni che possono uire o meno a seconda della situazione e questo provocher una variazione del potenziale spostandolo verso il potenziale di equilibrio dello ione per cui la membrana cambia permeabilit.
4.4 Modello elettrico

Avendo capito adesso l'insorgenza del segnale elettrico in funzione del cambiamento di gradienti chimici vediamo di costruire un circuito elettrico equivalente della membrana, dobbiamo descrivere i segnali elettrici come si propagano e che caratteristiche hanno. utile per poterlo fare avere un circuito elettrico che praticamente ha lo stesso comportamento della membrana, invece di parlare di permeabilit di membrana parleremo di resistenza di mem-

brana, invece che di ussi ionici di corrente elettrica perch queste sono cariche elettriche e parleremo di voltaggio invece che di gradienti elettrochimici. Partiamo dai canali ionici, si possono modellare dal punto di vista elettrico in modi dierenti. Attraverso i canali possibile il passaggio di cariche elettriche e il fatto che ci sia un canale ionico selettivamente permeabile e che ci sia un gradiente di concentrazione ai capi di questo ci signica che il sistema pu essere modellato con una resistenza elettrica che rispecchia la presenza del canale in serie con una batteria e un generatore di tensione che sicamente il gradiente di concentrazione, il potenziale di Nernst. Il fatto che ci sia una dierenza di concentrazione tra interno ed esterno crea una energia potenziale che tende a spostare lo ione da una parte all'altra e la forza di questa batteria viene a essere uguale al potenziale di equilibrio di Nernst dello ione e dipende dal rapporto di concentrazione. Questa batteria fa passare una corrente elettrica e l'entit di questa dipende dalla conduttanza ionica del canale, dalla sua resistenza che ne permette il passaggio. Non si utilizza come parametro solitamente la resistenza ma pi spesso la conduttanza tenendo conto che la conduttanza l'inverso della resistenza. Ogni canale diverso pu essere modellato con una resistenza in serie alla batteria di Nernst, se ci limitiamo a tre ioni avremo tre elementi in cui il cloro avr polarit invertite. I canali possono essere modellati come una batteria con in serie una resistenza che dipende dal numero di canali, se la resistenza bassa la conduttanza elevata e ci sono molti canali e vice versa. Oltre ai canali ionici la membrana fatta da un doppio strato fosfolipidico che un isolante dal punto di vista elettrico e non fa passare cariche elettriche. Separa due conduttori, il mezzo interno e il mezzo esterno extracellulare che sono elettrolitici, sono conduttori abbastanza buoni, se separiamo due conduttori con uno strato di isolante che si chiama dielettrico abbiamo un condensatore, non altro che un dispositivo elettrico che permette la separazione e l'accumulo di cariche elettriche sulle sue superci, le armature. La caratteristica fondamentale della capacit accumulare cariche sulle sue superci, aggiungendo cariche positive avremo un accumulo di cariche negative sul lato opposto. La dierenza di potenziale uguale alla dierenza di cariche diviso la costante caratteristica del condensatore che la capacit. La capacit indica quanto varia la dierenza di potenziale in cambio della dierenza di concentrazione. La capacit per le cellule circa 1 farad/cm2 . Per poter produrre una variazione del potenziale dobbiamo aumentare o diminuire la separazione di carica ai lati del condensatore. Un modello elettrico della membrana vede la membrana come modellabile con una serie di rami 57

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.15: Modello elettrico della membrana

in parallelo uno per ogni conduttanza di membrana presente modellata dalla resistenza della batteria in serie e dobbiamo mettere in parallelo la capacit data dal doppio strato fosfolipidico isolante. Il circuito viene chiuso perch tutti i rami sono uniti dall'esterno all'interno da un conduttore perch il citoplasma e l'ambiente extracellulare sono conduttori e permettono il passaggio di cariche. Il circuito completo di un pezzo di membrana ha tutte queste componenti. Passiamo a considerare in termini di ussi ionici il comportamento della membrana a riposo in termini di correnti supportati da cloro, sodio o potassio. In questo circuito l'entit della corrente e di usso di ioni dipende da quanto lontano il potenziale di membrana dal potenziale di equilibrio dello ione, dal punto di vista elettrico ricordando la legge di Ohm per cui la corrente il rapporto tra voltaggio e resistenza o tra voltaggio per conduttanza la dierenza di potenziale data dal potenziale di membrana in equilibrio e quella per lo ione di Nernst. Nel caso del cloro dove ci fosse concentrazione uguale saremmo a corrente zero, per gli altri ioni dobbiamo considerare dierenza di voltaggio di membrana e di equilibrio dello ione. Abbiamo anche detto che se il voltaggio della membrana stabile vuol dire che la somma di tutte le correnti ioniche deve essere uguale a zero. Applichiamo questa semplice equazione e sostituiamo a questi valori queste equazioni per semplicit elidendo il cloro. Analizzando solo sodio e potassio se la somma delle correnti uguale a zero e la corrente di sodio e potassio sono +55 e -75 ricaviamo come incognita Vm, il voltaggio di membrana. Otteniamo una formula dal punto di vista qualitativo simile a quella 58 di Goldman che dice che il potenziale di membrana uguale alla media pesata dei potenziali dei diversi ioni per cui la membrana permeabile pesata sulla conduttanza degli ioni, la quale pu essere vista in rapporto alla conduttanza totale. L'equazione si pu estendere per tutti gli altri ioni che vengono aggiunti per i quali la membrana permeabile pesata per la conduttanza di ciascuno ione rispetto alla conduttanza totale. Nell'equazione di Goldman avevamo concentrazioni e permeabilit, qui conduttanze e voltaggi di Nernst. Se improvvisamente una di queste conduttanze cambia il fattore pesa pi sul valore del potenziale di membrana e questo verr spinto verso il potenziale di equilibrio dello ione per cui cambiata la conduttanza.

Figura 4.17: Canali del cloro in adulto e bambino

4.4. Modello elettrico

Figura 4.16: Circuito elettrico

Tornando all'esempio dei canali del cloro che variano di espressione nella vita di un individio se la membrana di una cellula cambia conduttanza per lo ione cloro (tutte le sinapsi GABAergiche A hanno questo meccanismo, quando attivate aumentano la permeabilit dello ione cloro) l'improvviso aumento della permeabilit del cloro ha un eetto depolarizzante per la cellula e il potenziale viene spinto verso il potenziale di equilibrio del cloro che pi positivo. Nell'adulto dove la concentrazione interna piccola si avr un eetto opposto, l'apertura improvvisa di canali per il cloro far si che il canale sar iperpolarizzato. Questo sar importante per le sinapsi inibitorie e eccitatorie a seconda degli ioni. Adesso che abbiamo visto come pu originarsi un segnale elettrico dobbiamo capire come questo pu propagarsi lungo la membrana, il segnale deve essere condotto lungo la membrana ed essere trasferito da cellula a cellula. Vediamo come si propaga un segnale elettrico originato in un certo punto di una bra muscolare o nervosa amielinica, generiamo un segnale attraverso un generatore di corrente attraverso il quale possiamo iniettare nella membrana una corrente a piacere attraverso un elettrodo stimolante. Registriamo con altri elettrodi la variazione del potenziale indotta da questa corrente a diverse distanze rispetto al punto in cui iniettiamo la corrente, registriamo il voltaggio a diverse distanze. Questo elettrodo permette di iniettare una corrente a piacere con caratteristiche semplici e di forma e ci non diverso da ci che succede nei neuroni e nelle cellule. L'azione di una sinapsi su un dendrite, quella di cambiare la conduttanza ionica in un punto di membrana non altro che un generatore, se apriamo una conduttanza le cariche passano attraverso la membrana e questo non altro che una iniezione di corrente, questo genera localmente un segnale locale che si deve propagare lungo la membrana stessa. Diamo un impulso di corrente costante iniettato improvvisamente da 0 e mante-

Figura 4.18: Propagazione lungo la bra

59

4.

Potenziale di membrana a riposo

nuto uguale. Nel primo, secondo e terzo elettrodo come voltaggio di membrana a seconda di un impulso a gradino notiamo due aspetti, la variazione di voltaggio per una variazione istantanea di corrente non istantanea ma pi lenta, ha una sua inerzia e un andamento pi o meno esponenziale raggiungendo allo stato stazionario un valore costante. La membrana ha quindi una sua inerzia a variare voltaggio. Altro aspetto importante che man mano che ci allontaniamo dal punto in cui viene generato lo stimolo l'ampiezza dello stimolo decresce, il voltaggio si attenua con la distanza. Dopo un certo numero di millimetri, circa meno di un cm non abbiamo pi segnale. Questo comportamento determinato quando una bra non in grado di generare potenziale di azione, questo comportamento un comportamento dovuto alle propriet elettriche passive della membrana, dove con attive intendiamo la capacit di generare un potenziale d'azione. La stragrande maggioranza di soma e dendriti non sono in grado di produrre potenziali d'azione e le correnti generate sui dendriti si propagano attraverso questi meccanismi. Si tratta di capire come mai avviene questo e quali sono le caratteristiche di membrana che determinano questi fattori. Utilizziamo un circuito elettrico equivalente della membrana semplicato notevolmente poich non ci interessa da che ioni inuenzata la conduttanza della membrana, dobbiamo descrivere solo il passaggio di corrente. Mettiamo insieme tutte le conduttanze di membrana su un'unica resistenza sommando le componenti. Il circuito risulta semplicato con un circuito RC (resistenza-capacit). Sia in senso depolarizzante che iperpolarizzante il voltaggio cambia pi lentamente rispetto al cambiamento di corrente. Dal punto di vista sico se la membrana fosse costituita solo da una resistenza e non ci fosse la capacit la legge di Ohm ci dice che le variazioni di voltaggio seguono istantaneamente le variazioni di corrente, il voltaggio cambia in funzione di R con lo stesso cambiamento temporale. Se mettiamo un circuito RC vediamo che le variazioni di voltaggio sono pi lente perch ci vuole tempo a caricare il condensatore che ha la prerogativa di produrre una variazione di voltaggio sulle armature in funzione della quantit di carica elettrica che viene separata. Gli ioni prima devono accumularsi sulle armature, questo produce una variazione di voltaggio e questo poi fa si che la corrente cominci a uire eettivamente lungo i canali seguendo la resistenza secondo la legge di Ohm. La dierenza di voltaggio pu esserci solo se separiamo una quantit maggiore di carica sulle armature. Noi iniettiamo una quantit costante di corrente e la corrente di membrana la iniettiamo, in ogni istante la corrente di membrana sar uguale alla somma delle correnti che passano per la resistenza e la corrente che passa per la capacit, aggiungiamo cariche positive in 60

alto e quindi si spostano cariche negative in basso e parte di carica passa attraverso la capacit come accumulo di cariche sulle armature. Quando questo avvenuto completamente, quando cio le armature si sono caricate e la corrente smette di inserirsi in questo processo di carica, le variazioni di voltaggio permettono che ci sia passaggio di corrente. La corrente totale di membrana che iniettiamo passer tutta per la capacit, mano a mano che il potenziale cambia avremo elettroni che passano per la resistenza, la corrente capacitativ sar uguale a 0 e la resistiva massima. L'andamento di questo fenomeno esponenziale e tende a uno stato stazionario dopo un certo periodo di tempo. La velocit del cambiamento di questo voltaggio segue come andamento il fattore 1 et/ , a un tempo innito si raggiunge il valore I per R. La carica quindi pi o meno veloce a seconda del parametro che prende il nome di costante di tempo del circuito RC, uguale al prodotto della resistenza di membrana per la capacit, tanto maggiore la capacit o la resistenza tanto maggiore il tempo per cui il circuito raggiunga il valore nale di carica. A T che tende all'innito l'equazione si riduce alla legge di Ohm dipendente unicamente dalla resistenza, la presenza della capacit fa si che le variazioni siano rallentate.
4.5 Propriet passive

4.5.1 Sommazione temporale

In un neurone il potenziale pu insorgere solo sul cono di emergenza e propagarsi sull'assone, la membrana a livello del soma e dendritica non in grado di generare potenziale. Le sinapsi che raggiungono un neurone sono presenti per sul soma e sui dendriti, se si ha una sinapsi attivata il potenziale sinaptico prodotto dovr uire in modo passivo lungo la membrana no a raggiungere un particolare punto e se avessimo il potenziale che raggiungesse una soglia questo si propagherebbe come potenziale d'azione. Nella maggior parte dei casi questi potenziali sinaptici sono di piccolissima ampiezza, di pochi mV nei casi migliori, la soglia normalmente raggiunta quando la depolarizzazione raggiunga da pochi mV. chiaro che la variazione di pochi mV su una distanza cos non ha possibilit di modicare in modo signicativo la frequenza di scarica del neurone. Il fatto che esista una costante di tempo aiuta a risolvere questo aspetto. Supponiamo di avere un condensatore con una costante di tempo breve di un ms (normalmente i tempi in gioco sono di 10 ms). Ciascun eetto sinaptico di treni di potenziali si esaurirebbe prima del sopraggiungere del potenziale di azione successivo, ciascun evento si esaurirebbe in s stesso. Se la membrana presentasse, e come in eetti avviene, un'inerzia maggiore nel variare il potenziale di membrana a causa della pre-

4.5. Propriet passive

Figura 4.19: Circuito equivalente semplicato

senza del condensatore, un'inerzia che fa si che la membrana impieghi tempo a depolarizzarsi e ripolarizzarsi una volta che la corrente se ne sia andata ciascun potenziale d'azione produrrebbe un potenziale sinaptico che durerebbe pi a lungo, impiegherebbe pi tempo a prodursi ma durerebbe nel tempo grazie a questa costante di tempo. Lo stesso treno di potenziali d'azione con le stesse caratteristiche produrr quindi un eetto di sommazione temporale degli eventi sinaptici. Il secondo potenziale raggiunger la membrana prima dell'esaurimento del potenziale precedente e andr a sommarsi a questo. Questo verr trasportato passivamente dal cono di emergenza ma la sommazione fa si che la depolarizzazione totale sia superiore a quella che avremmo avuto con un singolo potenziale d'azione. Questo un meccanismo di integrazione neuronale per cui l'uscita non sar uguale all'ingresso, il neurone modica i segnali di tutte le aerenze, li integra a livello del centro integrativo del neurone cio nel cono di emergenza e il tempo di scarica sar dato dal tempo della membrana necessario per integrare i vari segnali sinaptici. Una somma di potenziali in sequenza produrr un eetto quindi di ampiezza maggiore e una maggiore possibilit di variare la frequenza di scarica del neurone. I meccanismi e le propriet elettriche passive della membrana attraverso i quali avvengono queste trasmissioni vengono chiamate propriet elettrotoniche della membrana che ha quindi si dice un elettrotono. Questo determina meccanismi di integrazione neuronale che arrivano a livello del soma e dei dendriti. Tanto pi elevata la costante di tempo tanto pi sar possibile la sommazione temporale.

4.5.2 Sommazione spaziale

Dobbiamo capire un altro fenomeno, perch man mano che ci allontaniamo dall'origine del segnale l'ampiezza della variazione di voltaggio diminuisce e il segnale si attenua con la distanza. Dobbiamo fare riferimento alle propriet elettrotoniche e utilizzare un circuito elettrico equivalente. Non dobbiamo considerare un pezzo di membrana locale ma considerare come si comporta la membrana nel suo complesso. Aggiungiamo uno dopo l'altro tanti circuiti RC che rappresentano le caratteristiche di RC di ogni parte di membrana, abbiamo il circuito equi61

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.20: Membrana come condensatore

Figura 4.21: Sommazione temporale

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4.5. Propriet passive

Figura 4.22: Dispersione dell'impulso

valente quindi di una bra in toto. I vari circuiti RC vengono uniti attraverso conduttori, mentre il conduttore esterno extracellulare agli eetti pratici possiamo considerarlo come privo di resistenza perch ha valori di resistenza molto piccoli rispetto alle altre resistenze in gioco come le cariche ioniche e quindi lo trascuriamo. Li uniamo quindi con un lo conduttore senza resistenza, la resistenza cos piccola che possiamo trascurarla. Non possiamo fare questo per quanto riguarda la resistenza interna, il diamentro delle bre nervose molto piccolo e quindi si avr molta resistenza. Anche se il citoplasma un discreto conduttore la resistenza interna della bra non pu essere trascurata e per ogni unit di lunghezza dobbiamo mettere una resistenza assiale che la bra nervosa ore al passaggio di corrente. Aggiungiamo quindi Ra o Ri alle resistenze in gioco. Se noi iniettiamo in un punto della bra qualunque una corrente, questa depolarizzer la membrana con un circuito RC, per poter depolarizzare le parti lontane occorre che la corrente uisca lungo l'assone e vada a depolarizzare zone lontane. Il punto rimarr depolarizzato se le resistenze potranno accumularsi nei vari punti. Se la bra avesse un isolamento perfetto la corrente potrebbe uire e andare a depolarizzare zone lontane, l'isolamento per non perfetto e la resistenza non innita, della corrente ionica che iniettiamo a ogni biforcazione del circuito avremo una parte di corrente che andr avanti lungo l'assone e l'altra andr a uscire lungo la membrana attraverso i canali poich la corrente in un nodo si divide secondo la minore resistenza che incontra. A ogni nodo una parte di corrente uscir dalla membrana e una parte continuer a depolarizzare zone pi lontane, la corrente che raggiunge le zone pi lontane sar sempre di meno man mano che ci allontaniamo dal punto in cui la corrente stata generata. Abbiamo che il voltaggio di membrana diminuisce in modo esponenziale con la distanza ammettendo l'uniformit del circuito, appunto perch ad ogni nodo una parte di corrente viene persa ed esce dalla cellula. L'andamento esponenziale e l'equazione che descrive questo fenomeno ci dice che il potenziale in funzione della distanza x uguale a V0 , la variazione di voltaggio nel punto in cui iniettiamo la corrente moltiplicato per ex / dove x la distanza e descrive la velocit con la quale questo voltaggio diminuisce con la distanza. Questo parametro prende il nome per analogia di costante 63

4.

Potenziale di membrana a riposo

Figura 4.23: Dispersione lungo i nodi

di spazio. uguale alla radice del rapporto tra 37%, indica la distanza alla quale il segnale viene Rm resistenza di membrana e Ra resistenza assiale. attenuato al 37% del valore iniziale. I valori della costante di tempo e di spazio sono i meccanismi principali di azione integrativa del neurone. La costante di tempo dipende dalla capacit, la costante di spazio non dipende invece dalla capacit perch importante per il transiente ma non per il valore nale, dipende solo dai valori delle resistenze. La costante di spazio importante per un altro meccanismo di integrazione neuronale, importante per determinare quanto un neurone in grado di produrre una sommazione spaziale, le varie sinapsi devono sommarsi in modo complesso ed essere integrate a produrre una variazione di potenziale rilevante a livello del cono di emergenza. La sommazione spaziale quando pi sinapsi vengono attivate contemporaneamente da un singolo potenziale di azione. Attraverso questo meccanismo di attenuazione che dipende dalla costante di spazio si avr la sommazione degli eventi sinaptici a livello del cono di emergenza, la sommazione spaziale e temporale non avvengono separatamente, avvengono contemporaneamente in modo complesso, un motoneurone riceve quasi 10mila attivazioni contemporaneamente. Ciascun evento quindi irrisorio singolarmente ma attraverso meccanismi di

Figura 4.24: Potenziale e distanza

Ci intuitivo perch a ogni nodo la corrente si separa e prende strade diverse, una parte si blocca e una parte continua lungo l'assone, tanto maggiore la resistenza di membrana tanto maggiore la corrente uisce lungo l'assone e viceversa. Un dendrite grosso avr una resistenza interna bassa e potr condurre pi lontano un segnale elettrico, una bra piccola avr una costante di spazio molto pi piccola e l'attenuazione sar maggiore. Quando uguale a x l'attenuazione di 1/e che equivale al 64

4.5. Propriet passive

Figura 4.25: Integrazione neuronale

sommazione temporale e spaziale dipendenti dalla trasmissione passiva si hanno depolarizzazioni complesse perfettamente integrate. Ogni neurone elabora le informazioni che le riceve, le trasforma e produce un segnale nuovo dipendente dalle sue organizzazioni sinaptiche che verr trasmesso agli altri neuroni.

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Potenziale d'azione
Indice
5.1 Caratteristiche

5.1 Caratteristiche . . . . . . . . . . . 5.1.1 Accomodazione . . . . . . . 5.1.2 Refrattariet . . . . . . . . 5.2 Meccanisimi ionici . . . . . . . . . 5.2.1 Canali voltaggio-dipendenti 5.2.2 Probabilit e inattivazione . 5.3 Propagazione e cinetica . . . . . . 5.3.1 Cinetica . . . . . . . . . . . 5.3.2 Propagazione . . . . . . . .

. . . . . . . . .

. . . . . . . . .

67 69 69 73 73 79 79 79 82

Abbiamo pi volte sottolineato come i segnali elettrici graduati come i potenziali di recettore o i potenziali sinaptici si possono propagare solo per distanze molto limitate a causa delle propriet elettriche passive della membrana. Abbiamo parlato della costante di spazio e abbiamo visto come a causa della resistenza di membrana relativamente bassa rispetto alla resistenza interna dell'assone buona parte della corrente generata in un punto della membrana non riesce a propagarsi depolarizzando zone lontane in quanto viene cortocircuitata, esce dalla membrana stessa e la velocit con la quale si attenua questo segnale dipende dalla costante di spazio. Per ovviare a questo problema strutturale delle nostre membrane si manifestata la possibilit di generare un potenziale d'azione, un nuovo segnale del tipo tutto o nulla. Questo segnale infatti o c' o non c' senza situazioni intermedie e viene generato quando il potenziale di membrana viene depolarizzato no a un valore determinato chiamato soglia. La propriet del potenziale di azione quella di propagarsi senza decremento per tutta la cellula lungo l'assone. Vediamo il potenziale di membrana indotto da stimoli in corrente, osserviamo che se diamo stimoli di corrente limitati nel tempo di bassa intensit questi produrranno una depolarizzazione della membrana che poi cesser con un certo ritardo, l'andamento temporale dovuto alla capacit di membrana, le variazioni di potenziale di membrana sono pi lente delle correnti che l'hanno generata con un andamento esponenziale. Questo avviene sino a quanto la depolarizzazione sucientemente intensa da raggiungere un livello di soglia, quando ci avviene viene generato un potenziale d'azione che ha caratteristiche peculiari, questa non una depolarizzazione della membrana ma una vera e propria inversione del potenziale di membrana, da valori negativi il potenziale brevemente e rapidamente viene portato a un valore positivo di valore preciso dipendente dal tipo di cellula. Una volta che

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C a p i t o l o

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.1: Potenziali e soglia

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5.1. Caratteristiche il potenziale raggiunto si ha una ripolarizzazione della durata di circa 1 ms nelle bre nervose, il potenziale si autolimita. Possiamo incrementare l'intensit di stimolazione oltre il valore di soglia, si parla di stimoli sopraliminali per dierenziarli dai sottoliminali sotto il livello di soglia e vediamo che la forma e la durata del potenziale non cambiano, una volta che la soglia raggiunta il potenziale ha caratteristiche sue proprie del tipo tutto o nulla, a dierenza di stimolazioni sottoliminali che dipendono graduatamente dall'intensit dello stimolo che le ha generate. Una volta raggiunta la soglia abbiamo una fase crescente di depolarizzazione veloce a cui segue una fase di ripolarizzazione rapida che riporta il potenziale di membrana verso il potenziale di riposo, il potenziale di riposo non viene raggiunto e rimane stabile ma per un certo periodo di tempo pi o meno lungo a seconda della cellula abbiamo un periodo di iperpolarizzazione postuma, la membrana viene portata a valori pi negativi rispetto al potenziale di riposo e lentamente questo decresce no a tornare al valore originario di controllo. Abbiamo quindi tre fasi diverse, una di depolarizzazione con un potenziale di punta, una di ripolarizzazione e una di iperpolarizzazione. Questo il potenziale tipico di una cellula nervosa, la forma del potenziale pu variare notevolmente da cellula a cellula. Il potenziale proprio dei motoneuroni ha una durata molto breve di pochi ms e si osserva nella maggior parte dei neuroni. Se andiamo in una cellula muscoloscheletrica vediamo che la forma cambia, la durata aumenta nella bra muscolare (si raggiunge un tempo di circa 5 ms), vediamo che il potenziale di membrana da cui si parte diverso qui siamo a -90 mV, vediamo come invece nel muscolo cardiaco, nel muscolo proprio del miocardio abbiamo una forma completamente diversa non solo come forma perch abbiamo una durata di potenziale pi o meno costante intorno agli 0 mV chiamato plateau ma una durata complessiva del potenziale enormemente maggiore, da 200 a 300 ms di durata, circa due ordini di grandezza maggiore rispetto al potenziale d'azione di una bra nervosa. Questa enorme durata del potenziale ha implicazioni funzionali importanti per il cuore. Abbiamo tanti meccanismi diversi, ci concentreremo sul potenziale generato dalle bre nervose, dal punto di vista qualitativo i meccanismi sono gli stessi per gli altri tipi cellulari ma con differenze quantitative anche per quanto riguarda le specie ioniche coinvolte. Stimoliamo un neurone con un elettrodo stimolante che ci permette di iniettare corrente mentre con un altro elettrodo registriamo il voltaggio determinato da questo stimolo di corrente. Le moderne tecniche elettrosiologiche permettono di eseguire tutto con un singolo elettrodo. Se iperpolarizziamo la cellula produrremo risposte passive, se la depolarizziamo otteniamo una depolarizzazione con andamento esponenziale, a seconda dell'intensit di stimolazione raggiungeremo prima o dopo il livello di soglia. Se diamo uno stimolo liminare il livello soglia lo raggiungeremo dopo un certo periodo determinato dalla costante di tempo della membrana. Se diamo uno stimolo di intensit maggiore la soglia sempre quella ma raggiungeremo questo livello pi in fretta, un andamento sempre esponenziale e la soglia si raggiunge prima, intensit pi alte produrranno risposte con latenze pi basse e viceversa, sempre utilizzando stimoli sopraliminari. Questo vero se le variazioni di potenziale che vengono indotte dal nostro stimolo sono sucientemente rapide, in questo caso lo stimolo a gradino, con variazione di corrente istantanea.

5.1.1 Accomodazione
Se depolarizziamo per la membrana molto lentamente a rampa no a raggiungere il valore che normalmente produce depolarizzazione e produce potenziale, se depolarizziamo la membrana lentamente per questo valore di soglia si sposta verso l'alto e la cellula diventa sempre meno eccitabile. Se partendo da -70 mV il valore di soglia 20 mV pi negativo vediamo che se i -50 mV li raggiungiamo lentamente arriviamo a -50 mV ma il potenziale non viene scaricato, dobbiamo arrivare a -40, -45 mV. Si pu anche depolarizzare completamente la membrana ma la cellula non genera potenziale e questo processo prende il nome di accomodazione. La membrana diventa sempre meno eccitabile no a diventare per nulla eccitabile, perde la capacit di produrre un potenziale d'azione, le variazioni devono perci avvenire in maniera estremamente rapida.

5.1.2 Refrattariet
Queste sono le propriet del potenziale d'azione che andranno capite rapportate al funzionamento dei meccanismi ionici. Un'altra propriet importante data dal periodo refrattario. Se diamo stimoli di corrente poniamo che questo stimolo di questa intensit sia uno stimolo esattamente liminare, se diamo uno stimolo inferiore la cellula non scarica il potenziale d'azione. Se immediatamente dopo a questo stimolo in tempo di ms diamo un altro stimolo dopo la ne del primo potenziale, esattamente liminare come quello precedente la membrana non in grado di produrre un potenziale d'azione, e questo avviene per un certo periodo di tempo con stimoli analoghi pur raggiungendo la membrana il valore di potenziale soglia. Dopo un certo periodo di tempo variabile dalla cellula lo stesso stimolo in grado di produrre nuovamente un potenziale d'azione. La cellula quindi dopo aver scaricato un potenziale diventa meno eccitabile, lo stesso stimolo non in grado di dare un secondo potenziale e questo 69

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.2: Curva del potenziale

Figura 5.3: Potenziali nelle varie cellule muscolari

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5.1. Caratteristiche

Figura 5.4: Curva di stimolazione di un neurone

Figura 5.5: Accomodazione

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5.

Potenziale d'azione

Figura 5.6: Refrattariet

periodo viene detto periodo di refrattariet. Questo pu essere diviso in due parti, per la parte della durata della depolarizzazione la cellula totalmente ineccitabile, possiamo dare stimoli molto superiori a quelli liminari e la cellula non in grado di produrre un secondo potenziale d'azione, questo periodo prende tutta la durata del potenziale d'azione o poco pi. Questo periodo prende il nome di periodo di refrattariet assoluta. Successivamente abbiamo un periodo di refrattariet relativa nel quale la cellula eventualmente pu produrre un secondo potenziale ma per farlo dobbiamo somministrare uno stimolo di intensit molto superiore di quello soglia, la sua eccitabilit tornata a essere presente ma molto diminuita. d'azione come periodo di depolarizzazione, il periodo di refrattariet relativa corrisponde grossomodo all'iperpolarizzazione postuma, la cellula tornata a essere eccitabile ma per poter scaricare il potenziale dobbiamo fornire stimoli molto superiori al normale, il livello di soglia si spostato verso valori pi positivi.

Possiamo capire a questo punto quanto abbiamo detto precedentemente, abbiamo detto che a livello della zona di trigger del neurone che corrisponde al cono di emergenza dell'assone, la parte del neurone dove possibile generare il potenziale d'azione si passa da un codice di ampiezza a un codice di frequenza. Quanto pi ampia la depolarizzazione della membrana tanto maggiore la Fondamentalmente il periodo di refrattariet as- frequenza del treno di potenziali che viene generasoluta corrisponde alla durata stessa del potenziale to a livello del cono di emergenza dell'assone. La 72

5.2. Meccanisimi ionici za crescente a seconda della depolarizzazione media raggiunta dalla cellula.
5.2 Meccanisimi ionici

Queste sono le propriet generali del potenziale d'azione, dobbiamo cercare di capire i meccanismi ionici che stanno alla base di tutti questi fenomeni elencati. Innanzitutto la prima osservazione stata quella di vedere che durante il potenziale d'azione con un'oscilloscopio vediamo un segnale che si apre a ventaglio proporzionalmente alla conduttanza della membrana. Si dimostra che durante il potenziale d'azione la conduttanza aumenta nettamente e poi si riduce, continua a essere pi ampia del normale dopo la ne del potenziale a punta. Questo fa supporre che durante il potenziale d'azione si aprano dei canali di membrana che prima invece sono chiusi.

5.2.1 Canali voltaggio-dipendenti

Figura 5.7: Stimolazione mantenuta in soglia
frequenza di scarica proporzionale all'entit della depolarizzazione data dalla somma di tutti i potenziali graduati sinaptici a livello della membrana somatodendritica. Immaginiamo che la depolarizzazione sia esattamente una depolarizzazione liminale che raggiunge il livello di soglia, supponiamo di dare una stimolazione continua mantenuta a livello soglia. La depolarizzazione media del cono di emergenza viene mantenuta a un valore liminale (questo non avviene siologicamente). Se ci avviene il potenziale d'azione successivo avverr dopo un periodo di tempo di circa 1 s, la scarica del potenziale ha quindi una frequenza intorno a 1 hz, il tempo per uscire dal periodo di refrattariet. Se depolarizziamo la cellula per a un valore maggiore allora questo vuol dire che riusciremo a far scaricare alla membrana il potenziale in un tempo pi breve, perch se depolarizziamo con un valore maggiore la membrana riusciamo a ottenere un secondo potenziale d'azione con un tempo pi breve, vinciamo la refrattariet relativa. Il neurone produrr una scarica di potenziali d'azione con una frequenza pi elevata direttamente proporzionale all'intensit dello stimolo. Otteniamo la trasformazione di un codice di ampiezza come ampiezza di depolarizzazione in un codice di frequenza come frequenza del treno dei potenziali d'azione, un treno di potenziali a frequenIn una bra nervosa si apre una conduttanza particolare, quando abbiamo parlato del potenziale a riposo se cambiavamo la concentrazione esterna alla cellula di potassio si cambiava il potenziale di equilibrio del potassio e si inducevano variazioni del potenziale di membrana a riposo, la conduttanza prevalente quindi per il potassio. Si pu fare lo stesso esperimento in una situazione diversa, cambiamo la concentrazione del sodio all'esterno della cellula, la riduciamo (ad esempio al 33%) e vediamo che il potenziale d'azione eettivamente si riduce di ampiezza e si rallenta nel tempo. Se riduciamo la concentrazione di sodio extracellulare riduciamo il potenziale di equilibrio del sodio normalmente intorno a 50-60 mV positivi, se questa variazione di conduttanza della membrana fosse dovuta a un aumento improvviso della conduttanza del sodio sarebbe giusto aspettarsi che riducendo il potenziale di Nersnt del sodio anche il potenziale d'azione si riduca. Il potenziale di membrana la media pesata dei potenziali di equilibrio per i diversi ioni per i quali la membrana permeabile, se la conduttanza elevata il potenziale di membrana viene tirato verso il potenziale di equilibrio del sodio, se la conduttanza viene ridotta anche l'ampiezza del potenziale d'azione viene ridotta. Durante la genesi del potenziale d'azione c' quindi un aumento di conduttanza del sodio che porta il potenziale verso valori positivi senza raggiungere il valore di Nernst del sodio perch ci sono le conduttanze di altri ioni che ne impediscono il raggiungimento. Se abbiamo una conduttanza che improvvisamente aumenta quando il potenziale viene depolarizzato chiaro che abbiamo a che fare con canali voltaggio dipendenti che cambiano il loro stato da chiuso ad aperto quando il potenziale di membrana vie73

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.8: Da ampiezza a frequenza

Figura 5.9: Potenziali e conduttanze

74

5.2. Meccanisimi ionici

Figura 5.10: Struttura dei canali voltaggio-dipendenti

ne depolarizzato. All'interno dei sei domini transmembranari di ogni subuinit, quattro per canale, la subunit S4 quella che sta all'interno delle altre 5 e funge da sensore di voltaggio a causa delle cariche positive dei suoi residui aminoacidici. La depolarizzazione sposta verso l'alto questo sensore di voltaggio e cambia la conformazione del canale da chiuso ad aperto, tutti i canali voltaggio dipendenti hanno questa struttura generale.

Il fatto che questi canali voltaggio dipendenti per il sodio siano fondamentali per produrre un potenziale d'azione dimostrato dal meccanismo d'azione degli anestetici locali, anestetici locali come la lidocaina sono sostanze che hanno punti di legame sull' elica transmembrana S6 del canale voltaggio dipendente per il sodio. Quando avviene questo legame prima della forcina che determina la selettivit del canale allo ione si impedisce il cambiamento conformazionale in presenza di depolarizzazione, il canale non pu aprirsi e la membrana perde la capacit di generare il potenziale d'azione, si porta un'anestesia locale. I potenziali di recettore graduati vengono prodotti ugualmente alla situazione senza anestetico ma essendo bloccati i canali non si ha trasmissione del potenziale d'azione.

Figura 5.12: Ciclo di Hodgkin Ciclo di Hodgkin

Questo ci spiega perch una depolarizzazione della membrana induce l'apertura di canali voltaggio dipendenti e lo spostamento del potenziale verso quello di equilibrio. Questi potenziali sono eventi del tipo tutto o nulla perch il meccanismo a feedback positivo. Supponiamo di depolarizzare la membrana in modo suciente da produrre un aumento della conduttanza per il sodio, un certo numero di questi canali si aprono, un'apertura di tipo probabilisti75

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.11: Azione dei canali del sodio

co, pi si ha depolarizzazione pi aumenta la probabilit di apertura dei canali. Se produciamo un piccolo aumento della conduttanza con un piccolo aumento del potenziale avremo un piccolo entrata di sodio all'interno della cellula, siamo molto lontani dai potenziali di equilibrio per il sodio e quindi questo entra nella cellula, questo produrr una ulteriore depolarizzazione della membrana che a sua volta produrr un aumento della conduttanza del sodio, il meccanismo si autorinfornza, un sistema autorigenerativo sino a quando tutti i canali voltaggio dipendenti per il sodio saranno aperti. Una volta raggiunta la soglia, non importa come, inneschiamo un processo autorinforzante della membrana che porter all'apertura totale dei canali del sodio e a un'ampiezza predeterminata costante del potenziale d'azione. Ci si chiede per perch c' una soglia di attivazione visto che il meccanismo autorigenerativo e quindi teoricamente basterebbe una piccola stimolazione per scaricare il potenziale d'azione. Abbiamo detto pi volte che se IN a costante la corrente di membrana uguale a 0, per avere una depolarizzazione della membrana dobbiamo avere una corrente positiva o negativa depolarizzante, se non abbiamo corrente netta entrante la membrana non pu depolarizzarsi. Se depolarizziamo poco la membrana questa si depolarizza e si allontana dal potenziale di equilibrio del potassio e del sodio, signica che la corrente di potassio tende leggermente ad aumentare e il potassio tende pi a uscire dalla cellula perch ci allontaniamo dal potenziale di equilibrio. Abbiamo quindi due fenomeni contrastanti depolarizzando la membrana: aumentiamo la corrente di potassio in uscita e aprendo poche conduttanze per il sodio aumentiamo la corrente entrante di sodio. Anch si abbia un processo autorigenerativo e parta il processo tutto o nulla occorre che ci sia una corrente netta entrante maggiore di zero, che la corrente in entrata del sodio superi la corrente di uscita del potassio, questo avviene quando apriamo un numero suciente di canali voltaggio dipendenti del sodio, troppi pochi canali aperti vengono contrastati da un'uscita del potassio. Il valore soglia indica il numero sucientemente elevato di apertura dei canali sodio che producono una corrente 76

Figura 5.13: Potenziale di soglia

5.2. Meccanisimi ionici depolarizzante netta e innescano il processo auto- e se misuriamo la corrente che dobbiamo iniettarigenerativo di Hodgkin (chiamato anche ciclo di re per controbilanciare la corrente ionica dei canali Hodgkin). voltaggio dipendenti riusciamo a sapere la cinetica di apertura e chiusura dei canali. La corrente iniettata infatti deve essere uguale a quella prodotVoltage clamp ta dall'apertura dei canali voltaggio dipendenti dalVediamo di capire quali sono le conduttanze che la depolarizzazione. Il prolo di corrente attraverso cambiano durante il potenziale d'azione, se c' un la membrana piuttosto complesso, non abbiamo aumento della conduttanza per il sodio si innesca il semplice entrata di sodio. Abbiamo inizialmente un processo autorigenerativo di Hodgkin, non possia- aumento di corrente entrante, la corrente entra dai mo dire che il potenziale d'azione prodotto solo canali voltaggio dipendenti ma poi questa corrente dall'aumento di conduttanza del sodio. Non chia- da entrante si inverte e diventa uscente. Ci sono ro come mai si ha una ripolarizzazione del poten- meccanismi in vitro che permettono di aggiungere ziale di membrana una volta raggiunto il valore di nella soluzione delle sostanze che selettivamente sopicco, il processo di Hodgkin pu spiegare perch no in grado di bloccare i canali voltaggio dipendenti otteniamo l'apertura totale dei canali del sodio ma per il sodio, come la tetradotossina. Se iniettiamo non perch la membrana poi si ripolarizza. Dob- questa sostanza nel preparato e blocchiamo i voltagbiamo trovare un modo di studiare le variazioni di gi canali dipendenti del sodio vediamo che la corconduttanza ionica determinate dalla depolarizza- rente si trasforma, abbiamo una corrente soltanto zione e dal voltaggio ottenendo una variazione di uscente che sostenuta da ioni potassio che escono. voltaggio controllata. Se depolarizziamo la mem- Sappiamo che potassio perch se blocchiamo con brana induciamo variazioni di conduttanza che in- tetraetilammonio i canali specici del potassio veducono variazioni di voltaggio, se vogliamo studiare diamo la curva dipendente dei canali del sodio. Se la cinetica dei vari canali dobbiamo avere un mec- rendiamo attivi solo i canali del sodio la corrente canismo che permette di mantenere depolarizzata negativa e depolarizza la membrana, se rendiala membrana al valore desiderato stabile per mi- mo attivi solo i canali del potassio oserviamo una surare l'andamento temporale della variazione di corrente positiva che invece la iperpolarizza. conduttanza e studiare gli ioni coinvolti. La depolarizzazione induce quindi l'apertura di Questo meccanismo viene denito di voltage due tipi di canali voltaggio dipendenti, in situazioni clamp o blocco del voltaggio. Questo un devisemplici di bre nervose (nel cuore interviene anche ce elettronico che permette attraverso un sistema il calcio). La depolarizzazione di membrana induce a feedback negativo di mantenere il potenziale di l'apertura di due canali voltaggio dipendenti con cimembrana al valore desiderato. Questo si pu fare netiche e caratteristiche molto diverse, abbiamo l'afacendo passare la corrente attraverso la membrapertura di canali voltaggio dipendenti al sodio che si na in modo controllato, se la membrana tende a aprono molto rapidamente, la pendenza della variacambiare voltaggio per antagonizzare questi camzione di corrente elevata, i canali hanno una cinebiamenti dovuti per esempio all'apertura dei canali tica molto rapida in seguito a depolarizzazione ma del sodio dobbiamo iniettare una corrente identica poi si chiudono spontaneamente anche se la depolaa quella di sodio che entra mantenendo costante il rizzazione rimasta costante, il fenomeno si autolipotenziale di membrana. Facciamo quindi in modo mita. Contemporaneamente all'apertura dei canali che la corrente di membrana sia sempre uguale a per il sodio la depolarizzazione induce l'apertura zero iniettando una corrente uguale e opposta. Possiamo immaginare di avere due elettrodi den- di canali voltaggio dipendenti del potassio che hantro l'assone, uno che utilizziamo per iniettare cor- no caratteristiche diverse, sono molto pi lenti ad rente e l'altro che utilizziamo invece per misurare il aprirsi, si aprono con un ritardo osservabile rispetto voltaggio, abbiamo un sistema di controllo che mi- a quelli del sodio e non si inattivano, non presentasura il potenziale, se questo si discosta dal valore no il fenomeno dell'autolimitazione, se manteniamo desiderato produciamo con un controllo una varia- la depolarizzazione costante rimangono aperti per zione per correggere l'errore nell'altro elettrodo e tutto il tempo. quindi teniamo costante il potenziale di membrana. Analizziamo la corrente che va iniettata nel siTramite ci possiamo depolarizzare la membrana e stema per impedire che il voltaggio cambi, avendo mantenere il voltaggio sempre a questo valore. Se questa possiamo misurare perfettamente le variaattraverso il voltage clamp imponiamo una depola- zioni di potenziale e di conduttanza derivandole da rizzazione da -60 mV a 0 mV, una depolarizzazione questa. Sappiamo che la corrente sempre uguale sopraliminare che porterebbe alla formazione di un a un'equazione di Nernst, (5800) la conduttanza potenziale senza il blocco, misuriamo le variazioni uguale alla corrente che misuriamo diviso Vm - il di corrente che vengono indotte da questa depolariz- potenziale dello ione, misurando I possiamo misuzazione. La depolarizzazione apre canali voltaggio rare le variazioni di conduttanza, come si aprono e dipendenti, questo fa si che passino correnti ioniche si chiudono i canali voltaggio dipendenti. Abbia77

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.14: Voltage clamp

mo l'andamento della conduttanza secondo la corrente per variazioni crescenti della depolarizzazione. La conduttanza per il sodio rapidamente aumenta e poi si inattiva mentre per il potassio lentamente aumenta e si mantiene costante nel tempo. che il canale pu aprirsi prima o dopo, rimanere aperto pi o meno a lungo su base probabilistica, a seconda della variazione del potenziale si aumenta la probabilit dell'apertura, quanto questo aperto varia il suo stato di attivazione in modo probabilistico e tutti questi canali dopo un certo ritardo si inattivano con un meccanismo diverso da quello che porta all'apertura. Questi canali hanno una componente della catena peptidica a livello intracellulare che in grado di andare a chiudere dall'interno il canale. Se depolarizziamo la membrana abbiamo il dominio S4 che si sposta, i sensori cambiano conformazione e aprono il canale. Questo canale fa quindi passare il sodio ma permette anche a questa componente intracellulare, a questa catena peptidica di poter trovare il suo sito all'interno del canale nella parte interna. Sino a che il canale chiuso la componente non in grado di entrare nel canale, quando il canale si apre pu occupare il sito all'interno della parte citoplasmatica, il canale quindi si autolimita con un certo ritardo e rimarr in questa situazione no a quando non ripolarizziamo la membrana in modo che S4 cambi di nuovo confor-

Patch clamp
Abbiamo detto che la conduttanza ha un andamento variabile. Ciascun canale ionico si apre con un meccanismo tutto o nulla, se la conduttanza lentamente aumenta e poi diminuisce o aumenta pi o meno a seconda dell'entit questo dipende dal fatto che apriamo un numero diverso di canali voltaggio dipendenti ognuno che si apre con base probabilistica seguendo un meccanismo tutto o nulla. Se utilizziamo una tecnica di patch clamp applicando il voltage clamp a un pezzo di membrana registriamo le correnti a un singolo canale ionico, possiamo strappare il pezzo di membrana e agire a piacere sulla parte intracellulare ed extracellulare registrando le correnti prodotte da un singolo canale. Se depolarizziamo la membrana in modo costante vediamo 78

5.3. Propagazione e cinetica

Figura 5.15: Graco delle conduttanze

mazione, il canale torna a essere allo stato iniziale e quindi pu aprirsi. Chiusura e inattivazione sono quindi condizioni diverse anche strutturalmente, i canali del sodio presentano la possibilit di andare in uno stato di inattivazione ma non tutti i canali lo fanno. L'inattivazione portata nel graco solo nelle cellule che possono autolimitarsi e quindi che hanno canali che possono autolimitarsi, questo processo di inattivazione porta alla ripolarizzazione della cellula. del canale, aumentiamo solo la probabilit che il canale sia aperto piuttosto che chiuso. Questo canale voltaggio dipendente per il potassio non mostra la propriet di inattivazione.
5.3 Propagazione e cinetica

5.3.1 Cinetica
Cerchiamo di ricostruire il potenziale d'azione a partire dai dati del blocco di voltaggio in una situazione reale, con il voltage clamp siamo noi a indurre una variazione a piacere. In una condizione reale quando il potenziale cambia abbiamo l'apertura dei canali per il potassio e per il sodio durante la depolarizzazione. Con una certa probabilit i canali del sodio si aprono rapidamente e si inattivano, la corrente entrante di sodio ha un picco depolarizzando la membrana mentre con un certo ritardo si aprono i canali voltaggio dipendenti del potassio, la corrente del potassio aumenta la polarit della membrana e la ripolarizza. La corrente aumenta e poi diminuisce, ma mente la corrente del sodio diminuisce per inattivazione dei canali l'uscita del potassio va a 0 perch la membrana si ripolarizza, 79

5.2.2 Probabilit e inattivazione

I loop intracellulari vanno a formare la porta di inattivazione tra il dominio 3 e il dominio 4, si costituisce la componente che blocca il canale dall'interno con un certo ritardo, se nel sistema di patch clamp mettiamo un enzima proteolitico dalla parte interna del canale eliminando una parte di questi loop vediamo che il canale non si inattiva pi. Il canale del potassio non presenta una inattivazione, una volta che la conduttanza si apre rimane sempre aperto e non si inattiva pi. Tanti canali diversi di fronte a una depolarizzazione sono in uno stato variabile di apertura probabilistica, alcuni si aprono tardi, altri presto a seconda

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.16: Patch clamp a un singolo canale

80

5.3. Propagazione e cinetica

Figura 5.19: Patch clamp in vivo

i canali non si inattivano, la loro apertura porta a un aumento della corrente di uscita di potassio che poi ha un'azione ripolarizzante per la cellula. Se non ci fosse la corrente per il potassio la membrana si ripolarizzerebbe comunque perch la conduttanza tornerebbe iniziale per inattivazione dei canali del sodio, avremmo una situazione standard e il sodio uirebbe ancora. Il fatto che si aprono in pi i canali voltaggio dipendenti del potassio induce un aumento della corrente di uscita ripolarizzante e rende pi rapida la ripolarizzazione che comunque avremmo perch la conduttanza al sodio si apre solo per un breve periodo di tempo. Questo spiega perch il potenziale dura pochi ms. C' un altro aspetto che va sottolineato, questi canali voltaggio dipendenti al potassio sono lenti sia ad aprirsi sia a chiudersi una volta che si ripolarizza la membrana. Questo vuol dire che una volta che la membrana viene ripolarizzata la conduttanza del potassio torna lentamente a valori normali e questo vuol dire che per un certo periodo di tempo la conduttanza del potassio pi elevata del normale, maggiore rispetto a quella che abbiamo nella condizione di controllo, questo perch i canali si aprono lentamente e lentamente si richiudono. Questo implica che il potenziale di membrana tender ad avvicinarsi ancora pi del normale al potenziale di equilibrio del potassio, all'insorgenza di valori ancora pi negativi e all'insorgenza della ripolarizzazione postuma. Questo spiega il periodo di refrattariet assoluta e relativa. Sino a quando il potenziale d'azione non terminato la cellula totalmente ineccitabile, possiamo depolarizzare la membrana ulteriormente ma non viene prodotto un secondo potenziale d'azione. Questo dovuto alla presenza dell'inattivazione dei canali per il sodio, questo perch il canale per il sodio si apre quando depolarizziamo la membrana, si inattiva e no a quando non la ripolarizziamo il canale non fa passare pi sodio perch inattivato, non sar in grado di aprirsi nuovamente no a quando la membrana non sar completamente ripolarizzata. Entriamo poi nel periodo di refrattariet relativa, qui i canali voltaggio dipendenti sono di nuovo disponibili, si tolta l'inattivazione e la membrana ripolarizzata, la conduttanza del potassio per superiore al normale e questo fenomeno causato dalla cinetica relativamente lenta di questi canali rispetto a quelli del sodio, i valori sono pi negativi e pi lontani dal valore di soglia. La minore 81

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.18: Apertura probabilistica dei canali Figura 5.17: Struttura del canale potassio
eccitabilit della membrana porta all'occorrenza di stimoli pi elevati in modo che si possa raggiungere la soglia che si allontanata come distanza dalla soglia normale essendo la membrana pi polarizzata. Ci rimane da spiegare per il processo dell'accomodazione. Se depolarizziamo la cellula lentamente la cellula diventa sempre meno eccitabile, possiamo anche depolarizzarla completamente e non si ha la generazione del potenziale. Se depolarizziamo lentamente la membrana attiviamo alcuni canali del sodio, questi si aprono ugualmente ma poi spontaneamente si inattivano e qui in questo stato rimangono no a quando non ripolarizziamo la membrana. Se depolarizziamo la membrana lentamente continuiamo a portare in stato di inattivazione un numero sempre crescente di canali voltaggio dipendenti del sodio senza che si riesca mai a ottenere una corrente entrante di sodio maggiore di quella uscente di potassio, non si innesca quindi il ciclo autorigenerativo di Hodgkin. Arriveremo ad inattivare completamente tutti i canali sodio dipendenti disponibili senza essere mai riusciti a innescare il potenziale d'azione portando la cellula a una completa ineccitabilit. I canali voltaggio dipendenti al potassio hanno una cinetica di apertura e quindi anche di chiusura 82 lenta per cui una volta che la cellula si ripolarizzata questi canali tenderanno poi a richiudersi nel tempo ma per un certo periodo di tempo la conduttanza la potassio sar superiore a quella normale e quindi questo produrr una iperpolarizzazione della cellula cio una tendenza del potenziale di membrana ad avvicinarsi sempre pi al potenziale di equilibrio del potassio, questo rende conto della presenza della iperpolarizzazione postuma che come vedremo tra poco ha varie implicazioni oltre a quelle gi viste.

5.3.2 Propagazione
Cerchiamo adesso di capire perch una volta che questo potenziale d'azione viene generato in un punto della membrana questo si propaga senza decremento per tutta la lunghezza della bra muscolare o nervosa. Abbiamo spiegato perch un evento tutto o nulla, abbiamo spiegato cos' la soglia, le ragioni della refrattariet assoluta e relativa, adesso dobbiamo capire perch il potenziale una volta generato tende a propagarsi senza attenuazione. Dobbiamo parlare di potenziale d'azione propagato, tutto quello che abbiamo descritto avviene in una piccola parte della membrana. Analizziamo una bra nervosa o muscolare che ha generato in un suo certo punto un potenziale d'azione, poniamo che il

5.3. Propagazione e cinetica

Figura 5.20: Propagazione del potenziale

potenziale d'azione si stia propagando in una direzione. Si ha quindi una zona inattiva della membrana e una zona della membrana da cui proviene il potenziale d'azione, andando indietro a ritroso abbiamo che una parte della membrana presenta depolarizzazione rapida del potenziale d'azione quindi andando indietro si avr una parte di ripolarizzazione del potenziale d'azione e posteriormente ancora l'iperpolarizzazione postuma. Supponiamo che ci sia un punto con un potenziale d'azione presente. Se in questo punto presente il potenziale d'azione avremo quindi un'inversione di polarit, il potenziale di membrana a riposo normalmente negativo all'interno, in corrispondenza del potenziale d'azione avremo una zona all'interno positiva, il potenziale va a +20-30 mV e si ha un eccesso di cariche negative all'esterno e positive all'interno, la polarit di membrana cio invertita. Ricordiamo anche che sia l'ambiente intracellulare che extracellulare conducono elettricit, sono ambienti elettrolitici, un ambiente ionico. Se abbiamo una dierenza di voltaggio tra due punti in un ambiente che conduce elettricit avremo l'instaurarsi di una corrente elettrica. Se un punto prima negativo mentre il punto a riposo successivo con un eccesso di cariche positive in presenza di un ambiente elettrolitico avremo che le cariche positive tendono a uire extracellularmente dal segno pi al segno meno e dall'altra parte nel verso opposto. Avremo che all'esterno della cellula della membrana una corrente elettrica tender a uire verso il punto in cui esiste e viene generato un potenziale d'azione. All'interno della cellula esattamente il contrario, all'interno della cellula dove c' un punto con un potenziale d'azione generato dove si ha un eccesso di cariche positive all'interno ai lati della zona inattiva avremo come normalmente succede a riposo un eccesso di cariche negative, avremo quindi delle correnti elettriche che tendono ad andare in direzione opposta. Una corrente elettrica non va mai da un punto A a un punto B ma la corrente elettrica deve per forza circolare intorno a circuito chiuso, abbiamo quindi che la corrente elettrica che all'interno della cellula uisce dalla zona attiva a quella inattiva andr a depolarizzare la membrana nella zona inattiva, cariche positive verranno aggiunte a cariche negative con depolarizza83

5.

Potenziale d'azione

zione della membrana e la corrente uir per repulsione delle cariche in direzione opposta all'esterno. Avremo quindi a questo livello una depolarizzazione successiva della membrana per una capacit in questo caso di membrana che viene scaricata, le cariche positive vengono aggiunte all'interno e quelle positive vengono tolte dall'esterno e uiscono verso l'interno. La corrente ha un'azione depolarizzante dalla zona attiva nella zona adiacente inattiva a riposo e questo avviene in entrambe le direzioni, sia nella direzione di propagazione del potenziale di azione ma anche a monte, da dove proviene il potenziale d'azione cio nella zona che precede. Queste correnti che sono correnti di tipo elettrotonico hanno l'azione di portare la membrana inattiva adiacente al livello di soglia, una depolarizzazione tale da portare la membrana attiva a livello di soglia e quindi quando questa membrana attiva raggiunge la soglia viene innescato un processo autorigenerativo di Hodgkin che porter alla genesi del potenziale d'azione anche in questo punto. Se noi attiviamo per esempio anche con uno stimolo esterno un punto qualunque della membrana di un assone o di una bra muscolare questo potenziale d'azione generato localmente si propagher in entrambe le direzioni attraverso un meccanismo che non presenta attenuazione con la distanza. La propagazione non presenta attenuazione con la distanza, la zona inattiva viene portata a un livello di soglia che a sua volta produrr un potenziale d'azione e questo a sua volta produrr le stesse correnti elettrotoniche che andranno a depolarizzare la zona successiva ripetendo il ciclo no alla ne della membrana supponendo che la membrana possieda canali voltaggio dipendenti per il sodio che gli permettano di innescare il potenziale d'azione. Quando un potenziale d'azione viene generato in un punto di una bra capace di generare potenziale d'azione questo si propagher senza nessun decremento attraverso un processo che viene chiamato spesso di tipo attivo per distinguerlo dal processo passivo di propagazione elettrotonica no alla sinapsi successiva.

una sola direzione, cio quella ortodromica, il potenziale d'azione viene generato a livello del cono di emergenza dell'assone e procede senza attenuazione dal soma verso la sinapsi attraverso questo meccanismo. Il potenziale di azione non si propaga per in entrambe le direzioni una volta che viene generato perch la zona da cui proviene il potenziale d'azione si trova in una situazione di bassa eccitabilit perch in quella zona ci sar una iperpolarizzazione postuma, quella iperpolarizzazione che segue al potenziale d'azione dopo la depolarizzazione di membrana che rende la membrana nettamente meno eccitabile di quella completamente inattiva, verso la quale il potenziale d'azione si propaga. Questa zona essendo iperpolarizzata produce molto meno facilmente un potenziale d'azione. La zona attiva produce correnti elettrotoniche passive di membrana che tendono a depolarizzare entrambe le zone in entrambe le direzioni, sia la zona attiva dove il potenziale d'azione si propaga ma anche la zona dalla quale il potenziale d'azione arriva, ma la zona da cui il potenziale arriva in condizioni di refrattariet relativa e quindi le correnti non sono sucienti a indurre un nuovo potenziale d'azione a monte, da dove il potenziale d'azione arriva. In condizioni normali quindi la depolarizzazione direzionale e il potenziale d'azione viaggia in una sola direzione, riesce a depolarizzare la zona inattiva che si trova di fronte che in condizioni di eccitabilit normale.

Velocit
Bisogna capire da quali parametri dipende la velocit con la quale il potenziale d'azione si propaga, questa velocit pu cambiare enormemente da bra a bra, le bre pi piccole nervose del nostro corpo, bre nervose amieliniche di tipo C propagano il potenziale d'azione a una velocit inferiore a 1 m/s (velocit normali sono nell'ordine di 5 m/s). Tessuti eccitabili come quelli presenti a livello del cuore conducono il potenziale d'azione a velocit ancora pi bassa, a 0,05 m/s. Invece le bre pi grosse dei nostri tonchi nervosi, bre mielinizzate di grosso diametro no a 20 m conducono potenziali d'azione a velocit come 100-120 m/s, cio quasi a 3 ordini di grandezza pi elevati. C' un'enorme dierenza di velocit di conduzione e questo non cosa da poco, se pensiamo che un potenziale d'azione generato a livello del piede durante una stimolazione nocicettiva viaggia a 0,5 m/s, poniamo che devono viaggiare ai neuromeri lombari del midollo spinale a 1 m di distanza, ci vorranno circa due secondi per il viaggio di questo potenziale, se viaggiasse a 100 m/s impiegherebbe qualche decina di millisecondi, quindi la dierenza in termini di tempo notevole. La velocit di conduzione del potenziale d'azione, siccome la propagazione avviene tramite correnti elettrotoniche passive, correnti locali che depolarizzano la zona inattiva adiacente, risulta ovvio

Direzionalit
Questo processo ovviamente avviene in entrambe le direzioni se stimoliamo per esempio una bra nervosa in un punto centrale. Se prendiamo un elettrodo stimolante, operazione che si fa spesso anche in elettrosiologia clinica quando dobbiamo per esempio misurare la velocit di conduzione dei nervi, se diamo stimolazione in un punto di un tronco nervoso o di una bra il potenziale d'azione che generiamo si propagher in entrambe le direzioni, sia nella direzione di propagazione normale del potenziale d'azione che viene denita ortodromica sia in direzione opposta, verso il soma cellulare per esempio, propagazione che viene denita in direzione antidromica. In condizioni normali il potenziale uisce sempre in 84

5.3. Propagazione e cinetica

Figura 5.21: Propagazione del potenziale 2

Figura 5.22: Velocit in rapporto alla membrana come circuito

85

5.

Potenziale d'azione

che i parametri che determinano la velocit con la quale il potenziale d'azione si propaga sono le propriet elettriche passive della membrana, le costanti di tempo e di spazio gi analizzate precedentemente. La membrana caratterizzata da due costanti, una di tempo che determina quanto velocemente una data corrente in grado di depolarizzare la membrana visto che la membrana ha una sua inerzia nel cambiare il voltaggio. Nel nostro caso la corrente generata dal potenziale d'azione stesso in un punto di una membrana un generatore di corrente, localmente viene generata una corrente locale, bisogna capire quanto velocemente la corrente elettrotonica locale in grado di modicare il voltaggio della zona adiacente inattiva e questa velocit dipender dalla costante di tempo. Tanto pi elevata la costante di tempo tanto pi lento sar questo processo, tanto pi tempo ci vorr a depolarizzare la membrana, dal punto di vista sico possiamo dire che ci vuole pi tempo per scaricare il condensatore di membrana e pi tempo per cambiare la separazione di cariche presente ai lati della membrana. La costante di spazio ci dice quanto lontano questa corrente locale pu uire lungo l'assone o la bra muscolare e quanto lontano pu andare a depolarizzare la zona inattiva, tanto pi elevata la costante di spazio tanto pi lontano questa corrente generata dalla zona attiva dal potenziale d'azione in grado di uire verso zone distanti e quanto lontano pu riuscire ad andare a depolarizzare la membrana no al livello di soglia. intuitivo capire che la velocit di conduzione di un assone che in questo caso per semplicit amielinico o di una bra muscolare scheletrica lunga qualche decina di centimetri proporzionale direttamente alla costante di spazio e inversamente proporzionale alla costante di tempo. Tanto pi grande la costante di tempo tanto pi lenta sar la variazione di potenziale. Quanto pi grande al contrario la costante di spazio tanto pi lontano queste correnti potranno uire senza attenuazione e quindi tanto pi lontano questa corrente sar in grado di indurre la genesi di un nuovo potenziale d'azione, e quindi pi veloce sar la propagazione. La costante di tempo misurata in millisecondi e quindi una misura di un tempo mentre la costante di spazio una distanza quindi questo rapporto infatti una distanza diviso un tempo e quindi una velocit. dal prodotto di resistenza di membrana per capacit di membrana Rm Cm mentre la costante di spazio data dal rapporto tra resistenza di membrana o resistenza interna e resistenza assiale Rm Ra . Vediamo di capire come le variazioni geometriche della bra modicano i valori della costante di tempo e della costante di spazio. Il parametro pi importante che determina la velocit di conduzione 86

del potenziale di azione il diametro della bra o dell'assone. Fibre pi grosse muscolari o assoni pi grossi conducono a una velocit maggiore che non bre piccole. La costante di tempo uguale a Rm Cm, vediamo come questi due parametri R e C cambiano al variare della sezione e del diametro, presenta variazioni di alcuni parametri a seconda del raggio dell'assone. Cm e Rm come capacit e resistenze di membrana speciche cio le resistenze di un cm2 di membrana o la capacit di un cm2 di membrana e vediamo come cambia la resistenza o la capacit totale in funzione del raggio. Possiamo dire che questa sar inversamente proporzionale alla circonferenza dell'assone, perch pi un assone grande pi un cm di determinata lunghezza di bra avr supercie di membrana a disposizione, sar pi grande e quindi avr di conseguenza una bassa resistenza perch maggiori sono le vie attraverso le quali la corrente pu passare. In un assone la supercie inversamente proporzionale al raggio e quindi alla circonferenza dell'assone per cui la resistenza di membrana cambia in modo inversamente proporzionale al raggio, la resistenza di membrana si dimezza. La capacit si comporta esattamente all'opposto, se aumentiamo la supercie delle armature del condensatore ovviamente la membrana sar capace di accumulare maggiore quantit di carica elettrica, avremo un condensatore di capacit pi grande e questa volta il raggio della bra sar al numeratore. La capacit aumenta in modo direttamente proporzionale col raggio, raddoppiando il raggio della bra la capacit raddoppia, la resistenza di membrana invece si dimezza. Pi il raggio diventa grande, pi la capacit diventa grande e pi la resistenza diventa piccola. Queste due combinazioni in realt pi o meno si equivalgono per cui se anche raddoppiamo il diametro dell'assone la costante di tempo non cambia in modo apprezzabile perch diminuisce la resistenza, aumenta la capacit e i due fattori si compensano, la costante di tempo grossomodo non cambia (sempre nel caso di una bra amielinica come la muscolare).

Costante di spazio La costante di spazio data

Costante di tempo La costante di tempo data

dal rapporto tra Rm resistenza di membrana e Ri resistenza interna, la resistenza di membrana gi stata trattata prima, inversamente proporzionale al raggio, se raddoppiamo il raggio dimezza la resistenza di membrana, la resistenza invece assiale interna che ore il citoplasma dell'assone e della bra al passaggio di corrente dipender dalla supercie e dall'area di sezione della bra. La ragione per cui un lo di rame di grosse dimensioni ha una minore resistenza di uno di piccole dimensioni analoga alla ragione per cui pi grosso l'assone maggiore sar la quantit di citoplasma che all'interno della bra in grado di condurre la corrente elettrica elettrotonica. La resistenza interna quindi invece sar pro-

5.3. Propagazione e cinetica porzionale inversamente all'area di sezione dell'assone, r2 . La resistenza assiale quindi diminuisce mano a mano che aumenta il diametro dell'assone ma in ragione del quadrato del raggio. Se raddoppiamo quindi il raggio dell'assone la resistenza di membrana si dimezza ma la resistenza interna invece diventer quattro volte pi piccola, la resistenza interna diminuisce in un modo molto pi accentuato rispetto alla resistenza di membrana. Siccome la costante di spazio il rapporto tra Rm e Ra si ottiene che la costante di spazio proporzionale alla radice quadrata del raggio, cio pi la bra grossa pi la costante di spazio lunga, non in modo proporzionale direttamente ma proporzionale alla radice quadrata. La resistenza interna diminuisce in misura maggiore rispetto alla resistenza di membrana, entrambe diminuiscono ma quella interna di pi, se aumentiamo il diametro della bra questo rapporto diventa quindi pi grande e si dimostra che la costante di spazio aumenta in funzione della radice quadrata del raggio (sempre in una bra amielinica o muscolare). Ne risulta quindi che essendo la velocit proporzionale al rapporto tra costante di spazio e costante di tempo, nella bra mielinica la costante di tempo cambia di poco ma cambia molto la costante di spazio, la velocit di conduzione aumenta tanto pi grossa la bra in funzione della radice quadrata del raggio. La costante di tempo non molto inuente e la costante di spazio indica che tanto pi la bra grossa tanto pi lontanto le correnti elettrotoniche sono in grado di uire andando a depolarizzare a livello di soglia zone pi lontane di membrana e quindi la velocit con cui si propaga il potenziale d'azione maggiore. Fibre grosse conducono con una velocit maggiore di bre piccole. depolarizzazione. Il fronte del potenziale d'azione lento produrr correnti locali pi deboli rispetto a un potenziale d'azione di grande ampiezza con un fronte di depolarizzazione molto ripido. Quindi questo parametro dobbiamo inserirlo almeno a livello qualitativo nella considerazione della velocit dove la velocit proporzionale alla costante di spazio e inversamente proporzionale alla costante di tempo. Dobbiamo aggiungere un parametro T a volte chiamato tempo di degenerazione eettivo che dipende da quanto forti e elevate sono queste correnti locali di depolarizzazione. Un potenziale d'azione ripido, una depolarizzazione molto rapida e di grande ampiezza si propagher lungo la bra a una velocit maggiore di un potenziale piccolo con un fronte di depolarizzazione lento. Nelle bre nervose questo non ha molta importanza perch fondamentalmente tutte le bre nervose hanno un potenziale d'azione che si assomiglia, sono pressoch uguali, da -70mV si va a +20-30 mV e la velocit di depolarizzazione costante, la dierenza di velocit di conduzione tra una bra piccola nervosa e una grande dipende solo dal diametro, la forma del potenziale d'azione pi o meno sempre quella. In altre situazioni, in particolare in altre situazione come per esempio nel cuore le cose non stanno cos, le varie parti del cuore generano potenziali d'azione con forme e ampiezze molto diverse, alcune parti del cuore producono dei potenziali d'azione con un fronte di depolarizzazione molto lento e un potenziale d'azione di piccola ampiezza, altre come le bre di Purkinje hanno un fronte di depolarizzazione molto ripido e l'ampiezza del potenziale d'azione molto pi elevata. Vedremo quindi come la velocit di conduzione del potenziale d'azione cambia da un punto all'altro del cuore in virt anche della diversa morfologia del potenziale d'azione generato nei vari punti del cuore. Questo ha delle implicazioni funzionali sul funzionamento del cuore molto importanti. Nel sistema nervoso quindi questi aspetti non sono rilevanti ma bisogna tener presente che la velocit del potenziale d'azione non dipende solo dalla geometria delle bre ma anche dalla morfologia del potenziale d'azione.

Ampiezza dei potenziali Dobbiamo inserire un

altro parametro che determina la velocit di conduzione, escludendo per il momento la bra mielinica, la velocit con la quale si propaga il potenziale d'azione dipender sicuramente dalle caratteristiche geometriche della bra, dalla sua dimensione come visto, per dipender anche dall'intensit di queste correnti elettrotoniche locali. Se queste correnti elettrotoniche locali sono molto intense queste produrranno e porteranno al livello soglia la zona adiacente in modo pi rapido che non se fossero deboli. Queste correnti dipendono da due parametri fondamentalmente: uno dall'ampiezza del potenziale d'azione, se questo punto del potenziale ha un'ampiezza molto grande evidente che la dierenza di potenziale tra zona inattiva e attiva sar maggiore e quindi maggiori saranno le correnti elettrotoniche che uiscono dalla zona attiva a quella inattiva. L'ampiezza del potenziale d'azione importante ma importante anche la pendenza di depolarizzazione del potenziale d'azione, quanto ripido il fronte di

La mielina Bisogna considerare per anche la

presenza della mielina, chiaro che la mielina presente nelle bre che conducono il potenziale d'azione molto velocemente, no a 120 m/s. La presenza di mielina un meccanismo attraverso il quale la velocit di conduzione del potenziale d'azione diventa molto pi elevata che in bre amieliniche, come ad esempio bre muscolari. Oligodendrociti nel SNC e cellule di Schwann nel SNP sono avvolgimenti multipli intorno all'assone, anche centinaia nelle bre pi grosse. Questi avvolgimenti di membrana multipli dal punto di vista elettrico si comportano come un nastro isolante, la mielina ha la funzione di isolare in modo molto migliore l'assone dall'ambien87

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.23: Potenziali a livello del cuore

te extracellulare elettrolitico, ha la funzione di aumentare enormemente la resistenza di membrana, diminuire quindi la possibilit che le cariche elettriche che uiscono all'interno dell'assone hanno di passare attraverso la membrana e andare a disperdersi nell'ambiente extracellulare. A essere precisi aumentando lo spessore dell'isolante in un condensatore si ha anche la funzione di ridurre la capacit di membrana, se prendiamo un isolante e rendiamo pi spesso l'isolante che divide le due armature dal punto di vista sico il condensatore viene ad avere una capacit inferiore. La mielina per non riveste completamente l'assone ma viene interrotta in corrispondenza dei nodi di Ranvier e la distanza di Ranvier dipende dalle bre, nelle bre piccole le distanze sono meno di 100 m, possono essere anche di un m mentre nelle bre pi grosse si pu arrivare a una distanza di 1-2 cm. Come vedremo i nodi di Ranvier sono fondamentali, se non ci sono i nodi di Ranvier il potenziale d'azione non pu progedire. Teoricamente se noi aumentiamo il diametro di una bra amielinica aumentiamo anche la velocit di conduzione. Se andiamo a vedere alcuni assoni non mielinizzati in speci diverse dall'uomo come ad esempio l'assone gigante di calamaro vediamo che

Figura 5.24: Velocit di conduzione e mielina

88

5.3. Propagazione e cinetica questo pu avere un diametro di circa 500 m, sino a mezzo mm. Passando da un assone di 20 m non mieinizzato a uno di 500 m la velocit di conduzione aumenta da 4 m/s circa a circa 20 m/s, l'aumento segue la radice quadrata del raggio e in un graco vediamo che eettivamente anche se non in un modo lineare aumentando le dimensioni degli assoni non mielinizzati aumenta la velocit di conduzione. 20 m/s sono una velocit relativamente bassa per le nostre bre nervose in quanto le pi veloci che hanno un diametro di 20 m nelle bre periferiche hanno una velocit di conduzione essendo mielinizzate che intorno ai 100-120 m/s, per 10 m di diametro si ha una velocit di circa 60 m/s. Vediamo che questo un vantaggio enorme, se dovessimo aumentare le dimensioni della bra per un aumento della velocit di conduzione per ottenere lo stesso risultato utilizzando delle bre amieliniche avremmo delle dimensioni molto maggiori e che condurrebbero comunque a una velocit molto pi lenta con un numero di bre minori. La mielina produce quindi un vantaggio enorme in termini di velocit di conduzione. Per motivi complessi anche nell'assone mielinizzato la velocit di conduzione proporzionale al diametro dell'assone, mentre in quello non mielinizzato la velocit di conduzione aumenta con la radice quadrata del raggio il rapporto tra velocit di conduzione e diametro dell'assone quando l'assone mielinizzato lineare e direttamente proporzionale(la costante di proporzionalit di circa 6 m/s). Ogni m che aumenta il diametro dell'assone la velocit di conduzione aumenta di 6 m/s. Nell'uomo gli assoni non mielinizzati raggiungono al massimo 1 m di diametro, parliamo di bre nervose e quando il diametro supera un m gli assoni diventano mielinizzati. interessante osservare che proprio per questa ragione e per il fatto che in un caso la variazione lineare e nell'altro la variazione proporzionale alla radice quadrata del raggio le due curve per la velocit in una bra mielinizzata e in una non mielinizzata si incontrano in un punto che circa a 1 m di diametro. Estrapolando questi dati per assoni mielinizzati inferiori a 1 m il vantaggio si trasforma in uno svantaggio, in un assone mielinizzato di diametro inferiore al m la velocit inferiore rispetto a quella che avremmo in un assone non mielinico. Sino a 1 m gli assoni quindi sono senza mielina e da diametri dal m in su compare la mielina e la velocit di conduzione diventa proporzionale in modo lineare con il diametro. La mielina svolge questa azione eccezionale di aumentare la velocit di conduzione fondamentalmente perch nell'internodo, tra un nodo di Ranvier e l'altro la resistenza di membrana della bra diventa elevatissima, vuol dire che la costante di spazio diventa molto grande. Questo perch la costante di spazio il rapporto tra Rm e Ra, se Rm diventa molto grande la costante di spazio diventa molto lunga. In altre parole il potenziale d'azione generato in corrispondenza di un nodo di Ranvier con una corrente elettrotonica andr a uire quasi tutta no al nodo di Ranvier successivo e la perdita che si ha nell'internodo tra un nodo e l'altro verso l'esterno sar molto ridotta perch la resistenza di membrana molto elevata grazie all'isolante posto attorno all'assone. Migliorando l'isolamento dall'ambiente extracellulare della bra facciamo in modo che queste correnti elettrotoniche prodotte nel nodo di Ranvier attivo possano uire con pochissima attenuazione sino al nodo di Ranvier successivo. Se tutta questa corrente va a depolarizzare il nodo di Ranvier successivo ovviamente la velocit con la quale questo nodo di Ranvier successivo si depolarizza e raggiunge la soglia sar molto pi rapida perch molta pi corrente riesce ad arrivare a questo livello. Tanto vero che nei nodi di Ranvier questo rapporto dal punto di vista energetico molto favorevole perch i canali voltaggio dipendenti si accumulano e sono molto densi, sono presenti quasi esclusivamente in corrispondenza dei nodi di Ranvier, abbiamo che un nodo di Ranvier ha circa 10'000 canali voltaggio dipendenti al sodio per m2 , quando invece tra un nodo e l'altro dove si ha la presenza di mielina la loro densit molto inferiore e stimata intorno a circa 1000 canali per m2 . Questo vuol dire che anche il lavoro delle pompe diventa molto pi basso, della pompa sodio-potassio in particolare perch soltanto a livello dei nodi di Ranvier avremo un'uscita di potassio e un'entrata di sodio a ogni potenziale d'azione e quindi anche il lavoro che poi le pompe devono fare per mantenere costante la concentrazione sar inferiore con minore consumo energetico. Questa ragione anche la ragione per cui malattie demielinizzanti come la sclerosi multipla o la SLA che appunto producono una perdita di mielina lungo l'assone quando raggiungono un certo livello di gravit impediscono al potenziale d'azione di propagarsi perch in questa zona non abbiamo canali voltaggio dipendenti al sodio. Il potenziale d'azione che viene generato in un nodo di Ranvier non riuscir a raggiungere il nodo successivo e in ogni caso questa malattia demielinizzante altera profondamente la capacit di generare il potenziale d'azione della bra per cui il potenziale d'azione in realt si propaga con decremento. Il potenziale pu arrivare al punto in cui questo non in grado di percorrere tutto l'assone e prima di arrivare a questa situazione estrema in cui la conduzione del potenziale d'azione viene abolita abbiamo come caratteristica fondamentale un rallentamento patologico cospicuo della velocit con la quale il potenziale d'azione si pu propagare. Nella fase quindi iniziale della malattia con metodi diagnostici si verica un rallentamento patologico notevole della velocit con 89

5.

Potenziale d'azione

Figura 5.25: Nodi di Ranvier

la quale il potenziale d'azione viene propagato e si ha man mano il blocco totale della propagazione in assenza di mielina, sia a livello centrale che periferico a seconda della patologia e del grado con cui si manifesta.

90

Le sinapsi
Indice
6.1 Caratteristiche

6.1 Caratteristiche . . . . . . . . . . . . 6.2 Sinapsi chimiche . . . . . . . . . . . 6.2.1 Meccanismo . . . . . . . . . . 6.3 I 5 stadi . . . . . . . . . . . . . . . . 6.3.1 Legame e riconoscimento del neurotrasmettitore . . . . . . 6.3.2 Immagazzinamento del neurotrasmettitore . . . . . . . . 6.3.3 Tracking . . . . . . . . . . . 6.3.4 Concentrazione del neurotrasmettitore . . . . . . . . . . .

. . . .

91 94 97 99

. 100 . 132 . 138 . 143

Abbiamo visto che il potenziale d'azione in grado di trasferire un segnale elettrico da un punto all'altro del neurone lungo tutta la bra no alla sinapsi. Questa informazione poi trasmessa come potenziale d'azione viene trasferita da una cellula all'altra. Siccome esiste una soluzione di continuit tra i neuroni nella maggior parte dei casi il segnale elettrico non pu passare direttamente da una bra all'altra ma in mezzo abbiamo un meccanismo chiamato sinapsi che appunto permette il passaggio del segnale da una cellula a un'altra, dall'elemento presinaptico all'elemento postsinaptico. In realt questo vero nella stragrande maggioranza dei casi, ci sono parecchi esempi sia nel SNC che nel SNP in cui eettivamente il segnale elettrico pu uire direttamente da una cellula all'altra sotto forma di corrente ionica, sotto forma di corrente elettrotonica che pu andare da una cellula all'altra. Nella maggior parte dei casi quindi questo non possibile perch tra l'evento presinaptico e quello postsinaptico esiste uno spazio sinaptico, cio uno spazio riempito da un ambiente elettrolitico che conduce elettricit. Le correnti elettrotoniche che vengono generate dall'evento presinaptico, ad esempio un potenziale d'azione che invade la regione sinaptica, possono depolarizzare la membrana dell'evento presinaptico ma non riescono a uire attraverso la membrana dell'elemento postsinaptico perch vengono cortocircuitate dal mezzo conduttore presente nello spazio sinaptico. Queste correnti elettriche quindi elettrotoniche si fermano a livello del bottone sinaptico e non possono andare a depolarizzare direttamente l'elemento postsinaptico.

Sinapsi chimiche
La trasmissione in questo caso garantita dal rilascio di un neurotrasmettitore chimico perch l'invasione del potenziale d'azione da parte del bottone sinaptico induce il bottone sinaptico stesso a rilasciare una sostanza chimica che dionde nello spazio sinaptico tra i due neuroni e sar in grado di determinare delle azioni a livello postsinaptico, azioni 91

C a p i t o l o

6.

Le sinapsi

Figura 6.1: Tipica sinapsi

che non sono altro che la produzione di potenziali sinaptici, variazioni del potenziale di membrana dell'evento postsinaptico.

Sinapsi elettriche
Parliamo quindi di sinapsi di tipo chimico perch la mediazione adata a un meccanismo di rilascio di sostanze chimiche, i neurotrasmettitori. Ci sono per molti casi, pi frequenti di quelli che si potrebbero immaginare in cui invece tra l'elemento presinaptico e postsinaptico esistono dei passaggi a bassa resistenza elettrica tra i due citoplasmi. In questo caso parliamo di sinapsi di tipo elettrico in quanto abbiamo la presenza di giunzioni comunicanti, gap junction nelle quali le membrane delle due cellule dell'evento sinaptico vanno molto vicine una all'altra, lo spazio di 5 nm, permettono l'interfacciamento di due emicanali ionici chiamati connessoni. Questi sono canali molto grossi molto poco selettivi e fondamentalmente sono delle vie a bassa resistenza elettrica che praticamente mettono in connessione i due ambienti citoplasmatici. Questi canali quindi consentono alle correnti elettrotoniche generate dall'evento presinaptico di uire direttamente attraverso questi pori andando a depolarizzare direttamente la membrana postsinaptica. La propagazione del potenziale d'azione quindi di tipo elettrico che fra l'altro ha la peculiarit di essere una trasmissione estremamente veloce. Questi connessoni hanno una struttura particolare, sono formati ciascuno da sei subunit tutte uguali chiamate connessine, ciascuna connessina ha una struttura ben particolare, formata da quattro domini transmembranari. Questi connessoni in realt sono di tanti tipi diversi, non dobbiamo immaginare dei pori sempre aperti, a bassa resistenza elettrica sempre disponibili ma in molti casi questi connessoni si possono aprire o chiudere con movimenti rotatori si suppone attorno all'asse longitudinale di tipo otturatorio per cui alcune condizioni, tipicamente un abbassamento del pH o in alcuni casi un aumento 92

del calcio, permettono l'apertura o la chiusura di queste vie. La connessione tra le due cellule quindi non sempre presente. Le caratteristiche delle sinapsi elettriche sono diverse. Una caratteristica che queste connessioni sono normalmente anche se non sempre bidirezionali, siccome il passaggio del segnale avviene per passaggio diretto della corrente attraverso queste vie a bassa resistenza, questi pori, evidente che se due cellule sono interconnesse da una sinapsi elettrica se depolarizziamo il neurone A il segnale passer al neurone B ma anche viceversa. Non tutte le sinapsi elettriche sono propriamente bidirezionali, in alcuni casi abbiamo delle sinapsi elettriche retticanti, fanno passare pi facilmente la corrente elettrica in una direzione piuttosto che nell'altra e quindi questa bidirezionalit non sempre presente. La bidirezionalit implica innanzitutto che non importa dove nasce il potenziale d'azione e una volta che nasce in un punto questo potenziale d'azione andr a depolarizzare tutta la rete di cellule connessa da una sinapsi elettrica, l'esempio che ci riguarder pi da vicino sar il cuore, le cellule cardiache sono connesse una all'altra da sinapsi elettriche, nel caso del cuore non si parla solitamente di sinapsi perch il termine indirizzato al sistema nervoso ma dal punto di vista funzionale sono sinapsi elettriche, ci sono gap junction che uniscono a livello dei dischi intercalari le varie cellule cardiache. Non importa quindi dove nasce il potenziale d'azione nel cuore, una volta che nasce in un punto qualsiasi questo andr a depolarizzare tutto il resto del cuore. Fisiologicamente il potenziale d'azione nasce sempre all'interno di una certa parte del cuore e procede in modo ordinato a depolarizzare il resto dei tessuti ma pu anche non essere cos in condizioni patologiche, ci sono potenziali che nascono in punti non canonici ma possono produrre comunque una contrazione di tutto il miocardio. Si possono avere sinapsi elettriche anche a livello della muscolatura liscia, pensiamo alla contrazione peristaltica che si propaga lungo la tonaca muscolare di un organo cavo come l'intestino e una volta generato in un punto il potenziale d'azione questo lentamente va a depolarizzare tutte le cellule adiacenti attraverso delle giunzioni di tipo elettrico. Nel sistema nervoso centrale pure vi sono delle situazioni in cui sono presenti sinapsi elettriche, anzi molto pi frequenti di quello che possiamo immaginare. Per esempio ci sono alcune strutture nervose in cui le cellule tendono a scaricare all'unisono o comunque tendono a scaricare in modo sincrono nella rete nervosa come nell'oliva inferiore. Questo reso possibile dalla presenza di sinapsi elettriche oltre a quelle chimiche, ogni qual volta una cellula produce un potenziale d'azione questo produrr una certa dose di depolarizzazione anche nelle cellule vicine che tenderanno a scaricare pi facilmente quando

6.1. Caratteristiche

Figura 6.2: Sinapsi elettriche e chimiche

Figura 6.3: Gap junction

93

6.

Le sinapsi

Figura 6.4: Bidirezionalit

scarica un elemento della rete. Quindi questo fa si che queste cellule tendano a scaricare in modo sincrono. La bidirezionalit quindi una caratteristica, l'altro aspetto importante praticamente l'assenza del ritardo sinaptico. Come vedremo le sinapsi chimiche quando vengono attivate rallentano la propagazione del potenziale e del segnale di qualcosa che nel caso pi veloce pu essere mezzo ms, si ha un rallentamento sinaptico che prende il nome di ritardo sinaptico delle sinapsi chimiche e questo nelle sinapsi elettriche non presente. La velocit di trasmissione essendo adata a queste correnti elettriche elettrotoniche praticamente la velocit di trasmissione delle bre che prendiamo in considerazione. Tutto questo molto diverso per le sinapsi chimiche. Le sinapsi chimiche sono determinate innanzitutto da una complessit strutturale molto maggiore, abbiamo l'elemento presinaptico con delle sue specializzazioni e un elemento postsinaptico con a sua volta delle sue specializzazione e questo fa si che la propagazione del segnale sia strettamente unidirezionale. Nelle sinapsi chimiche il segnale va dall'ambiente presinaptico a quello postsinaptico e non quindi bidirezionale.
6.2 Sinapsi chimiche

A livello presinaptico abbiamo i bottoni sinaptici dove osserviamo degli elementi peculiari. Innanzitutto troviamo la presenza di molti mitocondri, questo vuol dire che una centrale metabolica molto importante, durante la sinapsi viene consumata molta energia che deve anche essere prodotta, ci sono varie fasi che richiedono un cospicuo consumo energetico. Sono presenti poi molte vescicole che 94

sono quelle che contengono il neurotrasmettitore, cio la sostanza che viene poi rilasciata nello spazio postsinaptico e che permette la trasmissione del segnale. Queste vescicole vengono rilasciate nello spazio sinaptico non in un punto qualunque della membrana ma anche qui in presenza di specializzazioni particolari, ci sono degli ispessimenti della membrana chiamate zone attive. Queste vescicole vengono svuotate all'esterno per un meccanismo di esocitosi in corrispondenza soltanto delle zone attive e questo molto importante perch consente una elevata velocit della trasmissione sinaptica, la sinapsi introduce un ritardo sinaptico ma questo ritardo molto piccolo fortunatamente perch ci sono meccanismi molto ecienti attraverso i quali pu avvenire l'esocitosi delle vescicole sinaptiche nello spazio sinaptico. In realt di vescicole sinaptiche ne esistono di due tipi. Nella maggior parte dei casi si hanno piccole vescicole chiare, 50-60 nm di diametro, che sono quelle che contengono i neurotrasmettitori classici o a basso peso molecolare. Esistono altre vescicole pi grosse che non sono presenti in tutti i neuroni ma in molti neuroni che sono chiamate vescicole grosse a centro scuro, talvolta chiamate granuli, con un diametro molto maggiore che contengono invece un altro tipo di neurotrasmettitori, i trasmettitori di tipo neuropeptidico. I neuropeptidi sono dei neurotrasmettitori che hanno un'azione tipicamente modulatoria sull'attivi del neurone postsinaptico, non sono responsabili di modicazioni rapide del potenziale di membrana postsinaptico ma semplicemente una volta rilasciati alterano a lungo termine le capacit di risposta del neurone postsinaptico quindi si parla di una neuromodulazione e di neurotrasmissione. Questi neurotrasmettitori vengono rilasciati

6.2. Sinapsi chimiche

Figura 6.5: Assenza di ritardo sinaptico

non ogni qual volta il potenziale d'azione attiva il bottone sinaptico, normalmente vengono rilasciati solo quando il bottone sinaptico viene attivato in modo ripetitivo e ripetuto. Un'attivazione continuata del bottone sinaptico produce il rilascio anche di questi neuropeptidi e di questi granuli attraverso queste vescicole elettrondense. Non dobbiamo pensare che le sinapsi contengano o un tipo o l'altro di neurotrasmettitori, ci sono alcune sinapsi che non hanno neuropeptidi ma molte sinapsi hanno la possibilit sia del rilascio di neurotrasmettitori classici sia di neuropeptidi, talvolta si ha un corilascio tenendo sempre presente che il neuropeptide viene rilasciato quando la sinapsi viene attivata in modo ripetuto. Il meccanismo di rilascio delle due vescicole molto diverso, le vescicole a centro chiaro vengono rilasciate molto rapidamente in corrispondenza delle zone attive e deve essere cos perch ad esse afdata la velocit di trasmissione sinaptica, invece le altre vescicole a centro denso possono essere rilasciate in qualunque punto della membrana, non necessariamente nelle zone attive e questo giustica anche il fatto che non necessario un rilascio rapido del neurotrasmettitore che invece avviene lentamente quando la sinapsi attivata in modo ripetuto. Questa una dierenza importante, l'altra dierenza importante che le vescicole chiare piccole che contengono i neurotrasmettitori classici a basso peso molecolare vengono riempite e vengono preparate nel bottone sinaptico perch il neurotrasmettitore viene sintetizzato a livello del bottone sinaptico. Questo ovvio perch la sinapsi viene attivata in continuazione quindi le vescicole vengono continuamente rilasciate e bisogna avere un meccanismo rapido locale che prepari nuove vescicole mano a mano che vengono svuotate quelle che sono state utilizzate, ci sono meccanismi ecienti di sintesi del neurotrasmettitore locale che viene immagazzinato nella vescicola sinaptica. I neuropeptidi essendo quindi peptidi cio catene aminoacidiche devono essere invece sintetizzati a livello del nucleo della cellula nel soma, qui che abbiamo i ribosomi e la macchina di sintesi proteica, queste vescicole a centro denso quindi vengono prodotte a livello del soma cellulare e vengono trasportare attraverso il 95

6.

Le sinapsi

Figura 6.6: Sinapsi chimiche

usso assonico sino al bottone sinaptico. Questo un processo molto pi lento compatibile col fatto che queste vescicole vengono rilasciate anch'esse in modo lento e in quantit minore. La distanza tra le sinapsi molto diversa, siamo intorno a 3,5 nm per le sinapsi elettriche mentre questa molto maggiore, qualche decina di nm per le sinapsi chimiche. Esiste una continuit citoplasmatica tra quelle elettriche prodotta dai canali delle giunzioni comunicanti e dai connessoni per cui il fattore della trasmissione sono le correnti ioniche che producono un ritardo sinaptico praticamente assente e normalmente sono bidirezionali. Per quanto riguarda le sinapsi chimiche abbiamo dei motivi strutturali molto complessi, i neurotrasmettitori sono di natura chimica e quindi tutto questo processo fa si che vi sia un ritardo sinaptico prodotto dal tempo che ci vuole per l'esocitosi e per l'attivazione postsinaptica dei meccanismi che vedremo. Queste sinapsi sono quasi sempre strettamente unidirezionali. Le sinapsi elettriche sono sempre eccitatorie perch il segnale elettrico uisce da una cellula all'altra in modo elettrotonico con una depolarizzazione delle cellule, per le sinapsi chimiche l'eetto pu essere duplice, pu essere di tipo eccitatorio o di tipo inibitorio. Normalmente ma non in modo stretto le sinapsi eccitatorie sono collocate principalmente a livello dei dendriti spesso in presenza di specializzazioni particolari chiamate spine dendritiche. Le sinapsi inibitorie pi frequentemente e capiremo poi 96 meglio il perch dell'importanza di questa posizione sono situate a livello del soma, l'inibizione come vedremo funziona meglio se l'azione sinaptica avviene vicino al cono di emergenza dell'assone. Le sinapsi di tipo eccitatorio e inibitorio normalmente anche se non in modo stretto hanno delle morfologie diverse, si parla di sinapsi di tipo I per sinapsi assodendendritiche sulle spine o no caratterizzate da vescicole sinaptiche tonde, da uno spazio sinaptico ampio e con zone attive molto larghe che le contraddistinguono da sinapsi di tipo II che normalmente sono inibitorie a livello del soma, le quali hanno vescicole sinaptiche appiattite ovali in sezione, hanno uno spazio sinaptico pi stretto e delle zone attive pi piccole. Le sinapsi di tipo I solitamente sono solitamente di tipo eccitatorio, a causa degli eventi sinaptici che prenderemo in esame meglio successivamente l'eetto postsinaptico una depolarizzazione che prende il nome di potenziale postsinaptico eccitatorio. Una membrana dal valore di riposo si depolarizza e questa depolarizzazione solitamente di pochissimi mV, solitamente sono depolarizzazioni molto piccole, tant' vero che per modicare in modo signicativo la frequenza di scarico del neurone postsinaptico necessario attivare numerose sinapsi sia nel tempo che nello spazio con i processi integrativi di sommazione spaziale e temporale. Abbiamo per anche sinapsi che invece hanno un'azione inibitoria, l'attivazione della sinapsi produce una iperpolarizzazione della membrana e quindi una minore probabilit di scarica del potenziale d'azione e una

6.2. Sinapsi chimiche

Figura 6.7: I due tipi di vescicole

riduzione della frequenza di scarica. eventi semplicando moltissimo la seguente: la depolarizzazione della membrana del bottone sinaptico perch si ha l'invasione del bottone sinaptico da parte del potenziale d'azione induce l'apertura di canali al calcio voltaggio dipendenti situati vicino alle zone attive e attraverso l'attivazione di questi canali il calcio dallo spazio extracellulare pu entrare nell'ambiente intracellulare nel citoplasma. La concentrazione intracellulare di calcio tipicamente attorno a 107 M, praticamente non ce n', esiste un fortissimo gradiente di concentrazione per il calcio, quando si aprono questi canali il calcio entra nel bottone sinaptico e solo allora viene promossa l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Anche qui non dobbiamo immaginare che qualunque vescicola sinaptica presente nel bottone sinaptico cominci a migrare e vada a svuotarsi nello spazio sinaptico ma l'entrata di calcio promuove l'esocitosi soltanto di quelle vescicole che sono gi attaccate alla zona attiva della membrana presinaptica. Questo con97

6.2.1 Meccanismo
Sebbene vi siano molte dierenze strutturali e anche funzionali tra i vari tipi di sinapsi nel SNC, ci sono centinaia di sinapsi diverse sia perch con caratteristiche diverse morfologiche che topograche, il meccanismo generale di funzionamento delle sinapsi chimiche lo stesso in tutto il nostro organismo. Il meccanismo fondamentale attraverso il quale avviene l'esocitosi delle vescicole sinaptiche nello spazio sinaptico un meccanismo che prevede l'entrata di calcio all'interno del bottone sinaptico. Non dobbiamo pensare che l'esocitosi venga prodotta direttamente dalla depolarizzazione indotta dal potenziale d'azione. La depolarizzazione della membrana del bottone sinaptico in assenza di calcio nell'ambiente extracellulare non induce alcuna liberazione di neurotrasmettitore. La successione degli

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Le sinapsi

Figura 6.8: Potenziale eccitatorio

Figura 6.9: Meccanismo sinaptico

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6.3. I 5 stadi sente un'elevata velocit di trasmissione sinaptica, non ci sarebbe tempo per far si che qualsiasi vescicola presente nel pool sinaptico possa migrare, attaccarsi alla membrana e poi svuotarsi all'esterno, cosa perarltro che avviene per le vescicole a centro denso che contengono i neuropeptidi, in questo caso infatti la trasmissione sinaptica estremamente lenta. Questo neurotrasmettitore viene rilasciato nello spazio sinaptico e dionde passivamente in questo, abbiamo visto che per queste distanze di poche decine di nm la velocit di diusione elevatissima, siamo nell'ordine di microsecondi perch gli spazi sono molto piccoli, per l'equazione di Einstein della diusione sostituendo i valori otteniamo questi tempi. Questo sta a indicare che il ritardo sinaptico non per nulla determinato dal tempo di diusione del neurotrasmettitore perch praticamente il tempo di diusione non inuisce per nulla nel ritardo sinaptico o lo fa in modo assolutamente marginale. Si ha diusione semplice no a quando il neurotrasmettitore non raggiunge la membrana postsinaptica nella quale devono essere presenti dei recettori, dei recettori che lo riconoscono. Come vedremo questa la parte pi complessa della sinapsi perch a livello postsinaptico vi sono tantissimi tipi di recettori che hanno azioni postsinaptiche molto diversicate l'una dall'altra e la stessa membrana postsinaptica pu avere recettori per sostanze diverse, per neurotrasmettitori diversi. Non solo ma anche pu avere recettori diversi per lo stesso neurotrasmettitore e ciascun recettore quando viene attivato produce degli eetti postsinaptici diversi per cui poi l'eetto postsinaptico normalmente estremamente complesso e presenta un'interazione dei sistemi recettoriali a volte anche molto dicili da comprendere. Il meccanismo generale per questo, se togliamo il calcio dall'ambiente extracellulare o impediamo al calcio di entrare la trasmissione sinaptica viene totalmente bloccata. Questo in tutte le sinapsi del nostro organismo, sia nel SNC che nel SNP di tipo chimico.
6.3 I 5 stadi

sintesi del neurotrasmettitore. Dovremo prendere in esame inoltre il meccanismo attraverso il quale il neurotrasmettitore viene immagazzinato nelle vescicole poich la sintesi nella stragrande maggioranza dei casi avviene a livello citoplasmatico, il neurotrasmettitore viene sintetizzato nel citoplasma e poi deve essere concentrato e immagazzinato all'interno delle vescicole sinaptiche. Ci dovranno essere quindi meccanismi che immagazzinano tipicamente contro gradiente di concentrazione il neurotrasmettitore all'interno della vescicola e questo un processo che ovviamente consuma energia. Ci dovranno essere dei meccanismi attraverso i quali la vescicola viene rilasciata nello spazio sinaptico attraverso un meccanismo di esocitosi e questo riguarder sia la mobilizzazione delle vescicole dal pool di riserva del bottone sinaptico sia il meccanismo di attracco e rilascio della vescicola nella zona attiva. Avremo poi la quarta fase che il legame e il riconoscimento del neurotrasmettitore da parte dei recettori. Da questo punto di vista i recettori possono essere divisi in tre grandi gruppi, due situati a livello postsinaptico, cio quei recettori che permettono alla cellula postsinaptica di rispondere alla trasmissione sinaptica dei fenomeni che in lunga analisi porteranno a una variazione del potenziale di membrana ma non solo e come vedremo avremo due tipi di recettore, ionotropici e metabotropici. Abbiamo anche degli autorecettori, dei recettori situati sul bottone sinaptico stesso che legano sulla membrana presinaptica il neurotrasmettitore stesso rilasciato dal bottone. Questi hanno la funzione di modulare a seconda dei casi sia la sintesi che il rilascio del neurotrasmettitore da parte del bottone sinaptico. Ci sono dei meccanismi a feedback tipicamente di tipo negativo ma a volte anche positivo di regolazione dei meccanismi presinaptici operati dal neurotrasmettitore stesso. Gi questo ci fa intravedere come la sinapsi non sia un meccanismo sso che funziona sempre nello stesso modo ma un meccanismo estremamente plastico che modica i meccanismi di trasmissione in funzione dell'attivit sinaptica stessa in un modo estremamente complesso. Questo un sistema detto di plasticit sinaptica. Inne il quinto stadio ovviamente la terminazione dell'azione del neurotrasmettitore, se viene rilasciato un neurotrasmettitore e questo rimane nello spazio sinaptico la trasmissione non avr mai ne se il neurotrasmettitore non viene rimosso, ci sono dei meccanismi che devono rimuovere il neurotrasmettitore e questi sono molto complessi perch i meccanismi sono fondamentalmente tre: uno dato dal bottone sinaptico che si riappropria del neurotrasmettitore facendo un reuptake di questo utilizzando parte di trasportatori che prendono il neurotrasmettitore e lo rendono di nuovo disponibile all'interno del bottone sinaptico, un altro meccanismo importante soprattutto per alcuni neurotrasmettitori sono le cellule gliali che non 99

Prenderemo in esame i cinque stadi della trasmissione sinaptica chimica. Anch ci possa essere trasmissione sinaptica occorre sicuramente che il bottone sinaptico sia in grado di sintetizzare il neurotrasmettitore nel neurone appunto coinvolto. Devono esserci quindi enzimi e cofattori necessari per la sintesi, stiamo parlando di neurotrasmettitori classici a basso peso molecolare, quelli che garantiscono la trasmissione sinaptica veloce. Abbiamo detto che per i neuropeptidi questi vengono sintetizzati a livello del soma e poi trasportati a livello del bottone sinaptico. Dovremo prendere in considerazione per i vari neurotrasmettitori quali sono i meccanismi di

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Le sinapsi

Figura 6.10: Regolazione diretta e indiretta

sono semplici spettatori ma hanno un ruolo attivo, in particolare sono in grado in molti casi di rimuovere il neurotrasmettitore dallo spazio sinaptico e in alcuni casi abbiamo anche degli enzimi metabolizzanti presenti nello spazio sinaptico che metabolizzano il neurotrasmettitore e lo rendono inecace modicandolo chimicamente. Gli stadi della trasmissione sinaptica che prenderemo in esame sono cinque. Anch una sinapsi possa funzionare correttamente occorre necessariamente che il neurotrasmettitore venga sintetizzato, che venga quindi immagazzinato attraverso meccanismi di trasporto attivo dentro le vescicole sinaptiche, ci sono meccanismi complessi in realt che permettono l'esocitosi delle vescicole nello spazio sinaptico quando giunge il potenziale d'azione. Ci sono poi meccanismi di legame del neurotrasmettitore con i recettori che mediano gli eetti sinaptici del neurotrasmettitore e inne occorreranno meccanismi che bloccheranno l'azione del neurotrasmettitore in vario modo a seconda anche del tipo di neurotrasmettitore liberato.

6.3.1 Legame e riconoscimento del neurotrasmettitore

Analizziamo in modo pi dettagliato il quarto stadio: il legame e il riconoscimento del neurotrasmet100

Figura 6.11: Esempi di canali

6.3. I 5 stadi titore con i recettori, in particolare ci soermeremo sui recettori postsinaptici lasciando gli autorecettori a un'analisi semplice successiva quano parleremo dei meccanismi presinaptici. Il neurotrasmettitore dopo che stato rilasciato nello spazio postsinaptico dionde nello spazio sinaptico in tempi brevi di pochi microsecondi e raggiunge la supercie della membrana postsinaptica. Ci sono due classi di recettori che hanno meccanismi d'azione molto diversi, i primi vengono chiamati recettori ionotropici e sono recettori canale, sono cio canali ionici che posseggono sulla supercie esterna, sulla parte extracellulare un sito recettoriale che in grado di riconoscere specicamente il neurotrasmettitore. Quando ci avviene questo un canale regolato chimicamente che cambia la sua conformazione da aperta a chiusa con un immediato e veloce cambiamento della conduttanza per alcuni ioni. Questo il meccanismo pi rapido attraverso il quale una sinapsi in grado di modicare il potenziale di membrana di una cellula postsinaptica in quanto il neurotrasmettitore lega direttamente a un canale ionico che cambia la sua conformazione e quindi immediatamente cambia la conduttanza ionica del canale che indurr una variazione del potenziale di membrana, quello che chiamiamo potenziale sinaptico o potenziale postsinaptico. L'altro tipo di recettore un recettore in realt molto diuso in tutto il sistema nervoso sia centrale che periferico nel quale invece il recettore, cio la proteina recettoriale che sta sulla membrana diversa dalla proteina canale che modica la conduttanza di membrana. Recettore ed eettore sono quindi due molecole distinte e il collegamento tra le due avviene attraverso sostanze chimiche detti mediatori intracellulari, sostanze chimiche che sono appunto i secondi messaggeri. Ci sono molti sistemi di secondi messaggeri, questi recettori sono comunque tutti legati all'attivazione di una proteina G di vario tipo che in modi molto complessi come vedremo sono in grado di indurre modicazioni postsinaptiche. Ci concentreremo sulle modicazioni postsinaptiche che riguardano conduttanze di membrana ma bisogna sottolineare come queste sinapsi e questi recettori legati alle proteine G hanno un ampissimo ventaglio di possibilit di azioni postsinaptiche, il cambiamento della conduttanza postsinaptica e quindi aprire o chiudere canali ionici solo una di queste. Attraverso l'attivazione di proteine G e l'attivazione di secondi messaggeri intracellulari questi possono agire a vari livelli sul metabolismo della cellula postsinaptica, possono agire a lungo andare anche no a indurre delle trascrizioni geniche alterate o modicazioni geniche, cambiamenti che possono essere molto a lungo termine. Abbiamo quindi un meccanismo molto rapido ma relativamente sso e un meccanismo molto plastico con un ventaglio di possibilit molto ampie ma che ha la caratteristica di essere attivato in modo molto pi lento. Possiamo riassumere le caratteristiche principali delle due famiglie di recettori, ionotropici e metabotropici legati a proteine G. Le due funzioni, cio il riconoscimento del neurotrasmettitore e l'attivazione dell'eettore sono eseguite da una sola proteina nei canali ionotropici che in realt sono canali ionici regolati chimicamente, hanno un'azione molto rapida nell'ordine dei millisecondi e questa termina anche in un modo rapido, la loro azione quella di produrre un cambiamento veloce del potenziale di membrana. Quelli metabotropici invece associati a proteine G hanno funzioni eseguite da molecole distinte, hanno un'azione molto pi lenta e di lunga durata, da secondi a giorni in certi casi o per un tempo indenito. Questi recettori sono molto diusi e molto importanti perch determinano variazioni a lungo termine dell'eccitabilit dei neuroni, modicano in modo plastico la forza delle connessioni sinaptiche e sono in realt pesantemente coinvolti nei meccanismi di plasticit neuronale e di apprendimento, sono meccanismi molto pi complessi e di lunga durata mentre il passaggio di informazioni da un neurone all'altro normalmente adato principalmente a recettori di tipo ionotropico.

Recettori ionotropici
I recettori ionotropici regolati chimicamente sono recettori come forma generale e struttura generale a cinque subunit. I canali ionici regolati chimicamente hanno una struttura nella maggior parte dei casi composta da subunit, normalmente cinque ma ci sono alcune importanti eccezioni, ciascuna delle quali presenta quattro domini transmembranari M1-M4 per ogni subunit. Come esempio iniziale prendiamo un recettore molto importante e molto studiato che il recettore per l'ach presente nella placca neuromuscolare. Descriviamo in modo dettagliato la funzione e la struttura di questo recettore e estendiamo il concetto ad altri recettori ionotropici soprattutto presenti nel SNC.

Placca neuromuscolare Partiamo dalla placca

neuromuscolare, che non altro che una sinapsi fortemente specializzata tra assone del motoneurone e bra muscolare striata. Ciascuna bra muscolare striata riceve uno e un solo assone motorio ed presente una sola sinapsi e una sola placca motrice, questa struttura chiamata placca motrice per la struttura e l'ispessimento della membrana che presenta questa struttura particolare. Questa sinapsi molto particolare e costituisce una sorta di eccezione nel panorama delle sinapsi del nostro organismo in quanto la peculiarit che il potenziale postsinaptico indotto dall'attivazione di questa sinapsi molto ampio, 70 mV, questo signica che ogni qual volta un potenziale d'azione invade la placca mo101

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Le sinapsi

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6.3. I 5 stadi trice il potenziale postsinaptico di ampiezza suciente da portare il potenziale della bra muscolare sopra soglia, la bra muscolare scarica quindi il potenziale d'azione e la bra si contrae. L'eccezione data dal fatto che come abbiamo detto la maggior parte dei potenziali postsinaptici nell'ordine di pochi mV, quindi normalmente un solo potenziale non in grado di produrre una variazione signicativa della scarica della risposta postsinaptica come uno scarico di potenziale. Il potenziale postsinaptico in questo caso talmente ampio che in condizioni siologiche la bra postsinaptica produce sempre un potenziale d'azione e si contrae. Si parla infatti di unit motoria per indicare l'insieme di un singolo motoneurone e di tutte le bre muscolari da questo innervate perch ogni qual volta un motoneurone scarica un potenziale d'azione tutte le bre muscolari striate da questo innervate si contraggono all'unisono perch tutte le bre innervate producono un potenziale d'azione e quindi si contraggono. Ciascuna bra muscolare riceve un solo assone motorio, con una sola placca motrice, normalmente ciascun motoneurone invece produce molti collaterali che innervano un numero anche molto elevato di bre muscolari, tipicamente alcune centinaia, nei grossi muscoli del dorso si pu arrivare a migliaia di bre muscolari innervate da un solo motoneurone. Questo vuol dire che ogni volta che il motoneurone scarica il potenziale d'azione tutte quelle bre muscolari da lui innervate per l'unit motoria si contraggono. Abbiamo questa peculiarit di ampiezza del potenziale postsinaptico perch l'assone del motoneurone quando raggiunge la placca motrice perde la mielina e si socca in numerosissimi collaterali, ciascun collaterale forma un numero pi o meno elevato di bottoni sinaptici. Alcune placche possono avere centinaia di bottoni sinaptici, a seconda delle dimensioni della bra e del motoneurone. Viene attivata quindi in ciascuna placca ciascun bottone sinaptico che ha esattamente la stessa struttura dei bottoni sinaptici presenti nel SNC, il fatto che depolarizzi un numero cos elevato di bottoni sinaptici porter a un elevatissimo rilascio di acetilcolina nelle zone attive, ciascuna zona attiva ha una certa probabilit che la vescicola venga rilasciata. La quantit elevata di neurotrasmettitore rilasciato a questo livello della placca motrice porter a una forte depolarizzazione della membrana postsinaptica che normalmente nell'ordine dei 60-70 mV. La struttura particolare perch come vediamo a livello postsinaptico la membrana postsinapica presenta delle pliche giunzionali, la membrana cio si invagina pi volte sotto il bottone sinaptico in corrispondenza delle zone attive e questo ha la funzione di aumentare enormemente la supercie della membrana postsinaptica, e i recettori ionotropici che legano acetilcolina rilasciata come neurotrasmettitore sono situati sulle creste delle pliche giunzionali.

Figura 6.13: Autoradiograa con bungarotossina Caratteristiche Questi recettori sono stati studiati ampiamente e sequenziati, sappiamo la loro sequenza aminoacidica, sono state fatte anche ricostruzioni morfologiche. I recettori vengono identicati in autoradiograa attraverso l'utilizzo di una tossina, un veleno molto potente, l'bungarotossina marcata in modo radioattivo e questa sostanza ha la propriet di legarsi in modo irreversibile e con una grandissima anit sui recettori dell'ach di questi canali. Possiamo vedere quindi la posizione dei recettori e vediamo che mediamente sono situati sulla parte alta delle pliche funzionali in corrispondenza delle zone attive. La loro morfologia quella generale dei canali ionotropici, hanno una zona transmembranaria e in concomitanza di questa zona transmembranaria abbiamo il ltro di selettivit e la porta di apertura e chiusura e abbiamo un dominio extracellulare molto ampio, la maggior parte della proteina canale protrude verso l'esterno della cellula. A met circa abbiamo il recettore per l'ach. La struttura di questo canale stata molto ben studiata e vediamo le sue caratteristiche principali. Le subunit sono cinque, nel caso specico di questi recettori che vengono chiamati recettori nicotinici dell'ach due sono identiche, le , poi abbiamo tre subunit diverse, , e . I recettori per l'ach sono situati sulla subunit , ci signica che ciascun canale nicotinico regolato dall'ach lega due moleco103

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Le sinapsi

Figura 6.14: Canali per ACH

le di ach e per aprirsi ha bisogno che due molecole di ach si leghino sulla subunit . Quando questo avviene il canale cambia conformazione e da aperto diventa chiuso. Ciascuna subunit ha una struttura generale di quattro domini transmembranari come gi analizzata precedentemente. In una ricostruzione tridimensionale vediamo una zona traslucida che viene inglobata nella membrana, la parte idrofobica che si interfaccia con i fosfolipidi di membrana, abbiamo una parte extracellulare molto ampia, dentro il canale e vediamo che all'interno di questo canale vi sono delle tasche che sono dei canali nei quali l'ach deve entrare per potersi legare al recettore perch sembra strano ma il recettore per l'ach non esposto all'esterno del canale ma all'interno del canale in queste tasche la cui apertura avviene all'interno del poro. Per quanto riguarda la parte centrale transmembranaria abbiamo il ltro di selettivit. Possiamo cercare di capire come funziona, dei quattro domini transmembranari che compongono ciascuna subunit quello denominato 104 M2 quello che si sporge ed rivolto verso il poro del canale all'interno. Sequenziando questo dominio M2 vediamo che le sequenze aminoacidiche sono diverse per le varie subunit , , e . Vediamo che subito sopra e subito sotto la parte transmembranaria questi M2 presentano dei residui aminoacidici con carica negativa, soprattutto glutammato e aspartato. Subito sopra e sotto la membrana e la parte transmembranaria quindi abbiamo degli anelli ricchi di cariche negative che hanno un'azione repulsiva verso tutti gli anioni che non riescono a passare. Come vedremo infatti in realt questo canale un canale poco selettivo, ha una selettivit molto spiccata per i cationi e passa pi di una specie cationica, in particolare soprattutto sodio e potassio, il calcio molto meno in questo tipo di canale e gli anioni sono bloccati. Quando questo canale si apre il sodio pu entrare, il potassio pu uscire, il calcio entra molto meno mentre il cloro viene bloccato da questi tre anelli di cariche negative situati intorno alla porzione transmebranaria dei domini M2 delle

6.3. I 5 stadi

Figura 6.15: Sito di legame per ACH

cinque subunit. Dall'altra parte ci sono altre proteine come la rapsina che sono proteine che hanno la funzione di ancorare in posizione i recettori in corrispondenza dei bottoni sinaptici. vero che ogni qual volta il potenziale d'azione raggiunge la placca motrice la cellula postsinaptica cio la bra muscolare scarica un potenziale d'azione, il neurotrasmettitore produce un potenziale graduato che si chiama potenziale sinaptico e soltanto quando questo potenziale raggiunge la soglia si ha la generazione di un potenziale d'azione. I meccanismi che stanno alla base della generazione del potenziale sinaptico che in questo caso specico prende il nome di potenziale di placca, un potenziale postsinaptico eccitatorio che viene generato nella corrispondenza della placca motrice sono gli stessi. Il potenziale di placca un fenomeno graduato che siologicamente talmente ampio da portare il potenziale di membrana sempre sopra la soglia e quindi verr generato sempre un potenziale d'azione. I meccanismi di membrana che generano i due fenomeni sono per completamente distinti e separati. Il potenziale d'azione viene generato dai canali voltaggio dipendenti per il sodio e per il potassio che sono situati in vicinanza della placca muscolare mentre il potenziale sinaptico di placca viene generato da quei canali ionotropici di cui parlavamo prima regolati dall'ach. Tant' vero che noi possiamo ridurre l'ampiezza del potenziale postsinaptico in vari modi. In biologia possiamo sfruttare la presenza di anticorpi contro questi canali nicotinici e questi recettori nicotinici, nella miastenia gravis pu succedere che in molti muscoli in modo progressivo l'ach non in grado di produrre potenziali postsinaptici sucientemente alti da far scaricare la cellula muscolare e quindi la cellula muscolare non si contrae, con evidente risultato di debolezza muscolare e al punto estremo paralisi. In condizioni sperimentali articialmente noi possiamo ridurre l'ampiezza del potenziale postsinaptico eccitatorio e del potenziale di placca attraverso delle sostanze antagoniste rispetto all'ach, cio sostanze che si legano alla subunit , non hanno conformazione sucientemente precisa da indurre un cambiamento conformazionale del canale che quindi non si apre ma d'altra parte la sostanza antagonista 105

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Le sinapsi

Figura 6.16: Canali e rapsina

impedisce all'ach cio al ligando endogeno di legarsi al canale e quindi meccanicamente queste sostanze hanno la funzione di bloccare la trasmissione neuromuscolare. Una sostanza particolarmente anche storicamente ecace per questo eetto il curaro o la curarina, principio attivo del veleno che veniva utilizzato nella caccia per bloccare gli animali predati che morivano per asssia quando la tossina entrava in circolo e bloccava i muscoli respiratori. Il curaro in realt, o meglio derivati pi moderni del curaro con lo stesso principio vengono utilizzati anche nella pratica clinica soprattutto chirurgica, ogni qual volta c' da fare un'operazione soprattutto a livello addominale si induce articialmente una paralisi della muscolatura addominale attraverso sostanze curaro-simili. Somministrando una quantit adeguata di curaro o curarina si pu ottenere una riduzione, non il blocco totale della trasmissione ma una riduzione dell'ampiezza del potenziale di placca e portarlo al di sotto del valore di soglia. In questo caso l'ach viene rilasciata, c' un numero limitato di recettori per l'ach disponibili perch sono occupati dal curaro e il potenziale di placca risulta di ampiezza pi piccola. Se noi facciamo un esperimento del genere e andiamo a misurare lungo la bra muscolare l'ampiezza del potenziale di placca indotto dall'attivazione dell'assone motore vediamo che ef-

Figura 6.17: L'azione del curaro

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6.3. I 5 stadi fettivamente questo potenziale graduato si propaga con decremento man mano che ci allontaniamo dalla posizione della placca motrice. Cio questo un potenziale di placca che si propaga attraverso queste correnti elettrotoniche mediante le propriet elettriche passive della membrana. Si ha quindi un fenomeno graduato del potenziale sinaptico e soltanto quando questo raggiunge il valore di soglia siologicamente si induce un potenziale d'azione che invece sar prodotto da dei canali voltaggio dipendenti descritti precedentemente. rente sinaptica sar molto grande. Con il sistema di blocco del voltaggio patch clamp possiamo imporre alla membrana un potenziale di membrana a piacere variabile, somministrare per esempio ach e vedere la corrente di membrana come cambia, nel caso specico del sodio sappiamo che il suo potenziale di equilibrio intorno ai +50-55 mV, il potenziale di membrana a riposo -90 mV perch stiamo parlando del potenziale della bra muscolare striata che come potenziale di membrana molto negativo, in questo caso il potenziale di equilibrio del potassio intorno ai -100 mV. Quando il potenziale di membrana -90 mV avremo una corrente in ingresso del sodio, la corrente sinaptica indotta dall'attivazione della sinapsi. Se portiamo la membrana a valori sempre meno negativi come -50, -20 e 0 +20 mV vediamo che la corrente che viene indotta dal rilascio dell'ach diventer sempre pi piccola perch ci avviciniamo al potenziale di equilibrio del sodio. Quando raggiungiamo il potenziale di equilibrio del sodio portando il potenziale di membrana a +55 mV possiamo anche rilasciare tutta l'acetilcolina che vogliamo, i canali si aprono per cambio di conformazione ma il sodio non pu entrare perch in equilibrio. Se portiamo la membrana a valori ancora pi positivi vedremo che l'apertura dei canali produrr una corrente invertita, una corrente che invece che entrare nella cellula uscir dalla cellula perch il gradiente di equilibrio del sodio tale per cui se la polarit aumenta il sodio uscir in questo caso perch il gradiente elettrico prevale su quello chimico. Questo potenziale al quale si ha una inversione della corrente sinaptica viene chiamato potenziale di inversione di questa sinapsi, superando questo valore di voltaggio la corrente si inverte. Se assumessimo che questa sinapsi fosse permeabile in modo selettivo soltanto allo ione sodio il potenziale di inversione di questa sinapsi sarebbe esattamente uguale al potenziale di equilibrio di Nernst del sodio in linea teorica. Facciamo questo esperimento nella bra muscolare e vediamo qual il potenziale di inversione dei recettori nicotinici in una placca muscolare. Vediamo che il potenziale di inversione della corrente sinaptica intorno agli 0 mV. Questo vuol dire che se mettiamo ach ci sar una corrente di ioni (che dovremo capire quali sono) che tender a portare il potenziale di membrana verso gli 0 mV, quindi un'azione depolarizzante sino a 0 mV. Se superiamo gli 0 mV la corrente si invertir e invece che essere una corrente depolarizzante sar una corrente iperpolarizzante. La corrente in ingresso di ioni positivi e in uscita si equivalgono perfettamente, la corrente netta uguale a 0 e non si ha variazione del potenziale di membrana. Non esiste nessuno ione il cui potenziale di equilibrio di Nernst sia uguale a 0 mV, sappiamo che il K a -100, il cloro a -70,80 mV, il sodio a +55-60 mV. Il fatto che sia 0 107

Neurotrasmettitori e potenziali
Utilizziamo a questo punto questa sinapsi e questo canale per un discorso pi generale di studio di una sinapsi, cio ci dobbiamo chiedere che tipo di canali sono implicati e che tipo di conduttanza ionica viene modicata dal rilascio del neurotrasmettitore, in questo caso ach. Abbiamo detto pi volte che il fatto che noi apriamo un canale non signica che ci sia una corrente ionica, la corrente ionica dipender dalla presenza di una forza elettromotrice netta che spinge gli ioni attraverso la membrana. Se lo ione per esempio in equilibrio non ci sar nessuna corrente ionica, occorre che ci sia una forza elettromotrice, una forza netta, un gradiente elettrochimico favorevole che pu spingere lo ione verso l'interno o verso l'esterno poich il canale bidirezionale, quando si apre pu far passare ioni in una direzione o nell'altra a seconda del gradiente elettrochimico presente. Per ciascuna sinapsi possiamo applicare un'equazione applicata pi volte, la corrente EPSP (potenziale postsinaptico eccitatorio) avr un potenziale di equilibrio suo proprio, ci sar un potenziale al quale l'apertura di quella conduttanza ionica non produrr nessun passaggio di ioni perch questi ioni non hanno un gradiente elettrochimico che ne permette il passaggio. La corrente quindi che verr generata dipender dalla variazione di conduttanza della membrana in questo caso generata dall'ach ma moltiplicata per una forza netta, un gradiente elettrico netto dato dalla dierenza tra il potenziale di membrana che veniamo ad avere meno un potenziale al quale la forza elettrochimica netta uguale a 0 per gli ioni per i quali la membrana permeabile. Facciamo un esempio. Supponiamo che in un istante questo canale nicotinico che stiamo studiando sia permeabile esclusivamente allo ione sodio, questi sono potenziali postsinaptici eccitatori e se aumentiamo la permeabilit al sodio questo entra nella cellula e produrr depolarizzazione originando un potenziale postsinaptico eccitatorio. L'entit di questa corrente di sodio in ingresso dipender dal valore di Vm, se Vm molto vicino al potenziale di equilibrio del sodio questa corrente sar molto piccola, se invece Vm molto lontano dal potenziale di equilibrio la cor-

6.

Le sinapsi

Figura 6.18: Potenziale di inversione

peculiare, potrebbe assumere altri valori positivi o negativi, in realt si dimostra che questo canale non selettivo a nessuno ione in particolare ma permeabile in misura pi o meno uguale anche se non identica sia al sodio che al potassio. Quando questo canale si apre tende a far entrare il sodio e a far uscire il potassio. chiaro che al potenziale di membrana di riposo di -90 mV l'uscita di potassio sar molto inferiore all'entrata di sodio perch il potenziale di membrana molto vicino al potenziale di equilibrio del potassio e molto lontano da quello del sodio (minore) quindi la corrente di sodio prevarr nettamente, ecco perch abbiamo una corrente netta entrante. Questo canale non selettivo a nessuno ione particolare ma ha una conduttanza abbastanza ampia pi o meno uguale sia per il sodio che per il potassio, anche al calcio, ci che non passa sono gli anioni come il cloro. Per capire lo ione coinvolto applicheremo il concetto di potenziale di inversione a ogni canale delle sinapsi che studieremo. Se facciamo un patch clamp sul singolo canale vediamo che il singolo canale ha lo stesso potenziale di inversione. A 0 mV possiamo aprire il canale mettendo ach ma le correnti ioniche attraverso questo canale sono uguali a 0. Quando viene rilasciata ach che viene legata nello 108 spazio sinaptico questa si lega a questi canali nicotinici e recettori sulla cresta delle regioni giunzionali, queste indurranno un usso di sodio e potassio che produrranno un potenziale di placca, un potenziale graduato che si propaga alla porzione di membrana adiacente con meccanismi elettrotonici passivi. Sia in fondo alle pliche giunzionali sia soprattutto ai lati del bottone sinaptico sono presenti anche i canali voltaggio dipendenti del sodio e la depolarizzazione indotta dai canali dipendenti produrr un innesco del processo autorigenerativo di Hodgkin che vede coinvolti i canali voltaggio dipendenti del sodio che produrranno un potenziale d'azione. Il potenziale di placca si propaga con un decremento secondo una certa distanza e il potenziale d'azione invece una volta generato si propaga per tutta la lunghezza della bra muscolare che pu essere molto lunga no a qualche decina di cm, senza dierenza facendo contrarre la bra muscolare. Detto questo a proposito della giunzione neuromuscolare allarghiamo lo sguardo sui recettori ionotropici in generale del SNC e SNP. Non dobbiamo pensare che la situazione sia semplice, la situazione in realt molto complessa, dobbiamo cercare di capire le caratteristiche generali di questa complessit. Non dobbiamo pensare che l'ach si leghi a dei canali ionici per l'ach che sono sempre quelli, ci sono

6.3. I 5 stadi

Figura 6.19: Applicazione del patch clamp

recettori ionotropici diversi dell'ach. Altri neurotrasmettitori come l'ach o altri possono legarsi sia ai canali ionotropici sia ai canali metabotropici, cio legati a proteine G. Nella stessa sinapsi sono presenti pi recettori ionotropici per neurotrasmettitori e magari una combinazione di recettori ionotropici e metabotropici per lo stesso neurotrasmettitore. Per esempio quando parliamo di recettori nicotinici dell'ach la sostanza agonista di questi canali per l'ach la nicotina, la nicotina in grado di legarsi sul sito recettoriale dell'ach e promuove l'apertura del canale, non un antagonista che si lega e impedisce l'apertura ma consente invece l'apertura, si lega al canale e il canale si apre. La nicotina una delle sostanze che si visto essere una sostanza agonista dell'ach. Nel SNC ci sono numerosi canali nicotinici ionotropici che legano ach, anche nel SNP i pi importanti sono per esempio a livello dei gangli parasimpatici paravertebrali, a questo livello si ha una trasmissione dell'impulso tra un neurone simpatico pregangliare e uno simpatico postgangliare mediato principalmente da recettori nicotinici dell'ach che a quel livello rilasciano ach. La struttura di questi canali analoga per tutti i canali nicotinici perch in tutti questi canali i recettori nicotinici hanno funzione agonista, per la loro struttura diversa e anche le loro propriet sono molto diverse. Ci sono moltissimi sottotipi di subunit e , 9 e 4 e la combinazione di queste subunit cambia da canale a canale e quindi anche le propriet del canale cambiano. Sono tutti canali che legano ach con antagonista nicotina ma per esempio a livello dei neuroni centrali abbiamo canali con due subunit e tre tutte uguali diverse da quelle del muscolo oppure ci sono altri canali fatti da cinque subunit tutte di tipo , le subunit che formano il canale sono sempre cinque ma si combinano in modo diverso. In tutti questi canali il recettore per l'ach sempre nella subunit con due siti recettoriali, le caratteristiche di permeabilit di questi canali cambiano e le propriet cambiano. Per il muscolo per esempio la permeabilit del calcio rispetto a quella del sodio molto bassa, cio in questo canale passano molto 109

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Le sinapsi

Figura 6.21: Canali nicotinici

sodio e potassio e molto meno calcio, invece se noi andiamo a vedere altri canali centrali dei neuroni a livello centrale in cui abbiamo la combinazione di diverse subunit e vediamo che in questo tipo di canale abbiamo una conduttanza pi o meno simile del calcio e del sodio e in un canale con tutte subunit abbiamo un'elevatissima permeabilit al calcio che 20 volte superiore a quella del sodio, la corrente quindi in questo canale principalmente per il calcio. Anche le sostanze agoniste o antagoniste possono cambiare, per esempio l'-bungarotossina vista precedentemente che si legava ai siti recettoriali delle placche motrici si lega al recettore nicotinico del muscolo ma non si lega ad altri recettori neuronali per i quali esiste un'altra neurotossina che funge da antagonista. Cos pure il curaro agisce sulla componente muscolare ma non agisce sui recettori centrali. Vi sono altre propriet che adesso non descriviamo nel loro meccanismo, questi canali hanno un comportamento complesso, possono mostrare in un modo pi o meno marcato una desensitivizzazione, cio alcuni di questi canali per l'ach se vengono stimolati in continuazione dall'ach o da altre sostanze 110 agoniste piano piano si aprono sempre meno facilmente, cio sono sempre meno sensibili, la probabilit di apertura si riduce. Questo processo si chiama desensitivizzazione e a seconda del tipo di canale abbiamo una desensitizzazione pi lenta o rapida, questa molto rapida nei canali del calcio presenti a livello centrale. A livello per esempio dei gangli spinali abbiamo recettori nicotinici per l'ach che hanno una composizione diversa rispetto a quelli muscolari, hanno una struttura simile a quella dei recettori centrali anche se hanno subunit diverse, hanno comunque due subunit , una , e . Questi canali per esempio non sono sensibili al curaro e questo importante dal punto di vista clinico, iniettando una sostanza curaro simile a questo livello avremo una inibizione muscolare ma questa non avr eetto a livello dei gangli paravertebrali simpatici. Per questi gangli l'esametonio una sostanza in grado di antagonizzare i recettori a livello gangliare. Quando parliamo di recettori nicotinici dobbiamo tenere presente che parliamo di un ampio ventaglio di recettori con caratteristiche diverse e lo studio e l'intervento farmacologico che possiamo avere su questi recettori selettivi grazie a queste diverse propriet

6.3. I 5 stadi formazione diversa. La tropina ha l'azione di bloccare il sistema parasimpatico a livello postgangliare che utilizza ach e agisce su recettori muscarinici, la tropina blocca quindi la contrazione del muscolo costrittore della pupilla e si ha una dilatazione della pupilla ma questa sostanza non avr eetto per esempio sulla muscolatura motoria dell'occhio, perch i recettori nicotinici presenti sui muscoli extraoculari sono nicotinici e saranno bloccati invece dal curaro. Abbiamo un'ampia possibilit quindi di intervento farmacologico sui diversi tipi di recettori sapendo quali sono i tipi di recettori interessati dal sistema sul quale vogliamo agire. L'ach come la maggior parte dei neurotrasmettitori, come tutti i neurotrasmettitori classici a basso pm viene sintetizzata direttamente a livello del bottone sinaptico, pi precisamente nel citoplasma del bottone sinaptico. Si cerca di capire come avviene la sintesi cercando di capire quali sono gli enzimi e i coenzimi necessari alla sua sintesi. Nel caso dell'ach necessaria la colinacetiltransferasi abbreviata con CAT perch l'ach origina dal trasferimento di un gruppo acetato dall'acetil-CoA alla colina a formare appunto acetilcolina. Questo avviene a livello citoplasmatico, poi ci saranno dei trasportatori specici che concentrano l'ach nella vescicola, una volta che l'ach viene rilasciata nello spazio sinaptico la sua azione viene bloccata in modi diversi. L'ach un esempio particolare e il blocco dell'azione avviene primariamente per azione metabolica, un'inibizione idrolitica dell'acetilcolina che viene trasformata in colina e acido acetico che blocca l'azione dell'ach. A livello dello spazio sinaptico nelle pliche giunzionali esiste un altro enzima estremamente importante, l'acetilcolinesterasi che ha appunto questa azione idrolitica. Questo il meccanismo principale, in tutte le altre sinapsi un'inibizione del neurotrasmettitore pu avvenire per diusione, il neurotrasmettitore dionde nello spazio sinaptico e la sua concentrazione diminuisce. L'acetilcolesterasi estremamente importante anche dal punto di vista farmacologico perch ci sono vari farmaci che possono bloccare o inibire l'azione dell'acetilcolesterasi, cos facendo provocano un aumento della durata dell'azione postsinaptica colinergica. Se inibiamo l'acetilcolesterasi l'acetilcolina rimarr nello spazio sinaptico per un periodo pi lungo e quindi si aumenta la possibilit di azione di questa e di conseguenza della trasmissione sinaptica. Questo un meccanismo che viene sfruttato nella miastenia gravis, in cui la trasmissione sinaptica ridotta perch il numero di recettori colinergici presenti ridotto perch ci sono corpi che bloccano questi recettori, in questo caso l'azione dell'acetilcolina pu essere potenziata aumentando il tempo di azione dell'acetilcolina stessa, i farmaci acetilcolesterasici sono importanti per ridurre la sintomatologia della miastenia gravis soprattutto nelle fasi 111

Figura 6.20: Potenziale di placca e potenziale

d'azione

e le diverse conformazioni dei recettori, si blocca o si facilita la trasmissione a seconda delle sostanze. Inoltre dobbiamo tenere presente che lo stesso neurotrasmettitore come l'ach pu agire anche su canali di tipo metabotropico, cio recettori legati a proteine G. Nel SNP abbiamo la presenza di un altro tipo di recettore colinergico che lega ach che prende il nome di recettore muscarinico, diverso da quello nicotinico considerato no adesso attivato dalla nicotina e bloccato dal curaro. I recettori metabotropici per l'ach muscarinici hanno la propriet di non essere canali, inoltre come sostanza agonista hanno la muscarina, una tossina presente nell'amanita muscaria, un fungo velenoso, la sostanza antagonista principale che in grado di bloccare il recettore muscarinico umano per esempio la tropina (blocca anche i recettori di tipo nicotinico). Questi sono concetti importanti, sono tutti recettori colinergici che riconoscono ach ma che hanno una con-

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Le sinapsi

Figura 6.22: Agonisti e antagonisti

Figura 6.23: Recupero dell'acetilcolina

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6.3. I 5 stadi iniziali e intermedie della malattia. L'acetilcolina e l'acido acetico sono importanti, normalmente il bottone sinaptico cerca di recuperare il pi possibile il neurotrasmettitore rilasciato, in molti casi recupera l'intero neurotrasmettitore attraverso un meccanismo di reuptake mediato da trasportatori specici, nel caso dell'ach soltanto la colina che viene recuperata e l'acido acetico viene disperso per diusione, va in circolo e verr poi degradato. La colina viene recuperata in grande percentuale da trasportatori specici che la riportano nel bottone sinaptico dove avviene la sintesi di nuova ach attraverso la CAT e l'utilizzo di acetil-CoA. Questo quindi il ciclo di sintesi e degradazione dell'ach. su alcuni sistemi cellulari e un'azione inibitoria su altri. Torniamo per esempio all'ach, l'ach se parliamo del sistema parasimpatico postgangliare su alcuni organi bersaglio ha un'azione eccitatoria e su altri inibitoria, sul cuore per esempio inibitoria riducendo la frequenza cardiaca iperpolarizzando le cellule, su altri sistemi come ad esempio il sistema digerente ha un'azione eccitatoria, l'ach aumenta i movimenti peristaltici, la secrezione del sistema digerente e altro. In alcuni casi abbiamo recettori muscarinici ma in altri casi l'azione pu essere sia di un tipo che di un altro, e questo vale anche per tutti gli altri neurotrasmettitori. vero anche che se andiamo a vedere l'azione delle sinapsi eccitatorie vediamo che ce n' un gran numero che utilizzano il glutammato, il glutammato normalmente si dice che un neurotrasmettitore di tipo eccitatorio, in alcuni sistemi ha per un'azione inibitoria ed vero che molto diuso come neurotrasmettitore nelle sinapsi eccitatorie e quindi normalmente viene catalogato cos, va per ricordato che l'azione del neurotrasmettitore dipende dal recettore. Stessa cosa per quanto riguarda GABA e glicina, questi vengono nominati spesso come neurotrasmettitori di tipo inibitorio, eettivamente in moltissime sinapsi inibitorie sono i neurotrasmettitori utilizzati, in certi casi per il GABA e la glicina sono eccitatori. La struttura generale dei recettori ionotropici quella che abbiamo gi analizzato precedentemente, i canali colinergici e nicotinici hanno una struttura simile a quella dei canali dove interviene il GABA o la glicina, in generale la famiglia dei recettori ionotropici simile per questi meccanismi d'azione.

Neurotrasmettitori
Vediamo i principali neurotrasmettitori, ce ne sono molti, i principali sono l'ach, anche l'ATP stesso viene rilasciato o corilasciato in molte sinapsi e agisce da neurotrasmettitore, si parla di trasmissione di tipo adenosinergico. L'ATP viene rilasciato come tale e in molte altre situazioni viene anche degradato in adenosina togliendo i gruppi fosforici e l'adenosina da sola pure pu svolgere in molti casi l'azione di neurotrasmettitore. Altri neurotrasmettitori importanti soprattutto per la trasmissione in recettori ionotropici sono aminoacidi o aminoacidi modicati come l'acido -aminobutirrico, la glicina o il glutammato stesso, questi sono aminoacidi che hanno un'azione che pu essere come vedremo sia sui recettori metabotropici sia sui recettori ionotropici ma soprattutto sono i recettori pi frequenti che determinano una trasmissione sinaptica rapida attraverso recettori di tipo ionotropico. Abbiamo poi un gruppo molto grosso delle amine biogene che sono amine come l'adrenalina, la serotonina e la noradrenalina (soprattutto periferica, a livello centrale la sua azione molto scarsa) e in alcuni casi anche l'istamina. Alcuni di questi neurotrasmettitori hanno un'azione anche limitata (tranne la serotonina) sui recettori ionotropici ma per la maggior parte dei casi l'azione principalmente svolta sui recettori metabotropici, cio sono recettori che producono reazioni pi lente e pi a lunga durata. Prenderemo in esame questi recettori quindi soprattutto in quel contesto. Cerchiamo di capire meglio il funzionamento di questi neurotrasmettitori ad azione rapida sui loro recettori, abbiamo analizzato precedentemente l'ach e vediamo adesso il glutammato e il GABA. Il concetto importante che deve essere capito che nonostante si tenti di catalogare i neurotrasmettitori in eccitatori o inibitori questo da un punto di vista nozionistico errato, perch l'azione eccitatoria o inibitoria di un neurotrasmettitore dipende esclusivamente dal recettore, anzi la maggior parte dei neurotrasmettitori hanno un'azione eccitatoria

Glutammato Fa eccezione eettivamente il glu-

tammato e questa un'eccezione importante, il glutammato ha dei canali con una struttura leggermente diversa, il glutammato molto diuso specie a livello cerebrale e non solo, anche a livello spinale, la sua struttura per il recettore una struttura a quattro e non cinque subunit, ciascuna subunit ha si quattro domini transmembranari ma M2 sempre un dominio transmembranario incompleto, M2 anche in questo recettore in questo canale molto importante per determinare la selettivit ionica del canale. La sintesi del glutammato particolare e la sua azione viene determinata a livello sinaptico con un meccanismo ben preciso. Viene sintetizzato a livello del bottone sinaptico e il processo parte dalla glutammina, la glutammina dopo aver subito azione della glutaminasi viene deaminata e ci che rimane il glutammato che successivamente viene liberato tramite trasportatori specici a livello dei siti. Una volta che viene rilasciato il glutammato come la maggior parte dei neurotrasmettitori viene inibito non tramite un'azione di idrolisi o di inattivazione di tipo metabolico ma il glutammato viene ricaptato con un meccanismo di reuptake e questo 113

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Le sinapsi

Figura 6.24: Canali ionotropici

reuptake avviene sia ad opera del bottone sinaptico ma molto importante anche l'azione delle cellule gliali. Le cellule gliali hanno dei trasportatori specici per il glutammato per cui questo glutammato viene rimosso dallo spazio sinaptico anche grazie all'azione delle cellule gliali, le quali attraverso meccanismi abbastanza complessi riportano questo glutammato verso il bottone sinaptico attraverso modi diversi. Innanzitutto all'interno della cellula gliale attraverso la glutammato sintetasi il glutammato viene trasformato nuovamente in glutammina e poi ci sono dei meccanismi di trasporto che portano la glutammina di nuovo all'interno del bottone sinaptico dove questa attraverso la glutaminasi viene di nuovo trasformata in glutammato e il ciclo continua. Vediamo che per questo neurotrasmettitore ma anche per altri la glia svolge un ruolo fondamentale nel bloccare l'azione sinaptica, il glutammato recuperato viene comunque riportato verso il bottone sinaptico attraverso meccanismi di trasporto specici. canali ionotropici per il glutammato sono AMPA, acido cainico e NMDA (N-metildiaspartato). Abbiamo quindi questi tre tipi di recettore e questi recettori possono esistere, anzi in molti casi coesistono all'interno della cellula, per esempio a livello dell'ippocampo oppure anche all'interno delle spine dendritiche dei neuroni corticali, addirittura questi recettori ionotropici possono in molti casi esistere con recettori metabotropici e quindi si pu avere l'azione sia tramite canali ionotropici che tramite azione di proteine G. Nella maggior parte dei casi come gi detto questa azione un'azione eccitatoria. Dobbiamo distinguere la struttura e la funzione di questi canali AMPA e acido cainico da quelli NMDA, tant' vero che spesso si parla di recettori non NMDA per indicare gli altri due e per dierenziarli da quelli NMDA, questo perch come vedremo i recettori NMDA hanno un ruolo molto peculiare e soprattutto sono coinvolti pesantemente in molti meccanismi di plasticit sinaptica, mentre per gli altri due recettori AMPA e cainato la trasmissione pi diretta e veloce e si ha una produzione pi Anche per il glutammato importante distingue- rapida del potenziale postsinaptico eccitatorio. re i recettori, per tutti viene sempre rilasciato il glutammato, il ligando endogeno il glutammato Anche per tutti questi recettori il potenziale di ma i recettori vengono identicati attraverso altre inversione di questa sinapsi ancora di 0 mV, se sostanze agoniste speciche per il diverso tipo di noi studiamo il potenziale d'azione di questi canali recettore, sostanze esogene. Le tre sostanze fon- sia AMPA che cainato che NMDA il potenziale damentali che caratterizzano i tre tipi principali di ancora 0 mV e si scopre che ancora una volta sono 114

6.3. I 5 stadi

Figura 6.25: Reuptake del glutammato

canali cationici poco selettivi. Mentre quelli per il cainato e AMPA permettono il passaggio fondamentalmente solo di sodio e potassio come i nicotinici per le bre muscolari per gli NMDA aggiungiamo l'importante permeabilit per il calcio. Ogni nucleo, ogni gruppo di neuroni deve essere studiato in modo specico perch le sue propriet di membrana e le sue propriet sinaptiche dieriscono da caso a caso. Per esempio in molti casi i recettori per il cainato oltre a essere recettori ionotropici cio proteine canale con recettore esterno per il glutammato facendo passare sodio potassio e calcio quando vengono attivati in modo ripetuto si verica che attivano anche delle proteine G, vediamo quindi che la risposta sinaptica non ssa e immutabile, se attivata in modo canonico produce una corrente diversa depolarizzante con un potenziale postsinaptico di breve latenza che produce una trasmissione regolare dell'informazione. Se una sinapsi viene attivata in modo continuativo vengono attivati dei sistemi di secondi messaggeri cellulari che a loro volta attraverso delle protein chiansi hanno azioni di modicare altre conduttanze e quindi vediamo una modicazione a lungo termine della responsivit e della capacit di risposta del neurone postsinaptico che prima era costante ma che si modica in base all'esperienza pregressa precedente. Questo ci mostra quanto sia elevata la complessit a livello sinaptico.

Non NMDA Per quanto riguarda la selettivit del canale, stiamo parlando dei canali non NMDA e abbiamo detto che questa determinata dal dominio M2 transmembranario che non attraversa completamente lo spessore della membrana e ha una forcina che mostrata all'interno del poro determina la sua selettivit. Si visto che basta cambiare un solo AA all'interno di questa forcina di questo dominio transmembranario parziale cambiando un arginina con una glutammina e la selettivit del canale per lo ione calcio viene a scomparire. Questo avviene anche siologicamente, nel neonato nelle fasi iniziali dello sviluppo questi canali sono principalmente di tipo non revisionato, in questo caso vediamo che quando somministriamo glutammato la corrente che passa attraverso questo canale costituita sia dallo ione calcio che dallo ione sodio. Poi durante lo sviluppo aumenta sempre di pi la presenza dell'altro tipo di canale attraverso uno splicing post-trascrizionale, modicazioni delle proteine che avvengono dopo la trascrizione, vediamo che viene sostituito questo aminoacido e questo canale diventa permeabile soltanto al sodio e non al calcio. Questo ha delle implicazioni importanti perch il calcio spesso ha un'azione tossica a livello cellulare, per esempio se certi neuroni con sinapsi glutamatergiche che vengono attivate in modo eccessivo ad esempio a seguito di un episodio ischemico del SNC o a seguito di una crisi epilettica, l'attivazione ri115

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Le sinapsi

Figura 6.26: Vari recettori del glutammato

petuta di questi canali pu portare a un aumento del calcio postsinaptico nella cellula postsinaptica e questo porta a una tossicit neuronale con morte neuronale, si parla di tossicit da glutammato. Infatti si visto fra i vari meccanismi che a seguito di ischemia o di varie malattie neurodegenerative la presenza di questi canali revisionati per sostituzione di questo aminoacido tende a diminuire e aumenta il numero di canali non revisionati che fanno passare il calcio. L'attivazione di queste sinapsi induce un aumento del calcio a livello della cellula postsinaptica che pu raggiungere livelli tossici. Queste due combinazioni, questi due tipi di canale AMPA e cainato possono portare a condizioni patologiche o essere presenti siologicamente. quello considerato no adesso per i canali voltaggio dipendenti per il sodio e per il potassio descritti per il potenziale d'azione, un meccanismo che vede coinvolto lo ione magnesio, un catione bivalente. All'interno del canale esiste un sito di legame per il magnesio e in condizioni siologiche il magnesio entra nel canale e lo blocca, possiamo quindi somministrare grandi quantit di glutammato o un suo agonista, il canale cambier conformazione ma c' un tappo prodotto dal magnesio che impedisce il passaggio degli ioni, il canale bloccato dallo ione magnesio e per rimuovere questo blocco bisogna depolarizzare la membrana. Depolarizziamo la membrana e l'esterno diventa pi negativo, diminuisce la positivit rispetto all'interno, il magnesio uno ione positivo e quindi viene dislocato e spostato verso l'esterno, il magnesio esce, sblocca il canale e a questo punto il glutammato pu aprire il canale e produrre una corrente in ingresso di sodio, in uscita di potassio e questa volta questo canale importante perch ha un'elevata permeabilit anche per il calcio. Oltre a produrre un usso di sodio e potassio quindi il canale quando si apre permette l'entrata di calcio nella cellula, il calcio come abbiamo detto nella cel-

NMDA Torniamo a considerare il canale NMDA, questo particolarmente importante, innanzitutto perch ha una peculiarit, un canale che oltre a essere regolato chimicamente dal glutammato presenta anche una forma di voltaggio dipendenza. Non suciente rilasciare glutammato nello spazio sinaptico per fare aprire questo canale NMDA ma occorre anche depolarizzare la membrana oltre a un certo livello. Il meccanismo molto diverso da
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6.3. I 5 stadi

Figura 6.28: Selettivit dei canali

Figura 6.29: Voltaggio dipendenza

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Le sinapsi

Figura 6.30: Meccanismo del calcio

lula normalmente come calcio citoplasmatico libero ha una concentrazione bassissima (107 M), variazioni anche piccole della concentrazione del calcio sono capaci di indurre modicazioni importanti all'interno della cellula, in questo caso questo calcio che entra in grado di produrre delle modicazioni plastiche a lungo termine. Normalmente i due tipi di canale, NMDA e non NMDA coesistono nella stessa membrana postsinaptica. Quando la membrana postsinaptica ha una polarizzazione normale e viene liberato glutammato si apriranno soltanto i canali con recettori AMPA, quelli che non hanno il blocco del magnesio e produrranno un potenziale postsinaptico eccitatorio. Per produrre un'apertura anche dei recettori NMDA bisogna che questa membrana sia parzialmente depolarizzata, se la membrana depolarizzata la stessa quantit di glutammato produrr un'apertura non soltanto dei canali collegati a recettori AMPA ma anche di quelli non NMDA e quindi un'entrata di calcio nella cellula. Si visto che il calcio entrando nella cellula attiva delle protein chinasi che attivano una serie di meccanismi che tendono a potenziare questa trasmissione sinaptica, questo uno dei meccanismi principali di 118 plasticit sinaptica del nostro cervello. In generale le sinapsi che vengono attivate di pi tendono a potenziarsi mentre le sinapsi che vengono attivate di meno tendono a produrre una minore plasticit sinaptica. Questo avviene sia durante lo sviluppo sia nell'adulto, durante lo sviluppo uno dei meccanismi estremamente importanti della maturazione del cervello. Durante lo sviluppo quando vengono a instaurarsi connessioni tra bre nervose e cellule bersaglio queste connessioni sono molto superiori in numero a quelle presenti nell'adulto, si viene a formare un numero elevatissimo di connessioni e poi la maggior parte di queste vengono eliminate e rimangono quelle importanti e funzionali, importanti per il corretto svolgimento delle funzioni da parte del cervello. Uno dei meccanismi principali questo, le sinapsi che vengono attivate spesso aumentano la loro forza sinaptica e si potenziano, quelle che non vengono attivate scompaiono, anche nell'adulto avviene la stessa cosa, se certe vie sinaptiche vengono attivate in modo ripetuto la forza delle sinapsi aumenta, non solo ma c' anche un processo di sprout a lungo andare, di gemmazione delle singole bre nervose e il territorio di innervazione di un certo sistema di assoni si espande mentre se una via non

6.3. I 5 stadi

Figura 6.31: Plasticit sinaptica

viene utilizzata viene persa. Se andiamo a vedere una rappresentzione corticale sia a livello motorio che sensoriale per esempio dell'utilizzo della mano sinistra e andiamo a vedere la rappresentazione di questa in particolare in un suonatore professionista di violino vediamo che la presentazione corticale dell'utilizzo della mano sinistra molto pi espansa rispetto a quella presente in una persona normale. Questi recettori NMDA sono importanti in questi processi di pi rispetto agli altri perch se una via viene attivata molto indurr un livello medio di depolarizzazione maggiore e questo far si che l'attivazione di quella sinapsi attiver anche il recettore NMDA, cosa che non avviene se una via viene attivata poco, questa produce un'entrata di calcio nella cellula e il calcio produrr tutti questi eetti plastici descritti nora. Questi processi adattativi sono estremamente complessi. Con un'attivazione ripetuta i recettori AMPA vengono inglobati nelle spine dendritiche e questo meccanismo di potenziamento dovuto a tanti meccanismi: da una parte per fosforilazione dei canali stessi e in parte perch vengono esposti un numero maggiore di recettori, aumenta il numero di canali e a lungo andare l'effetto anche presinaptico in cui vediamo che si ha uno sprouting dei bottoni sinaptici e un aumento quindi del numero di sinapsi. Il meccanismo particolare un meccanismo al quale accenniamo e lo riprenderemo in dettaglio pi avanti. Il meccanismo prevede la presenza di neurotrasmettitori gassosi con un comportamento molto particolare che possono essere prodotti dalla spina dendritica a livello postsinaptico ma che essendo molecole piccole estremamente diusibili e 119

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Le sinapsi

la sinapsi venga potenziata e aumenti il numero di connessioni, il processo reversibile, una volta diminuita la frequenza di attivazione la sinapsi torna allo stato normale. Abbiamo visto che siamo di fronte a una notevole complessit delle sinapsi in cui un determinato neurotrasmettitore pu legarsi a una variet abbastanza ampia di recettori, ciascun recettore con le sue caratteristiche proprie e spesso una sinapsi presenta pi recettori di diverso tipo che legano lo stesso neurotrasmettitore, in particolare si ha come esempio la coesistenza di recettori NMDA e recettori non NMDA per esempio AMPA o cainato e abbiamo visto come la combinazione di questi due recettori importante nel determinare meccanismi di plasticit e cambiamenti a livello sinaptico.

Sinapsi inibitorie
Prendiamo adesso in esame come ultimo esempio importante di recettori ionotropici i meccanismi presenti in sinapsi di tipo inibitorio, tutte le sinapsi no adesso considerate erano sinapsi di tipo eccitatorio, cio l'attivazione della sinapsi induceva una depolarizzazione della membrana postsinaptica con un potenziale postsinaptico eccitatorio. Invece come risultato in caso di inibizione si ha una iperpolarizzazione della membrana cio il potenziale postsinaptico inibitorio. Si utilizza spesso il termine di neurotrasmettitore inibitorio per indicare per esempio il GABA o la glicina, ricordiamo che sebbene questi neurotrasmettitori vengano utilizzati ampiamente in molte sinapsi di tipo inibitorio l'inibizione o l'eccitazione dipendono dal recettore e non dal neurotrasmettitore. Esistono sinapsi GABAergiche che producono una depolarizzazione invece che una iperpolarizzazione, cos come ci sono sinapsi glutamatergiche che sono di tipo inibitorio nonostante nella maggior parte dei casi il glutammato sia presente in sinapsi di tipo eccitatorio. I due neurotrasmettitori pi diusamente utilizzati in sinapsi di tipo inibitorio sono il GABA e la glicina, la glicina molto pi presente del GABA (questo per espresso in bassi livelli) per esempio nel midollo spinale, a livello corticale il GABA molto pi frequentemente utilizzato della glicina. Anche in questo caso vogliamo sapere comportamento e meccanismo d'azione di queste sinapsi inibitorie. Le sinapsi GABAergiche sono determinate da recettori di tipo ionotropico GABA A da distinguere da recettori di tipo metabotropico GABA B, i recettori GABA A per glicina o per GABA sono molto simili sia per il comportamento sia per il meccanismo d'azione. Il GABA in realt molto diuso come neurotrasmettitore e questi recettori hanno la peculiarit di avere numerosi siti di legame e numerosi recettori per un gran numero di sostanze spesso di tipo esogeno, vengono sfruttati infatti in maniera massiccia da molte categorie di farmaci.

Figura 6.27: Potenziali di inversione

assolutamente liposolubili diondono rapidamente fuori dal bottone sinaptico. L'attivazione del recettore NDMA per attivazione ripetuta di questa sinapsi produrr un'entrata di calcio che attraverso protein chinasi avr tanti eetti, un eetto sar quello di fosforilare recettori AMPA e aumentarne la probabilit di apertura, un altro eetto sar indurre modicazioni di altre code recettoriali AMPA e non AMPA a livello della membrana postsinaptica e un altro eetto inoltre sar quello di produrre gruppi gassosi come NO che hanno una vita media molto breve ma diondono molto rapidamente raggiungendo anche il neurone presinaptico e a questo livello si inducono una serie di modicazioni. Questo bottone sinaptico attivato in continuazione attraverso questo meccanismo sempre dipendente da recettore NMDA produrr con maggiore facilit le vescicole che verranno esocitate in misura maggiore nello spazio sinaptico e a lungo andare si vericher anche un meccanismo di sprouting e di aumento del numero dei bottoni di questo assone. Il potenziamento lavora quindi sia a livello presinaptico che postsinaptico e tutto quanto coopera a far si che 120

6.3. I 5 stadi

Figura 6.32: Sinapsi inibitoria

Abbiamo un canale del recettore del GABA e ci sono altri siti di legame per esempio per barbiturici, per caeina, steroidi. Tutte queste sostanze in realt hanno l'eetto di potenziare l'eetto del GABA, non sono veri e proprie agonisti del GABA perch come vediamo non si legano al recettore del GABA in s ma si legano ad altri recettori presenti nella proteina canale e cos facendo aumentano la probabilit di apertura del canale e di legame del GABA stesso a questi canali. Infatti caeina e barbiturici hanno un eetto di aumento della vigilanza, sono ad azione ansiolitica e possono dare aumento dell'inibizione a livello della corteccia cerebrale e non solo. Lo ione che passa attraverso questi canali GABAergici si pu studiare attraverso l'analisi del potenziale di inversione, il potenziale di membrana al quale la corrente sinaptica diventa uguale a 0 perch lo ione o gli ioni per i quali la sinapsi permeabile hanno una forza elettromotrice uguale a 0. Per queste sinapsi il potenziale di inversione intorno ai -70 mV, dipende per in linea di massima dalla sinapsi e dalla cellula che andiamo a considerare ma in tutti i casi vediamo che questo potenziale di inversione corrisponde al potenziale di equilibrio per lo ione cloro. Se andiamo a valori pi negativi del potenziale di inversione del cloro vediamo che l'azione sinaptica una depolarizzazione mentre se andiamo a valori pi positivi rispetto al potenziale di equilibrio del cloro l'eetto sinaptico una iperpolarizzazione, in questo caso la risultante inibitoria mentre nel primo caso la situazione eccitatoria. Ovviamente tanto pi ci spostiamo dal potenziale di equilibrio del cloro che in questo caso corrisponde al potenziale di inversione di questa sinapsi tanto maggiore sar la corrente sinaptica e il potenziale che ne consegue. Abbiamo detto che il GABA con questo meccanismo con il cloro come ione coinvolto quello prevalente in molte sinapsi inibitorie, l'inibizione nel SNC adata in un numero enorme di gangli a questo meccanismo del cloro attraverso un aumento della sua permeabilit. L'inibizione postsinaptica indotta da questo meccanismo pu essere molto potente ed possibile indurre attraverso questo meccanismo l'inibizione per tutti i neuroni della generazione del potenziale d'azione, l'inibizione talmente potente da inibire la genesi del potenziale d'azione da parte di tutti i neuroni. Ciononostante abbiamo un meccanismo di cambio di conduttanza che ha un potenziale d'inversione molto vicino al potenziale di membrana, -70 mV il potenziale di membrana tipico di un neurone. Il neurone pu essere parzialmente 121

6.

Le sinapsi

Figura 6.33: Potenziale di inversione

depolarizzato per meccanismi di adattamento sulle sinapsi eccitatorie e il potenziale di membrana del neurone leggeremente pi positivo e quindi l'effetto di inibizione nel senso di iperpolarizzazione della membrana, per gli eetti in termini di depolarizzazione o iperpolarizzazione dovrebbero essere nella maggior parte dei casi molto piccoli perch siamo comunque vicini al potenziale di membrana. Ciononostante questo meccanismo pu essere molto potente come eetto inibitorio. Vediamo in generale cosa succede. Se si ha l'azione di un canale inibitorio per esempio su un motoneurone, una cellula neuronale o una cellula di Purkinje, se si ha quindi l'eetto depolarizzante di un potenziale postsinaptico eccitatorio in questo caso ampio da portare il potenziale di membrana al di sopra della soglia e il potenziale postsinaptico inibitorio isolato prodotto dall'azione di questo interneurone inibitorio GABAergico noi vediamo che quando attiviamo le due sinapsi contemporaneamente, sia quella eccitatoria che inibitoria l'eetto una riduzione del potenziale postsinaptico eccitatorio che in realt nella maggior parte dei casi nettamente pi ampia di una semplice somma algebrica dei due potenziali postsinaptici eccitatori e inibitori. L'eetto inibitorio pi grande quindi dell'entit dell'iperpolarizzazione che la sinapsi inibitoria in grado di indurre. Questa capacit di inibizione che non semplicemente un numero di mV negativi che vengono aggiunti al potenziale di membrana ma l'effetto molto pi potente dipende dalle propriet 122

elettriche passive della membrana. Il meccanismo attraverso il quale viene modicata la frequenza di scarica del neurone particolare, i potenziali d'azione vengono generati nella zona di innesco, nel cono di emergenza dell'assone e quindi occorre che tutte le azioni sinaptiche che avvengono sui dendriti e sul soma della cellula devono essere propagate elettrotonicamente con decremento lungo la membrana dei dendriti e del soma, man mano che ci allontaniamo dalla sinapsi questi eetti sinaptici si riducono di ampiezza e soltanto se si sommano temporalmente e spazialmente a livello della zona di innesco sono in grado di produrre un potenziale di membrana a depolarizzazione che supera la soglia, allora si ha il potenziale d'azione, altrimenti no. Da cosa dipende questa attenuazione lungo i dendriti e il soma? Dipende abbiamo detto fondamentalmente dalla costante di spazio della membrana, man mano che ci allontaniamo dal punto in cui viene generato il potenziale sinaptico le correnti vengono mano a mano cortocircuitate lungo il decorso della membrana e l'entit di questa attenuazione dipende dal rapporto tra la resistenza di membrana e la resistenza interna, dove con resistenza interna si intende la resistenza del dendrite o del soma del neurone sotto radice quadrata. Quanto maggiore la costante di spazio ovviamente tanto minore sar questa attenuazione. Tanto invece pi breve la costante di spazio tanto pi brevemente questi segnali si attenueranno e quindi meno ecaci saranno alla ne di indurre una variazione del potenziale di membrana nel cono di emergenza. Se ci ricordiamo abbiamo detto che le sinapsi inibitorie spesso sono sinapsi di tipo due, sinapsi quindi con vescicole ovali ad ampio spazio sinaptico e queste sono situate pi spesso a livello del soma o comunque vicino al cono di emergenza mentre le sinapsi eccitatorie sono un po' dappertutto ma sono soprattutto concentrate sui dendriti, anche quelli distali. Se abbiamo una sinapsi eccitatoria su un dendrite lontano distale e una sinapsi inibitoria direttamente sul soma o sulla parte prossimale del dendrite si verica un meccanismo particolare. Se viene attivata isolatamente la sinapsi eccitatoria sul dendrite distale questa produrr una corrente sinaptica locale depolarizzante su questo dendrite che uir lungo il dendrite stesso e lungo il soma. In parte verr cortocircuitata lungo il percorso e una percentuale verr persa dalla resistenza di membrana, se la resistenza di membrana elevata molta corrente riesce a uire no al cono di emergenza mentre se la resistenza di membrana bassa la quantit maggiore di questa corrente sinaptica viene persa lungo la strada e qui non riusciamo a raggiungere il cono di emergenza. Se contemporaneamente all'attivazione della sinapsi eccitatoria viene attivata anche una sinapsi inibitoria che pu essere GABAergica con il meccanismo del cloro (ma

6.3. I 5 stadi

Figura 6.34: Sinapsi eccitatoria e inibitoria attivate contemporaneamente

in realt il discorso generale), qualunque tipo di sinapsi inibitoria che situata lungo la strada, per esempio sul dendrite prossimale, l'aumento di conduttanza della membrana a questo livello, che siano canali del sodio o del potassio non ha importanza fa si che la resistenza di membrana lungo il percorso della corrente elettrotonica sinaptica diminuisca. Abbiamo infatti un numero maggiore di canali attraverso i quali la corrente ionica che viene prodotta nella sinapsi eccitatoria pu uscire e quindi non riesce a raggiungere il soma e in particolare quello che il cono di emergenza dell'assone. la stessa cosa di dire che la costante di spazio si riduce e diventa pi piccola perch la resistenza di membrana Rm diventa anch'essa minore, perch abbiamo delle conduttanze ioniche che aumentano e apriamo dei canali. Questo riduce la resistenza di membrana e riduce quindi anche la costante di spazio, questa corrente sinaptica avr meno possibilit di raggiungere e depolarizzare il cono di emergenza dell'assone, viene persa maggiormente lungo la bra, nel caso limite addirittura diventa uguale a 0. Lo stesso concetto rapportato al soma analogo, spesso abbiamo detto che le sinapsi inibitorie pi potenti sono proprio sul soma della cellula, nella corteccia cerebellare le cellule a canestro GABAergiche come un cestino avvolgono completamente il soma delle cellule di Purkinje della corteccia cerebellare, hanno un'azione potentemente inibitoria. Se esistono sinapsi potentemente inibitorie sul soma cellulare tutte le correnti sinaptiche eccitatorie che vengono indotte sull'arborizzazione dendritica della cellula a livello del soma vengono cortocircuitate cio escono in misura maggiore attraverso la membrana in corrispondenza delle sinapsi inibitorie e quindi una quota minore di queste correnti sar in grado di andare a depolarizzare il cono di emergenza. Questa un'azione inibitoria della cellula, la frequenza di scarica di questo neurone sar ridotta, nel caso estremo il neurone cessa di scaricare il potenziale d'azione perch l'azione inibitoria pu essere estremamente potente. Questo meccanismo funziona anche se la membrana ha un potenziale di membrana uguale al potenziale di inversione della sinapsi, queste sinapsi sono sinapsi GABAergiche e a glicina che aprono una conduttanza per il cloro, il potenziale di membrana viene tirato verso il potenziale di equilibrio del cloro. Supponiamo che il potenziale sia esattamente al potenziale di equilibrio del cloro ad esempio nei neuroni in cui il cloro distribuito passivamente. Il potenziale di equilibrio del cloro -70 mV e poniamo che il potenziale di membrana sia -70 mV. In questo caso possiamo aprire tutti i canali del cloro ma non avremo nessuna corrente iperpolarizzante attraverso questi canali, il cloro in equilibrio a quel potenziale, cio123

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Le sinapsi

Figura 6.35: Inibizione sul soma

nonostante noi stiamo aprendo dei canali e quindi riduciamo la resistenza di membrana aumentando la conduttanza e quindi induciamo una riduzione della costante di spazio e l'azione inibitoria l'abbiamo comunque. Con questo meccanismo riduciamo le possibilit che queste correnti eccitatorie vengano generate sui dendriti e che possano raggiungere il cono di emergenza cio il centro integrativo del neurone aumentando la frequenza di scarica. La costante di spazio si abbassa e quindi l'attenuazione di queste correnti sinaptiche ioniche eccitatorie sar maggiore e meno correnti riusciranno a raggiungere il cono di emergenza dell'assone. D'altra parte abbiamo gi detto che una sinapsi GABAergica pu essere eccitatoria o inibitoria a seconda del tipo di trasportatore del cloro che presente in quel dato neurone. In molti neuroni il cloro distribuito passivamente e il potenziale di equilibrio quindi uguale al potenziale di membrana a riposo. In altri neuroni esistono dei trasportatori, due tipi principali che utilizzano il sodio in entrata e in uscita e in questi casi noi abbiamo che il cloro non distribuito passivamente ma attivamente attraverso questi scambiatori, se prevale l'entrata di cloro dall'esterno abbiamo una concentrazione di cloro elevata a livello della cellula, se prevale invece 124 lo scambiatore che porta il cloro all'esterno avremo una concentrazione intracellulare di cloro bassa, in questi due casi il potenziale di equilibrio del cloro sar come vediamo tendenzialmente pi positivo rispetto al potenziale di membrana e a destra con la concentrazione di cloro intracellulare bassa il potenziale di equilibrio del cloro sar tendenzialmente pi negativo rispetto al potenziale di membrana a riposo. Vediamo che in questa stessa cellula la stimolazione di una sinapsi GABA inibitoria che apre queste conduttanze al cloro produrr un potenziale postsinaptico eccitatorio nel primo caso quando la concentrazione intracellulare elevata e invece inibitorio nel secondo caso quando si aumenta la polarizzazione e quando la concentrazione intracellulare di cloro bassa. Aprire questa conduttanza al cloro signica spostare il potenziale di membrana verso il potenziale di equilibrio del cloro e in questi casi vediamo che la stessa sinapsi e lo stesso neurotrasmettitore pu produrre una depolarizzazione o una iperpolarizzazione, un'azione quindi eccitatoria o inibitoria. Non quindi il GABA in quanto tale che responsabile dell'azione eccitatoria o inibitoria ma il meccanismo di trasduzione a livello postsinaptico. Il GABA deriva metabolicamente dal gutammato

6.3. I 5 stadi attraverso un enzima chiamato GAD, decarbossilasi dell'acido glutammico, questa reazione avviene a livello citoplasmatico nel bottone sinaptico e poi ci sar un meccanismo di trasporto specico che aumenta la concentrazione del GABA all'interno delle vescicole sinaptiche che poi vengono liberate. L'azione del GABA viene interrotta con meccanismi diversi, non esiste un meccanismo metabolico a livello dello spazio sinaptico che idrolizza o comunque agisce sul neurotrasmettitore ma l'inattivazione avviene per riassorbimento del neurotrasmettitore. In questo caso vediamo che il riassorbimento avviene sia ad opera del bottone sinaptico stesso attraverso trasportatori di membrana specici ma importante anche in questo caso l'eetto d'azione delle cellule gliali che hanno dei loro trasportatori che rimuovono il GABA dallo spazio sinaptico. Questo GABA assorbito dalle cellule gliali segue con un meccanismo analogo a quello che succede per il glutammato, questo veniva riassorbito dalle cellule gliali con un meccanismo di reuptake e veniva trasformato in glutammina la quale poteva poi ritornare tramite trasporto nel bottone sinaptico. Qui abbiamo una cosa analoga, il GABA viene trasformato in glutammato nella cellula gliale, dal glutammato si passa ancora alla glutammina attraverso la glutammato sintetasi e questa viene portata sul bottone sinaptico del neurone presinaptico dove viene ritrasformata in glutammato e poi ancora in GABA. tutte le reazioni di sintesi dei neurotrasmettitori la sintesi avviene a livello citoplasmatico. interessante osservare inoltre che quando avviene l'esocitosi di queste vescicole viene riversato all'esterno anche l'enzima perch contenuto nelle vescicole. La noradrenalina un altro neurotrasmettitore molto importante, la sua sintesi avviene a livello citoplasmatico e questo non viene solitamente rilasciato a livello neuronale ma soprattutto nella midollare del surrene dove viene rilasciata anche l'adrenalina, un altro neurotrasmettitore che funge pi da ormone che da neurotrasmettitore, viene rilasciato all'esterno dopo l'aggiunta di un gruppo metilico da parte di una metiltransferasi alla noradrenalina. Questa reazione citoplasmatica e quindi nelle cellule della midollare del surrene la noradrenalina deve uscire dalla vescicola, nel citoplasma viene trasformata in adrenalina e poi viene immagazzinata in altre vescicole attraverso meccanismi di trasporto che rilasciano poi le vescicole all'esterno. Nel SNC i trasmettitori importanti sono la dopamina e la noradrenalina, noradrenalina rilasciata a livello periferico dall'ortosimpatico a livello postgangliare. Esistono meccanismi quindi di sintesi a livello citoplasmatico tranne che per la idrossilasi che produce la noradrenlina che situata all'interno della vescicola. Per il rilascio e l'inattivazione di queste amine biogene la glia non sembra svolgere un ruolo importante, abbiamo invece la comparsa di meccanismi metabolici di inattivazione del neurotrasmettitore nello spazio sinaptico. Abbiamo alcuni enzimi come le MAO o le COMP che sono situati sulla membrana postsinaptica ma non solo che inattivano queste amine biogene attraverso un meccanismo metabolico. Oltre a questo meccanismo molto importante abbiamo dei meccanismi di reuptake da parte del bottone sinaptico. Questo fatto da sottolineare perch esistono dei trasportatori specici per queste amine biogene, un trasportatore specico per la noradrenalina detto NET, per la dopamina DAT o SERT per la serotonina che recuperano neurotrasmettitore lasciato nello spazio sinaptico e lo fanno rientrare nel bottone sinaptico. Questo molto importante perch tutti questi trasportatori e enzimi metabolici che inattivano metabolicamente il neurotrasmettitore sono bersaglio di farmaci o di sostanze che hanno un'azione psicotropa molto rilevante. Per esempio sappiamo che queste sinapsi noradrenergiche che utilizzano dopamina o serotonergiche sono associate a molti eetti psicotropi importanti e l'alterazione di questi meccanismi di trasmissine sinaptica porta a patologie psichiatriche molto diuse clinicamente e molto importanti quali depressione maggiore, psicosi, schizofrenia, malattie ossessivo compulsive, fobie, tutte dovute in misura diversa e in un modo non sempre chiarissimo ad alterazioni della trasmissione sinaptica di queste amine biogene. Molti farmaci che cercano di 125

Amine biogene
Abbiamo preso in esame no adesso i neurotrasmettitori, vediamo un'altra classe di questi, le amine biogene. Le amine biogene sono una classe di neurotrasmettitori che in gran parte derivano tutti dalla stessa catena metabolica a partire dalla tirosina, abbiamo poi un'altra via metabolica che riguarda la serotonina che proviene a dierenza delle altre dal triptofano. Esiste una catena di enzimi in cui il fattore limitante il primo di questi, quello che trasforma la tirosina in DOPA attraverso la tirosina idrossilasi, viene idrossilato l'anello aromatico della tirosina e si ha la DOPA. Questo un precursore molto importante ma che normalmente non viene utilizzato come neurotrasmettitore, viene utilizzato talvolta come farmaco e agendo sui livelli di DOPA si agisce anche sui livelli di neurotrasmettitori veri e propri ma la DOPA non viene rilasciata normalmente come neurotrasmettitore nello spazio sinaptico. Per azione a livello citoplasmatico della DOPA decarbossilasi otteniamo la dopamina, un neurotrasmettitore molto diuso e importante. Per altre sinapsi dierenti esiste una dopamina idrossilasi che aggiunge un altro gruppo idrossilico e trasforma la dopamina in noradrenalina. interessante osservare che questa un'eccezione perch questo enzima, la dopamina idrossilasi presente nelle vescicole sinaptiche mentre abbiamo visto che per

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Le sinapsi

Figura 6.36: Sinapsi con amine biogene

correggere questi squilibri di trasmissione sinaptica agiscono su questi trasportatori, per esempio su NET e SERT che sono trasportatori del bottone sinaptico che conducono noradrenalina e serotonina e questi vengono inibiti da molti farmaci antidepressivi che hanno questa azione antidepressiva perch inibendo il reuptake del neurotrasmettitore fanno si che questo possa agire pi a lungo a livello sinaptico potenziando la trasmissione postsinaptica dell'adrenalina e della serotonina a livello centrale. Ci sono molte categorie di farmaci antidepressivi di questo tipo pi o meno selettivi ma sono farmaci molto importanti. Siccome la depressione una malattia molto complessa che si presenta dal punto di vista patologico e clinico in molti modi diversi, tante volte questi farmaci antidepressivi che agiscono sul reuptake di questi neurotrasmettitori non sono molto ecaci in alcune forme di depressione e quindi ecco che ci sono altre categorie di farmaci antidepressivi che per esempio inibiscono le MAO. In questo caso l'amina biogena agisce pi a lungo all'interno dello spazio sinaptico non perch viene inibito il reuptake ma perch viene inibita la sua degradazione metabolica e quindi ancora una volta la sua azione dura pi a lungo. Anche alcune droghe come la cocaina o l'anfetamina agiscono a livello dei trasportatori, per esempio in questo caso specico sulla dopamina, sul trasportatore della dopamina, la cocaina con126 tribuisce a uno stato di umore euforico, porta ad eetti disinibenti e non solo principalmente attraverso questo meccanismo, in maggior misura per inibendo il trasportatore specico per la dopamina. L'anfetamina pure ha un'azione analoga anche se pi complessa perch agisce sempre sul trasportatore ma ne favorisce il trasporto con una facilit di uscita potenziata della dopamina. Questi concetti hanno applicazioni importanti a livello farmacologico e clinico, ci sono altri farmaci come la reserpina che agisce invece sul trasportatore vescicolare inibendolo, in questo caso questo farmaco soprattutto per la noradrenalina riduce la concentrazione di noradrenalina all'interno della vescicola perch viene inibito il trasporto attivo e l'accumulo di neurotrasmettitore nella vescicola sinaptica e quindi queste sinapsi noradrenergiche attivate rilasciano meno neurotrasmettitore del normale. Inizialmente stata usata come antipertensivo del sistema ortosimpatico a livello periferico che produce un minore eetto vasocostrittivo dei vasi e un miglioramento dell'ipertensione.

Recettori metabotropici
Tutti questi neurotrasmettitori agiscono con un'eccezione non sui recettori ionotropici ma sui recettori metabotropici, agiscono a livello dell'altra categoria di recettori che sono i recettori metabotropici

6.3. I 5 stadi

Figura 6.37: Recettori metabotropici e ionotropici

legati a proteine G. La proteina G a livello intracellulare innesca una catena di eventi che portano alla produzione di secondi messaggeri che modicano il metabolismo della cellula oltre che a modicare eventualmente particolari conduttanze ioniche dei recettori metabotropici. I principali neurotrasmettitori che agiscono su recettori metabotropici sono diversi. Molti di questi neurotrasmettitori in realt li abbiamo gi incontrati perch oltre alla possibilit di agire su recettori metabotropici hanno la possibilit di agire su recettori ionotropici. Acetilcolina, glutammato, GABA agiscono sia su recettori ionotropici gi descritti precedentementee che anche su recettori metabotropici. Normalmente i recettori metabotropici come per i recettori ionotropici sono presenti in diverse tipologie. L'ach per esempio oltre ad agire su tanti tipi di recettori nicotinici agisce anche su tanti tipi di recettori di tipo muscarinico, ne abbiamo tanti tipi, sono stati identicati cinque tipi di recettori muscarinici (M1-M5). Per il glutammato oltre ad agire su AMPA, cainato e NMDA come recettori ionotropici abbiamo anche dei recettori metabotropici del glutammato. Per il GABA oltre al GABA A appena visto che agisce sulla conduttanza del cloro abbiamo anche dei recettori GABA B di tipo metabotropico cio legati a proteine G, le amine biogene hanno ciascuna un numero elevato e complesso di recettori metabotropici sui quali agire, cinque principali ciascuno dei quali ha dei sottotipi, la dopamina ha cinque principali recettori, la noradrenalina due principali e con diversi sottotipi. Delle amine biogene l'unico recettore ionotropico sino adesso trovato un tipo per la serotonina, HT3, questo ionotropico altrimenti tutti gli altri sono legati a proteina G. Oltre a questi neurotrasmettitori gi descritti abbiamo due esempi ma in realt ce ne sono altri di neuropeptidi. Di neuropeptidi ce ne sono a decine e hanno un'azione su recettori esclusivamente di tipo metabotropico cio legati a proteine G, ad esempio le encefaline ma ce ne sono molti altri tipi. Un'altra categoria di neurotrasmettitori importanti sono le purine, cio l'ATP che viene spesso rilasciata o corilasciata assieme ad altri neurotrasmettitori e il suo metabolita, l'adenosina, trasformato dall'ATP che agisce a livello postsinaptico su un recettore di tipo ionotropico per l'ATP chiamato P2X (recettore purinergico) ma nella maggior parte dei casi l'azione a livello di recettori metabotropici, A1, AE e A3 metabotropici per l'adenosina. I secondi messaggeri intracellulari sono importanti non solo per le sinapsi qui sopra indicate ma per tutta la siologia, soprattutto nella siologia endocrina ma non solo. Richiameremo rapidamente alcuni concetti dei secondi messaggeri di pertinenza particolare alle sinapsi ma il meccanismo generale dei secondi messaggeri qualcosa che va saputo a priori. In generale i recettori metabotropici associati a proteine G hanno tutti (sono tantissimi tipi diversi) la stessa struttura, sono proteine di membrana con sette domini transmembranari. Presentano una parte intracellulare e una catena polipeptidica che quella che si lega alla proteina G che media quindi la risposta del recettore. La proteina G presente in tantissimi tipi diversi ma tutte hanno una struttura generale, sono composte da tre subunit , e . La proteina G cos chiamata perch quando il recettore viene attivato lega una molecola di GTP e quando questa viene dislocata viene attivata, questa molecola si lega sempre alla subunit , la quale ha un'azione idrolitica sul GTP per cui questa reazione si autolimita con un certo ritardo. La subunit infatti poi idrolizza il GTP 127

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Le sinapsi

Figura 6.38: G coupled receptors

in GDP pi fosfato e quindi ritorniamo alla situazione di proteina G inattivata, questo meccanismo viene attivato per trasduzione del segnale da parte del neurotrasmettitore sul recettore metabotropico e questo meccanismo si autolimita quando la subunit idrolizza il GTP che la aveva attivata in GDP pi fosfato. Le due subunit quando la proteina G viene attivata si separano, la subunit prende una via e le subunit e ne prendono un'altra. Tutte e due queste subunit possono per avere un'azione intracellulare, vanno ad attivare degli eettori. Entrambe le proteine eettrici di tipo 1 e di tipo 2 possono farlo. I sistemi di secondi messaggeri pi importanti che ci interessano sono tre. In tutti i casi abbiamo un neurotrasmettitore che agisce su un recettore metabotropico, il trasduttore e la proteina G, si ha l'azione solitamente su un eettore situato sulla membrana cio un enzima normalmente che pu essere nei tre casi o l'adenil ciclasi o comunque una ciclasi di un nucleotide ciclico come cGMP che producono a loro volta quello che si chiama il secondo messaggero cellulare (come cAMP o cGMP) che agisce in tanti modi diversi. Gli altri due meccanismi importanti sono meccanismi che agiscono sui fosfolipidi di membrana. La proteina G va ad agire su una fosfolipasi che a sua volta agisce sul fosfatidininositolo, un fosfolipide di membrana. Abbiamo due tipi di fosfolipasi, la fosfolipasi di tipo C e la fosfolipasi 2. Il fosfatidilinositolo in realt una molecola piccola in mezzo alla membrana che legata all'inositolo attraverso un fosfato in mezzo a degli acidi grassi come l'acido 128

Figura 6.39: Trasduzione del segnale

arachidonico o acidi grassi a catena lunga. Le fosfolipasi rompono questa molecola che un fosfolipide di membrana del doppio strato lipidico in due punti, o a livello tra inositolo fosfato e il resto che prende il nome di diacilglicerolo (questo la fosfolipasi C) oppure la fosfolipasi A2 idrolizza la molecola separando l'acido arachidonico idrolizzando un legame interno. La fosfolipasi C o A2 separa dai fosfolipidi di membrana delle varie sostanze, nel caso della fosfolipasi C abbiamo la separazione dell'inositolo fosfato che viene trasformato in inositolo trifosfato dal diacilglicerolo che la parte grossa che rimane attaccata alla membrana, l'altro meccanismo che coinvolge la fosfolipasi A stacca l'acido arachidonico che attraverso altri cicli come quello che riguarda le ciclossigenasi si trasforma in metaboliti dell'acido arachidonico importanti per la formazione ad esempio delle prostaglandine o dei leucotrieni. La proteina G a seconda del canale e del tipo di recettore pu avere due azioni, pu essere sia eccitatoria sia inibitoria, stimolante cio o inibitoria sull'eet-

6.3. I 5 stadi

Figura 6.40: Vie di trasduzione

tore, in questo caso l'adenilato ciclasi.Un recettore di tipo per la noradrenalina che ha un'azione stimolante sull'adenilato ciclasi associata alla membrana ha l'eetto di aumentare la concentrazione di cAMP intracellulare. Un altro recettore come l'2 noradrenergico ma pi importante in questo contesto potrebbe essere un recettore muscarinico che agisce sempre sul cAMP ma con una proteina G di tipo inibitorio che riduce cio l'attivit dell'adenilato ciclasi e riduce quindi la concentrazione di cAMP intracellulare. L'eetto del cAMP pu essere o diretto in alcuni casi come nelle sinapsi oppure molto frequentemente nella cellula agisce attraverso delle protein chinasi e questo un meccanismo generale di azione dei secondi messaggeri, l'attivazione di una protein chinasi che va a fosforilare altri substrati proteici. Le possibilit sono praticamente innite, per quel che ci riguarda a livello sinaptico si pu avere la fosforilazione a livello dei canali ionici e quindi la modicazione della permeabilit di un canale fosforilando la parte intracellulare del canale stesso. La via dei fosfolipidi di membrana invece presenta fosfatidilinositolo, un fosfolipide di membrana che viene idrolizzato dalla PLC, dalla fosfolipasi C sempre attivata dalla subunit in inositolo trifosfato e diacilglicerolo che la parte rimanente che rimane attaccata alla membrana. Tutte e due le sostanze agiscono da secondi messaggeri perch entrambe sono in grado di attivare delle protein chinasi, il diacilglicerolo direttamente una protein chinasi C che fosforiler altri substrati proteici, l'inositolo trifosfato invece molto importante anche a livello del muscolo liscio perch ha la propriet di stimolare il reticolo endoplasmatico liscio a rilasciare calcio. L'attivazione quindi della fosfolipasi C che produce come secondo messaggero a livello citoplasmatico l'inositolo trifosfato ha l'eetto di aumentare la concentrazione di calcio intracellulare rilasciato dalle scorte intracellulari di calcio stesse. La concentrazione di calcio citoplasmatica libera molto bassa, nell'ordine di 107 M in condizioni normali, l'aumento di questa concentrazione di calcio produce numerosi eetti modulatori all'interno della cellula. Il calcio pu agire direttamente come tale ma anche questo ha uno dei suoi meccanismi principali che quello di legarsi a un'altra proteina, la calmodulina e il complesso calcio calmodulina in grado di attvare delle protein chinasi chiamate protein chinasi calcio-calmodulina dipendenti. 129

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Le sinapsi

Vediamo quindi che alla ne tutti questi meccanismi di azione di secondi messaggeri come eetto ultimo con altri passaggi intermedi hanno quello di attivare delle protein chinasi, abbiamo protein chinasi di tipo A attivate dal cAMP, protein chinasi attivate dal cGMP, protein chinasi C attivate dal diacilglicerolo, il calcio rilasciato dall'inositolo trifosfato che legandosi a calmodulina pu attivare altre protein chinasi e altri casi che richiedono l'intervento di recettori metabotropici che attivano tirosin chinasi e in questo caso gi il recettore stesso che ha un'azione di chinasi, importante come meccanismo ad esempio nell'induzione della secrezione di insulina. Vediamo quindi che l'attivazione di tantissimi tipi di recettori metabotropici pu indurre un numero molto elevato di risposte intracellulari nella maggior parte dei casi che prevedono l'attivazione di protein chinasi ma abbiamo altre possibilit molto pi rapide ed entriamo nel dettaglio a parlare di sinapsi. Per esempio per quanto riguarda le conduttanze ioniche oltre al meccanismo gi visto dato dalla fosforilazione di protein chinasi delle proteine canale che aumenta la conduttanza abbiamo altre situazioni in cui la proteina G stessa in grado di legarsi al canale modicando una conduttanza ionica. Questo un meccanismo molto pi veloce perch non necessario produrre un secondo messaggero intracellulare che a sua volta andr ad attivare protein chinasi, questi sono meccanismi molto lenti che durano molto a lungo. La sinapsi invece un meccanismo molto veloce, molto pi rapido e che dura di meno. In questo caso proprio la subunit - che va a legarsi a dei canali potassio normalmente i quali vengono aperti. Se apriamo la conduttanza del potassio l'azione sar inibitoria perch portiamo il potenziale di membrana verso il potenziale di equiibrio del potassio. Esistono infatti recettori muscarinici di tipo a livello del muscolo cardiaco per esempio che hanno un'azione inibitoria attraverso questo meccanismo e ci sono anche recettori GABA B che tra le altre funzioni presentano questo meccanismo d'azione, sempre un'azione inibitoria legata alla proteina G che va ad aprire la conduttanza al potassio, il GABA quindi permette il passaggio del potassio. Questo uno dei sistemi estremamente veloci perch con basse latenze si ha un cambiamento di conduttanza di membrana sempre utilizzando recettori metabotropici e grazie alle proteine G. La via dell'acido arachidonico libera appunto acido arachidonico e questo interviene in vie metaboliche con numerosi enzimi come le ciclossigenasi che danno un'azione importante con i loro metaboliti a livello sia intracellulare che extracellulare, come prostaglandine e leucotrieni o altri metaboliti. Questo un altro meccanismo che interviene massicciamente per esempio nei processi inammatori 130

ma ha un suo ruolo anche in alcuni sistemi a livello neuronale.

Figura 6.42: Regolazione della trascrizione

L'attivazione ripetuta di questi recettori metabotropici oltre ad avere un'azione plastica e adattativa a lungo termine all'interno della cellula pu arrivare ad avere un'azione di induzione genica. In particolare la protein chinasi A attivata dal cAMP pu andare a fosforilare le proteine regolatrici che a livello del nucleo possono indurre la trascrizione di nuovi RNA e quindi la sintesi di nuove proteine aumentandone la quantit all'interno della cellula. Questi meccanismi fra l'altro si pensa che siano fondamentali per la memoria a lungo termine. Questo caso sicuramente un esempio in cui abbiamo sintesi e induzione proteica ma non solo, abbiamo esempi in cui questa attivazione ripetuta a lungo termine di questi recettori metabotropici porta delle modicazioni con una durata molto elevata. La dierenza data da recettori ionotropici che hanno un'azione rapida e veloce e recettori metabotropici che hanno un'azione sicuramente pi lunga ma pi duratura.

Secondi messaggeri gassosi

Parliamo dei secondi messaggeri gassosi, sostanze che vengono sintetizzate dalla cellula postsinaptica e che in questo caso hanno un'azione sulle cellule vicine. Ci possibile perch sono sostanze a basso PM che diondono molto rapidamente, i pi importanti sono l'ossido nitrico e il monossido di

6.3. I 5 stadi

Figura 6.41: Attivazione diretta di proteine G

Figura 6.43: Secondi messaggeri gassosi

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Le sinapsi

carbonio che viene prodotto dalla cellula postinaptica sotto azione sempre di recettori metabotropici, queste molecole a basso PM hanno inoltre alcune peculiarit. Sono molecole estremamente liposolubili e molto piccole e diondono con una grande velocit, hanno una vita molto breve, di circa 4 o 5 s, dopodich vengono inattivate. Nel frattempo per la loro grande diusibilit fa si che questi una volta prodotti diondano sia nelle cellule vicine ma anche a livello del bottone presinaptico. L'attivazione di questi recettori metabotropici attraverso questo meccanismo pu agire non solo sulla cellula postsinaptica e sulle cellule vicine ma soprattutto pu anche modicare il meccanismo di liberazione del neurotrasmettitore da parte del bottone sinaptico. In generale questi neurotrasmettitori gassosi vengono sintetizzati da un'enzima, la NO sintetasi che viene attivato sempre da un complesso calciocalmodulina dipendente. Questo recettore metabotropico deve in qualche modo aumentare la concentrazione di calcio ad esempio attraverso l'IP3 che libera il calcio dai depositi intracellulari, questo calcio legato alla calmodulina stimola la NO sintetasi che produce questo neurotrasmettitore che dionde e il meccanismo di azione di questo neurotrasmettitore sempre associato alla produzione nella cellula bersaglio, sia presinaptica che nelle cellule vicine di una sintesi e produzione di cAMP attraverso una cAMP sintetasi. L'adenilato ciclasi citoplasmatica aumenta quindi i livelli di cAMP che possono avere numerosi eetti. Ad esempio nei recettori NMDA questi recettori di cAMP a livello presinaptico possono favorire il rilascio di neurotrasmettitore da parte delle zone attive, aumentare la sintesi di neurotrasmettitore a livello presinaptico e indurre addirittura un processo di sprouting, di gemmazione delle terminazioni sinaptiche aumentando il numero di condizioni sinaptiche dei sistemi che pu avere azioni molto potenti a lungo termine, ci alla base di molti meccanismi di plasticit sinaptica.

6.3.2 Immagazzinamento del neurotrasmettitore

Sino adesso noi di questi cinque stadi della trasmissione sinaptica abbiamo descritto in vari casi come il neurotrasmettitore viene sintetizzato a seconda del tipo di neurotrasmettitore coinvolto, come avviene il riconoscimento del neurotrasmettitore da parte dei recettori bersaglio ionotropici e metabotropici e come avviene la terminazione dell'azione del neurotrasmettitore. Ci rimane da descrivere come il neurotrasmettitore viene immagazzinato nelle vescicole sinaptiche e soprattutto come viene rilasciato nello spazio sinaptico, cio come avviene il processo di esocitosi delle vescicole. Abbiamo gi detto che anch avvenga l'esocitosi delle vescicole indispensabile che aumenti il livello citoplasma132

tico nel bottone sinaptico della concentrazione di calcio. Se impediamo l'entrata del calcio nel bottone sinaptico la trasmissione sinaptica di tipo chimico viene bloccata e questo in tutte le sinapsi nora studiate, un meccanismo fondamentale per tutti i meccanismi di sinapsi di tipo chimico. Ci sono canali voltaggio dipendenti per il calcio nelle zone attive che appunto si aprono quando il potenziale d'azione invade il bottone sinaptico, depolarizza la membrana e induce l'apertura dei canali voltaggio dipendenti. Se non entra il calcio l'esocitosi delle vescicole non pu avvenire. Ci sono tre aspetti che dobbiamo capire di questo meccanismo: innanzitutto il calcio indispensabile, se non entra il calcio la trasmissione sinaptica non avviene. Se andiamo a vedere come cambia la concentrazione di calcio del bottone sinaptico quando la cellula viene attivata dal potenziale d'azione vediamo che il calcio cambia da una concentrazione bassissima di 107 molare aumentando di circa il 10%, il potenziale d'azione induce una variazione della concentrazione di calcio da 100 a 110 nM. In tutti i meccanismi enzimatici ma non solo in cui il calcio svolge un ruolo modulatorio un aumento della concentrazione di calcio del 10% troppo piccola e non porta a nessun cambiamento osservabile macroscopicamente. Inoltre questo aumento di concentrazione del 10% di calcio persiste per centinaia di ms, una sinapsi attivata centinaia di volte al secondo in molto neuroni o molto pi frequentemente, la durata dell'eetto sinaptico di pochi ms, decine di ms quindi non si capisce come questo evento che dura cos tanto possa eettivamente di per s avere un ruolo e bisogna cercare di capire meglio questo aspetto. L'altro aspetto importante che ciascun bottone sinaptico ha un buon numero di vescicole di scorta, un pool di vescicole presenti all'interno del bottone, diciamo che sono 200-300 vescicole nella maggior parte dei bottoni sinaptici. Ammettendo anche che per ogni potenziale d'azione che arriva venga liberata una sola vescicola noi avremo che se un neurone scarica a 10 hz, dieci potenziali d'azione al secondo che una frequenza piuttosto bassa per un neurone avremo che in un minuto bisogna rilasciare 600 vescicole, se ne abbiamo 200-300 la deplezione di vescicole avverrebbe molto presto. Teniamo presente che i neuroni possono scaricare anche con una frequenza di centinaia di Hertz al secondo per periodi anche prolungati, si pu parlare di 500-1000 potenziali d'azione al secondo. Vediamo quindi che indispensabile che ci sia un meccanismo estremamente eciente attraverso il quale le vescicole sinaptiche possano essere rapidamente costituite. Abbiamo un pool di riserva che ci aiuta a superare questo problema ma evidentemente deve esserci un meccanismo molto eciente e soprattutto molto rapido che nel giro di pochissimo continua

6.3. I 5 stadi

Figura 6.44: Importanza del calcio

a produrre nuove vescicole sinaptiche cariche di neurotrasmettitore disponibili per l'esocitosi. Ci deve essere quindi una macchina metabolica che fa questo, ricordiamo che il bottone sinaptico pieno di mitocondri e il consumo metabolico di ATP a livello del bottone sinaptico molto elevato, questa una delle ragioni. L'altro aspetto capire come fa tutto questo sistema che produce esocitosi dopo l'entrata del calcio con diusione del neurotrasmettitore a compiersi nel giro di mezzo o 1 ms, dipende dalle sinapsi. Il ritardo sinaptico, il tempo che intercorre tra l'arrivo del potenziale d'azione al bottone sinaptico e l'inizio del cambiamento del potenziale di membrana dell'elemento postsinaptico nell'ordine del ms, a volte qualcosa di meno o di pi. la liberazione del neurotrasmettitore e l'inizio della variazione di calcio intracellulare a livello del bottone sinaptico il tempo di circa 0,2-0,3 ms, molto breve. In questo tempo la vescicola fonde la sua membrana con la membrana presinaptica e svuota esternamente il neurotrasmettitore, anche questa fase si importante ma sicuramente in una quota minore dell'intervallo sinaptico. La maggior parte dell'intervallo sinaptico il tempo che ci impiega quello che rimane da accadere, il tempo che ci impiegano i canali voltaggio dipendenti al sodio ad aprirsi, questo perch sono abbastanza lenti, da quando depolarizziamo la membrana a quando questi canali si aprono ci vogliono alcune decine di ms tali da produrre una variazione della concentrazione di calcio all'interno del bottone sinaptico suciente a indurre l'esocitosi delle vescicole. La maggior parte del ritardo sinaptico dovuta quindi al tempo di apertura dei canali voltaggio dipendenti, poi un tempo piccolo di 0,2-0,3 ms necessario per indurre esocitosi delle vescicole e il neurotrasmettitore dionde nell'ordine di microsecondi con un tempo quindi assolutamente trascurabile. Abbiamo detto quindi che senza l'entrata del calcio non si ha la trasmissione sinaptica, vediamo che variando la depolarizzazione del potenziale presinaptico aumentandola, questa produce aumento di entrata di calcio dal bottone sinaptico, il potenziale postsinaptico graduato in funzione della quantit di calcio che entra nel bottone presinaptico. Pi calcio quindi entra a livello presinaptico maggiore il numero di vescicole che viene rilasciato nello strato sinaptico e maggiore e pi ampia sar la dimensione del potenziale postsinaptico. Se impediamo al calcio di entrare il potenziale postsinaptico non c'. 133

Ritardo sinaptico Cominciamo ad analizzare il

ritardo sinaptico. La parte di questa sequenza di eventi importante per il ritardo sinaptico molto specica. Il potenziale di azione a livello presinaptico invade il bottone sinaptico, si ha poi un potenziale di membrana a livello postsinaptico con una sinapsi eccitatoria EPSP, a livello postsinaptico possiamo avere o meno il potenziale d'azione ma questo non ci interessa. Il ritardo sinaptico il tempo che intercorre tra l'arrivo e l'inizio del potenziale d'azione a livello del bottone sinaptico e l'inizio della variazione del potenziale di membrana a livello postsinaptico e questo pu essere di mezzo ms o pi frequentemente intorno al ms. In questo ms la maggior parte del tempo dovuta sicuramente non alla diusione del neurotrasmettitore, lo spazio sinaptico talmente piccolo che in pochi microsecondi il trasmettitore riesce a diondere nell'altra parte, non quindi questo il fattore limitante. Tra

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Le sinapsi

Figura 6.45: Ritardo sinaptico

L'altro aspetto che adesso dobbiamo analizzare che il neurotrasmettitore viene rilasciato in modo continuo, la quantit di recettore rilasciato dipende da un numero di potenziali d'azione che invadono il bottone sinaptico. Questo rilascio in realt non un rilascio graduato continuo ma avviene con multipli di una quantit unitaria minima che viene chiamata in siologia quanto di neurotrasmettitore, termine preso in prestito dalla sica quantistica e la quantit minima di neurotrasmettitore che viene rilasciato la quantit di neurotrasmettitore contenuto nella vescicola sinaptica. Si visto che tutte le vescicole sinaptiche contengono pi o meno la stessa quantit di neurotrasmettitore per tutti i neurotrasmettitori di nostro interesse, cio 4 o 5 molecole di neurotrasmettitore. Le vescicole sinaptiche hanno pi o meno tutte la stessa dimensione di 30-40 nm, questo le vescicole sinaptiche piccole a centro chiaro che contengono i neurotrasmettitori classici. Quella la quantit minima di neurotrasmettitore, quando la vescicola si apre all'esterno tutta la quantit di neurotrasmettitore in essa contenuta esce dallo spazio sinaptico e questa la quantit minima. La gradualit di ampiezza del potenziale postsinaptico dipen134 de dal numero di vescicole che vengono rilasciate perch comunque i pacchetti minimi di neurotrasmettitore che vengono rilasciati sono quelli contenuti in una vescicola sinaptica chiamata quanto di neurotrasmettitore. Questo stato dimostrato e si vede anche in alcuni graci. Abbiamo detto pi volte che anche per l'esocitosi delle vescicole si parla di concezione probabilistica, se aumentiamo la concentrazione di calcio all'interno del bottone aumentiamo la probabilit che la vescicola svuoti il suo contenuto all'esterno e quindi che avvenga l'esocitosi. Difatti si vede che anche in assenza di attivazione del bottone sinaptico come nella placca neuromuscolare se andiamo a registrare il potenziale di membrana vicino alla placca neuromuscolare in assenza di attivazione di terminazione nervosa vediamo comunque dei segnali e delle piccole depolarizzazioni di ampiezza di circa 1 mV o meno che avvengono spontaneamente. I segnali hanno le stesse caratteristiche di durata e di forma dei potenziali di placca che si vedono normalmente, quando attiviamo il motoneurone. Quando attiviamo il motoneurone il potenziale di placca talmente grande da portare sempre il potenziale di membrana

6.3. I 5 stadi

Figura 6.46: Rilascio del calcio

al di sopra della soglia e parte il potenziale d'azione. Quando per non viene attivato il motoneurone ci sono piccoli segnali che autonomamente vengono rilasciati. Oltretutto questi piccoli segnali chiamati potenziali di placca in miniatura si propagano in modo elettrotonico, sono molto piccoli, non si raggiunge la soglia di attivazione e se andiamo a 1 mm di distanza dalla placca muscolare la loro ampiezza talmente piccola che praticamente possono essere considerati scomparsi. Sono quindi piccoli potenziali di placca che si propagano elettrotonicamente con un decremento consistente. In un altro esperimento si ridotta la concentrazione di calcio extracellulare, rimuovendo completamente il calcio la trasmissione sinaptica abolita. Diminuiamo la concentrazione di calcio in modo quasi da abolirla ma non del tutto, facciamo entrare poco calcio, la probabilit di rilascio delle vescicole viene ridotta enormemente ma comunque un po' di rilascio di vescicole c'. In questo caso diamo una stimolazione del nervo motore, vediamo dei segnali di attivazione spontanei sull'attivazione del potenziale di placca in miniatura prima visti, quando attiviamo invece il nervo motore vediamo che con un ritardo costante possiamo o no avere un altro segnale che assomiglia a questi segnali in miniatura spontanei. Pu esserci o non esserci su base probabilistica, pu essere inoltre pi piccolo o pi grande. Se andiamo a creare un istogramma delle ampiezze di tutti questi potenziali di placca evocati dallo stimolo di basso calcio intracellulare e quindi di ampiezza piccola vediamo che in realt queste ampiezze non cambiano in modo graduato ma tendono a essere multipli di una dimensione minima che corrisponde per questo esempio a 0,4-0,5 mV, valore che corrisponde all'ampiezza del potenziale spontaneo in miniatura che osserviamo quando la placca neuromuscolare a riposo. In questo caso attiviamo un potenziale di placca multiplo del potenziale di placca in miniatura quando presente. Questo sta a dimostrare che questi potenziali di placca in miniatura spontanei non sono altro che la liberazione spontanea di una vescicola sinaptica che anche in assenza di attivazione della terminazione sinaptica talvolta viene rilasciata e questo sottolinea il fatto che il calcio semplicemente aumenta la probabilit con la quale le membrana della vescicola sinaptica si fonde con la membrana sinaptica e quindi contribuisce all'esocitosi. Semplicemente lo stimolo produce un aumento dell'ampiezza del potenziale di placca che risulta essere un multiplo dell'ampiezza del potenziale di placca in miniatura. Normalmente ne vengono rilasciate talmente tante di queste vescicole da produrre un potenziale di placca di 60-80 mV, si possono fare dei calcoli riguardanti il numero delle vescicole. A un potenziale di placca in miniatura di circa 0,5 mV sappiamo con quanti mV viene prodotta l'apertura di un singolo canale nicotinico con il metodo patch clamp (0,3 V ), si dimostra quindi che a un potenziale di placca di circa mezzo mV bisogna aprire circa 2000 canali. Ogni canale ha due subunit e quindi per aprirsi deve legare 135

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Le sinapsi

Figura 6.47: Potenziale in miniatura e potenziale totale

due molecole di ach, vuol dire che ci vogliono circa 4000 molecole di ach per produrre un potenziale in miniatura di queste dimensioni. Tenendo presente che l'ach viene metabolizzata o dionde nello spazio sinaptico prima che possa legarsi al recettore possiamo fare un conto approssimativo che un quanto contenuto di una vescicola sinaptica di circa 5000 molecole di ach. Questa l'entit di neurotrasmettitore presente nelle sinapsi glutamatergiche e GABAergiche. Una vescicola contiene quindi circa 5000 molecole di ach che producono una depolarizzazione di 0,5 mV. Un potenziale di placca di circa 70 mV indica che bisogna rilasciare circa 150 quanti di vescicole, arriva un potenziale d'azione e vengono rilasciate 150 vescicole e questa una peculiarit del potenziale di placca. Se andiamo a contare quanti sono i bottoni sinaptici presenti nella placca motrice vediamo che sono qualche centinaia, solitamente circa 300. Quando arriva un potenziale d'azione che invade la placca motrice vengono rilasciate circa 150 vescicole su 300 zone attive, stiamo facendo un discorso approssimativo. La probabilit che una zona attiva rilasci una vescicola quando viene invasa da un potenziale d'azione di circa il 50%. Qualche volta siccome una questione probabilistica possono essere rilasciate pi vescicole del normale o addirittura nessuna. Ecco quindi spiegato perch il 136 potenziale postsinaptico eccitatorio di una sinapsi centrale dell'ordine di 0,5 mV o 1 mV, vuol dire che ogni zona attiva anche a livello centrale pu rilasciare o pu non rilasciare una vescicola, pu arrivare un potenziale d'azione e non si ha nessun rilascio di neurotrasmettitore, spesso le zone attive producono 2 o 3 bottoni sinaptici per 5 o 6 zone attive, possiamo rilasciare da 1 a 3 quanti e questo spiega perch l'ampiezza del potenziale postsinaptico di 0,5 mV o 2 mV al massimo. I meccanismi generali dei neurotrasmettitori sono gli stessi per la placca muscolare e per le sinapsi centrali. Continuamo a parlare della trasmissione sinaptica e della liberazione del neurotrasmettitore. Abbiamo sottolineato come il potenziale d'azione della membrana produce un'entrata di calcio indispensabile che semplicemente aumenta la probabilit di rilascio delle vescicole. Le vescicole anche spontaneamente vengono rilasciate, solamente la probabilit di rilascio aumenta grandemente quando abbiamo un potenziale d'azione, quando depolarizziamo la membrana e questo aumento di probabilit sincrono per tutti i bottoni sinaptici della placca motrice e produce la liberazione di circa 150 quanti di vescicole che danno origine a un potenziale di placca di 70-80 mV che osserviamo in condizioni siologiche. Quando arriva il potenziale d'azione nel bottone

6.3. I 5 stadi crozone perch evidente che nel momento in cui si apre il canale per questo breve tempo di 1 ms (il calcio aumenta all'interno per centinaia di ms) il calcio che entra nel bottone sinaptico produrr un aumento di concentrazione locale nella zona intorno al canale che si riduce molto rapidamente man mano che ci allontaniamo dal canale stesso. Si pu calcolare che in un raggio di circa 50 nm intorno al canale la concentrazione di calcio aumenta di circa 100 m, cio da 0,1 m. La concentrazione molare siologica citoplasmatica del calcio si arriva a una concentrazione di mille volte quella di riposo in un raggio limitato di 50 nm intorno al canale. Man mano che ci allontaniamo la concentrazione diminuisce, per un breve periodo di tempo abbiamo per una concentrazione 1000 volte superiore al normale in un piccolo intorno rispetto al canale al calcio. Si calcola circa che intorno a ciascun canale in una zona attiva abbiamo una decina di canali al calcio intorno a ogni vescicola, le vescicole sono attaccate alla zona attiva. In quel raggio di 50 nm possiamo contare che mediamente abbiamo una decina di canali, vuol dire che le vescicole sono tutte situate sucientemente vicine a un canale al calcio tale per cui quando arriva il potenziale d'azione per 1-2 ms abbiamo una concentrazione di calcio che 1000 volte superiore a quella normale. Dopodich il calcio dionde nel bottone sinaptico, per alcune centinaia di ms eettivamente all'interno del bottone sinaptico da 0,1 m si va a 0,11 m, un aumento minimo complessivamente, nella microzona vicino alle vescicole invece l'aumento molto elevato e ci spiega come viene innescato il meccanismo dell'esocitosi in un tempo cos breve e in un modo cos preciso. Questa disposizione vera normalmente per tutte le sinapsi, per la placca muscolare questo portato ai massimi livelli, stata ricostruita la struttura della placca neuromuscolare, in corrispondenza delle zone attive ci sono vescicole gi attraccate alla membrana pronte per l'esocitosi, quando arriva il potenziale d'azione si ha l'esocitosi di alcune di queste vescicole. Le vescicole sono tenute in sede e nella zona della placca neuromuscolare le zone attive sono strisce allungate come dei nastri dove alcune proteine tengono ancorate le vescicole in posizione pronte per l'esocitosi. Vediamo che lungo la zona attiva ci sono le proteine dei canali al calcio situati in corrispondenza al punto in cui le vescicole sono attraccate, quando arriva il potenziale d'azione quindi c' un ritardo di un ms prima che si aprano questi canali e una volta che questi sono aperti il calcio dionde in modo rapidissimo perch la distanza coinvolta veramente piccola e in pochissimo tempo (nell'ordine di pochi microsecondi) raggiunge una concentrazione sucientemente alta intorno alla vescicola che induce l'esocitosi. In una immagine di criofrattura vediamo la mem137

Figura 6.48: Aumento intracellulare del calcio

sinaptico la concentrazione di calcio che possiamo misurare all'interno del bottone aumenta del solo 10%, una quantit molto piccola e questo aumento perdura per qualche centinaio di millisecondi. Evidentemente non pu essere questo aumento del 10% che viene mantenuto per qualche centinaio di ms a indurre l'esocitosi. Il potenziale sinaptico dura poche decine di ms e la liberazione del neurotrasmettitore molto limitata nel tempo, evidentemente bisogna cercare di capire qual il meccanismo attraverso il quale il calcio riesce a liberare in modo cos preciso le vescicole sinaptiche quando arriva il potenziale d'azione. Possiamo vedere qual la struttura della zona attiva, abbiamo detto che le vescicole vengono liberate in corrispondenza della zona attiva, non in un punto qualunque del bottone sinaptico. Nella zona attiva abbiamo circa (con molte varianti da cellula a cellula e da sinapsi a sinapsi) un centinaio di canali al calcio. Quando arriva il potenziale d'azione questi sono canali voltaggio dipendenti, abbastanza lenti perch buona parte del ritardo sinaptico da imputare al tempo che impiegano questi canali ad aprirsi quando si ha la depolarizzazione. L'apertura dei canali dura circa 0,5 ms, quando arriva il potenziale d'azione per circa mezzo ms questi canali al calcio si aprono. Evidentemente il calcio comincia a uire dall'esterno verso l'interno, queste zone vengono chiamate anche mi-

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Le sinapsi

Figura 6.49: Criofrattura di membrana

brana del bottone presinaptico vista dallo spazio sinaptico verso il bottone sinaptico, vediamo il nastro della zona attiva. Ci sono delle fossette date dalle vescicole che si stanno aprendo col poro di fusione vuotando all'esterno il neurotrasmettitore e sono ben visibili i canali del calcio situati appunto in stretta corrispondenza al punto in cui le vescicole sono attraccate. Questo spiega come si raggiungono le altissime concentrazioni di calcio per brevi periodi di tempo in corrispondenza del punto di attracco della vescicola e come il processo di esocitosi possa avvenire in modo estremamente rapido. Questo era infatti l'altro problema da risolvere, come si riesce a ottenere un rilascio cos rapido dei neurotrasmettitori quando arriva il potenziale d'azione. Non ci sarebbe tempo perch una qualsiasi di queste vescicole possa migrare sino alla membrana e poi possa venire innescato il processo di esocitosi, questo avviene per le vescicole che gi sono pronte per svuotare il loro contenuto verso l'esterno e ci inoltre avviene solo nelle zone attive.

6.3.3 Tracking
Si tratta ora di cercare di capire come le vescicole si spostano, come il tracking vescicolare avviene, come queste vengono mobilizzate dal pool di riserva, vengono portate sulla zona attiva, si ancorano su questa e qual il meccanismo attraverso il quale il calcio induce l'esocitosi. Abbiamo detto che anche importante come queste vescicole vengono riciclate perch se abbiamo 200-300 vescicole di riserva queste basterebbero per un'attivit normale della sinapsi per pochi minuti se non venissero ricostituite in modo estremamente eciente e rapido. Le vescicole quindi devono essere continuamente prese dal pool di riserva, portate sulla zona attiva, andare incontro a esocitosi quando arriva il potenziale d'azione, ricostituite rapidamente a riformare poi il pool di riserva che mano a mano viene consumato. Tutto questo viene fatto attraverso un grande numero di proteine presenti sia sulla membrana delle vescicole sia all'interno del bottone sinaptico. C' un meccanismo molto complesso che ormai capito in buona parte ma non ancora completamente che illustreremo per sommi capi. Innanzitutto cerchiamo di capire come vengono

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6.3. I 5 stadi

Figura 6.50: Mobilizzazione delle vescicole dal pool

mobilizzate le vescicole dal pool di riserva, le vescicole dal pool di riserva sono ancorate a dei lamenti di citoscheletro, lamenti costituiti essenzialmente da actina. Abbiamo un numero di vescicole quindi gi ancorate alla zona attiva e un numero di vescicole nel pool di riserva in cui si intravedono anche alcune bre del citoscheletro. Le vescicole sono ancorate al citoscheletro attraverso una proteina di membrana presente nella vescicola stessa, in realt sono una famiglia di proteine chiamate sinapsine, attraverso le sinapsine le vescicole sono ancorate ai lamenti di actina. Ogni volta che abbiamo un potenziale d'azione ci sar un certo numero di vescicole che viene esocitato ma poi bisogna mobilizzare un certo numero di queste vescicole del pool di riserva, questo processo fondamentalmente ancora ad opera del calcio. Attraverso un meccanismo che ancora quello visto delle protein-chinasi il calcio si lega alla calmodulina intracellulare e va ad attivare come complesso calcio-calmodulina una protein chinasi specica che viene chiamata protein chinasi calcio-calmodulina dipendente. L'entrata di calcio nel bottone sinaptico non solo promuove rapidamente come abbiamo visto l'esocitosi di alcune vescicole gi sulla zona attiva ma l'aumento della sua concentrazione nel bottone sinaptico fa si che un certo numero di queste sinapsine vengano fosforilate e quando queste sono fosforilate la vescicola si stacca dal lamento di actina e viene mobilizzata. Il calcio fondamentale quindi per entrambi questi processi presinaptici, esocitosi delle vescicole e mobilitazione delle vescicole dal pool di riserva attraverso questo meccanismo. Queste vescicole mobilizzate poi devono andare sulla zona attiva, devono riconoscere la zona attiva e attraccarsi. Sono presenti moltissime proteine sulla membrana vescicolare, le vescicole hanno un numero grande di queste proteine, per esempio il trasportatore che porta all'interno e concentra nel lume il neurotrasmettitore, abbiamo la sinapsina appena nominata e altre pompe protoniche come la sinaptosina, un numero elevato di proteine che svolgono tutte un ruolo specico. Vediamo le principali di queste proteine e classichiamole a seconda del tipo di ruolo che svolgono. La sinapsina permette l'attacco alle bre del citoscheletro, un trasportatore vescicolare che porta all'interno della vescicola il neurotrasmettitore. Abbiamo poi delle proteine come la RAB3 che una proteina G monomerica a dierenza delle altre proteine analizzate precedentemente. Fondamentalmente quando questo tipo di proteine G monomeriche si legano alla membrana della vescicola legano una molecola di GTP e in questa condizione si permette in modo non chiarissimo di spostare la vescicola verso la zona attiva, la vescicola viene distaccata dal pool di riserva e viene indirizzata verso la zona di ancoraggio, sulla zona attiva c' un'altra proteina della membrana presinaptica chiamata RIM che fa s che quando la vescicola riesce a trovare il suo punto di ancoraggio la proteina G monomerica RAB3 cominci ad avere la sua azione idrolitica su GTP e lo idrolizza a GDP. Questa diventa poi inattiva e si stacca dalla vescicola, mantiene il suo collegamento con la vescicola sino a quando la vescicola non trova la sua zona di attacco quindi c' un'interazione con un'altra pro139

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Le sinapsi

Figura 6.51: Struttura tipo di una vescicola

teina della membrana che fa si che il GTP venga idrolizzato e il RAB3 entra in soluzione ed pronto a legarsi a un'altra vescicola. RAB3 attraverso questo meccanismo GTP/GDP quindi indirizza e porta la vescicola verso la zona attiva corrispondente, questo vuol dire che questo processo consuma energia perch ogni volta abbiamo il consumo di una molecola di GTP che viene idrolizzata a GDP. zona attiva. Questo non suciente per preparare la vescicola all'esocitosi, bisogna che venga fatto un processo chiamato priming, cio le due membrane della vescicola sinaptica e della membrana presinaptica devono entrare praticamente in contatto senza fondersi e avvicinarsi il pi possibile, in particolare deve essere rimossa l'acqua di idratazione che sappiamo essere presente ogni qual volta si ha una molecola polare. La membrana fosfolipidica ha dei gruppi idrolici rivolti verso il citoplasma e ci sar quindi una certa acqua di idratazione legata a questi gruppi idrolici determinata da molecole polari. Se le due membrane devono andare quasi in contatto senza fondersi bisogna che tutta quest'acqua venga rimossa e questo processo di riavvicinamento e di porre la vescicola pronta all'esocitosi ma senza promuoverne la fusione della membrana prende il nome di priminig. Per questo priming della vescicola sono importanti tre proteine che vengono denite del complesso SNARE, sono molto importanti perch in realt si visto che questo un procedimento generale presente in tutte le cellule nelle quali avviene un'esocitosi di vescicole verso l'esterno. Si visto che queste proteine sono presenti anche nei lieviti e nei batteri e anche

Il complesso SNARE
RAB3 importante quindi per il reindirizzamento, abbiamo poi un certo numero di proteine importanti per l'attracco, abbiamo un altro processo chiamato priming della vescicola. Innanzitutto una volta arrivata al punto giusto sulla zona attiva corrispondente bisogna che vi sia un aggancio della vescicola con la zona attiva e questo avviene attraverso delle proteine. Queste proteine in realt si pensava fossero tre proteine chiamate del complesso SNARE, in realt adesso queste non sembrano importanti per l'attracco perch per l'attracco importante la proteina sinaptotagmina che si incontra a un'altra proteina sulla membrana vescicolare chiamata neurexina e questo complesso ancora la vescicola sulla 140

6.3. I 5 stadi

Figura 6.52: Ciclo di esocitosi

nelle nostre cellule esocrine, in tutti quei sistemi in cui bisogna promuovere l'esocitosi di vescicole verso l'esterno, e quindi anche a livello sinaptico. Queste tre proteine del complesso SNARE sono una legata alla vescicola, la sinaptobrevina che avvolge e forma una specie di zipping con le altre due proteine situate invece sulla membrana presinaptica che sono la sintaxina e la SNAP25, queste tre proteine del complesso SNARE sono una vescicolare e due della membrana presinaptica che si avvolgono e una volta che viene riconosciuto il punto dalla sinaptotagnina creano questo legame molto forte che avvicina le due membrane facendo priming. Se queste tre proteine del complesso SNARE non funzionano e sono alterate l'esocitosi non possibile, la vescicola pu anche arrivare sulla zona attiva ma se non c' l'azione preventiva di questo complesso SNARE quando arriva il calcio l'esocitosi non pu avvenire. Difatti questo uno dei meccanismi di azione di molte tossine, per esempio quella del Clostridium botulinum o del tetani, queste tossine hanno un'azione proteolitica proprio su queste tre proteine a seconda del tipo di tossina su vari punti della proteina. Quando si ha l'azione idrolitica di queste proteine non si pu avere il rilascio della vescicola, la tossina botulinica impedisce il rilascio di neurotrasmettitore della placca neuromuscolare e quindi porta a paralisi muscolare. Queste proteine sono estremamente importanti quindi e oltretutto hanno un signicato patogenetico importante. Il meccanismo attraverso il quale il calcio in grado di attivare la fusione particolare ed entra in gioco la sinaptotagmina, quella proteina gi considerata precedentemente importante per l'ancoraggio e il riconoscimento della vescicola. La sinaptotagmina anche un sensore per il calcio, sulla sua supercie presenta un sito di legame per il calcio. Quando questo legame avviene innesca un processo ancora non chiarissimo per cui intervengono anche i processi del complesso SNARE e la fusione della vescicola avviene in modo completo poich questa gi pronta e le membrane sono praticamente in contatto. Questo processo di fusione in realt sembra avvenire attraverso degli emicanali, dei pori di fusione formati da due emipori, uno situato sulla vescicola sinaptica e l'altro sulla membrana presinaptica. La proteina che svolge questa azione di emicanale da parte vescicolare chiamata sinaptosina. La sequenza quindi prima l'indirizzamento della RAB3 sul sito della zona attiva, poi l'ancoraggio con la sinaptotagmina e neurexina, la formazione del complesso SNARE che fa il priming della vescicola e il calcio agendo come interruttore sulla sinaptotagmina attiva tutte queste proteine a formare il poro di 141

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Le sinapsi

Figura 6.53: Complesso SNARE

Figura 6.54: Ciclo di una vescicola

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6.3. I 5 stadi fusione a livello della sinaptosina. A questo punto l'emiporo di fusione si apre e il neurotrasmettitore esce. Da questo punto di vista interessante osservare che nella stragrande maggioranza dei casi questo anche utile per il tracking vescicolare, quando la sinapsi viene attivata in modo normale o medio non si ha una fusione completa della vescicola con la membrana presinaptica ma si viene a formare soltanto un poro di fusione che si apre e poi dopo poco si richiude, quel piccolo periodo in cui sta aperto suciente anch il neurotrasmettitore ad alta concentrazione all'interno della vescicola possa diondere all'esterno. Non dobbiamo pensare per che la membrana della vescicola si fonda completamente ed entri a far parte della membrana del bottone sinaptico, abbiamo un poro di fusione che si apre per un breve periodo di tempo e si richiude. Per poter avere poi l'allontanamento della vescicola bisogna disancorare il processo SNARE, queste proteine hanno un'altissima anit una con l'altra, quando entrano in contatto si ancorano in modo molto forte. Entra qui in gioco un'altra proteina chiamata MSF, fattore solubile che una ATPasi, attraverso questo processo di disancoraggio delle proteine SNARE richiede consumo energetico, il consumo di una molecola di ATP e l'energia rilasciata serve per disancorare il complesso SNARE. A questo punto la vescicola di nuovo libera pu essere rimessa nel citoplasma. Abbiamo gi quindi due consumi energetici, sia per l'indirizzamento di RAB3 sia per disancorare la vescicola, per ogni vescicola che si mobilita abbiamo il consumo di due molecole ad alto valore energetico. Questo quello che avviene nella maggior parte dei casi. Il meccanismo attraverso il quale il poro di fusione si forma e poi si richiude immediatamente prende il nome di kiss and run, cio di un meccanismo molto rapido attraverso il quale la vescicola si riforma immediatamente vuota e poi viene riempita nel citoplasma e messa di nuovo a disposizione nel pool di riserva. In alcuni casi quando invece l'attivazione del bottone sinaptico massiccia l'esocitosi procede talmente rapidamente che un certo numero di vescicole fondono completamente la loro membrana con la membrana del bottone sinaptico, in questo caso dovranno poi essere recuperate successivamente attraverso meccanismi presenti in tutte le cellule attraverso i quali la membrana viene recuperata attraverso la formazione di strati di clatrina. Questo rivestimento da parte di molecole di clatrina risucchia verso l'interno la membrana della vescicola e attraverso altre proteine speciche taglia la parte di membrana e riporta la vescicola con un processo molto pi lento. La clatrina deve poi essere rimossa e queste vescicole possono rientrare nalmente a far parte del pool di riserva. Questo un processo molto lento che avviene soltanto quando il rilascio di neurotrasmettitore massiccio in condizioni particolari. Ci rimane un ultimo aspetto da vedere per quanto riguarda i meccanismi di rilascio del neurotrasmettitore a livello sinaptico che riguarda gli aspetti dei trasportatori che abbiamo nominato pi volte del neurotrasmettitore. I trasportatori sono presenti sia a livello della membrana del bottone sinaptico con il reuptake del neurotrasmettitore, sia a livello vescicolare. Questi trasportatori hanno ciascuno un nome, ci sono diverse classi e normalmente si aggiunge la lettera T a una sigla che indica il neurotrasmettitore coinvolto dove T sta per transporter, TNEP ad esempio il trasportatore della norepinefrina. Quando invece vogliamo indicare un trasportatore vescicolare che concentra il neurotrasmettitore all'interno della vescicola viene aggiunta una V prima della sigla precedente, ad esempio VNEP. Cerchiamo di capire come funzionano questi trasportatori e andiamo per gradi.

6.3.4 Concentrazione del neurotrasmettitore

Vediamo il meccanismo attraverso il quale il neurotrasmettitore viene concentrato all'interno della vescicola, anche qui i meccanismi generali sono gli stessi per tutte le terminazioni sinaptiche e noi abbiamo un meccanismo attraverso il quale fondamentale che il contenuto della vescicola sinaptica sia acido, che vi sia perci un pH basso, una concentrazione elevata di idrogenioni. Questo perch il trasportatore vescicolare, ne sono stati individuati 4 di diversi tipi ma sono tutti trasportatori attivi secondari che sono fondamentalmente degli antiporti per protoni. All'interno della vescicola avviene uno scambio di H+, il contenuto della vescicola deve essere acido. Il trasportatore primario quindi che rende possibile questo, stiamo concentrando il neurotrasmettitore all'interno della vescicola quindi si rende necessario un trasporto attivo per poterlo fare perch muoviamo il trasportatore contro gradiente di concentrazione, questo gradiente primario che permette questo trasporto secondario ottenuto attraverso una ATPasi di membrana, una pompa protonica cio una pompa che pompa consumando ATP idrogenioni dall'esterno verso l'interno della vescicola e quindi la vescicola diventa pi acida. Difatti se il pH medio della cellula di circa 7,2 all'interno della vescicola il pH intorno a 5-5,5. necessario acidicare la vescicola perch possano funzionare questi trasportatori che sono tutti caratterizzati da 12 domini transmembranari, hanno una struttura molto simile e in realt se ne sono trovati quattro di trasportatori, uno specico per l'ach, uno poco specico per tutte le amine biogene, compresa la serotonina e altre, uno specico per il glutammato e uno che pompa sia GABA che glicina. 143

6.

Le sinapsi

Figura 6.55: Meccanismi di esocitosi

Figura 6.56: Accumulo in vescicola dei neurotrasmettitori

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6.3. I 5 stadi Questo per quanto riguarda l'accumulo di neurotrasmettitore nella vescicola, per quanto riguarda invece il recupero e il reuptake del neurotrasmettitore da parte del bottone sinaptico anche qui abbiamo dei trasportatori specici, anche questi ovviamente sono dei trasportatori attivi secondari e abbiamo alcune categorie di trasportatori. Vi sono una serie di trasportatori che sono tutti della stessa famiglia SLC6, sono una serie di trasportatori che si dierenziano per i diversi neurotrasmettitori detti sodio/cloro dipendenti. Il neurotrasportatore, in questo caso la dopamina, viene portata all'interno del bottone sinaptico sfruttando il gradiente di concentrazione sia del sodio che del cloro, per ogni molecola di neurotrasmettitore che portiamo dentro portiamo dentro anche io ione sodio e uno ione cloro. I trasportatori specici cos riconosciuti sono fondamentalmente cinque, i SERT bersagli di molti farmaci ad azione psicotropa, il trasportatore per l'adrenalina, per la noradrenalina e la serotonina e poi anche il trasportatore specico del GABA o della glicina di cui in realt se ne conoscono quattro tipi (per il GABA) e due tipi (per la glicina). Anche questi trasportatori hanno dodici domini transmembranari ed un puro caso perch questi non hanno nunlla a che vedere con questi trasportatori vescicolari, sono due famiglie completamente distinte. Esiste poi un'altra famiglia in realt che trasporta gli aminoacidi eccitatori che sono fondamentalmente il glutammato e l'aspartato e se ne conoscono almeno cinque tipi diversi, questi sono di un'altra famiglia di un altro gene e hanno un meccanismo leggermente pi complesso e diverso. Sono sempre dipendenti da gradienti di sodio e potassio, il glutammato viene portato dentro la membrana nel bottone assieme a uno ione sodio e scambiato con uno ione potassio. Utilizza quindi due gradienti di concentrazione, uno sodio potassio e uno sodio cloro. Hanno un numero di domini transmembranari diverso. Inne per completezza ricordiamo che il trasportatore per la colina caratterizzante le sinapsi colinergiche che presentano una acetilcolinesterasi nello spazio sinaptico che idrolizza ach in colina pi acetato (ed la sola colina che viene recuperata mentre l'acetato si perde), questo trasportatore per la colina una famiglia diversa che utilizza soltanto il gradiente di concentrazione del sodio e sembra essere la stessa dei trasportatori GLUT che trasportano il glucosio tramite trasporto facilitato nelle cellule, alcuni controllati dall'insulina e altri no.

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6.

Le sinapsi

Figura 6.57: Riciclo dei neurotrasmettitori

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Elenco delle figure

1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 1.9 1.10 1.11 1.12 1.14 1.13 1.15 1.16 2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 3.10 3.11 3.13 3.12 3.14 3.16 3.15 3.17 4.1 4.2 4.3 4.4 4.5 4.7 4.6 4.8 4.9 4.10 4.11 4.12

Scambio di liquidi a livello tissutale . Azione del sistema cardiovascolare . Principio di diluizione . . . . . . . . LIC e LEC . . . . . . . . . . . . . . LIC e LEC . . . . . . . . . . . . . . Concentrazione ionica cellulare . . . Il concetto di bilancio . . . . . . . . Feedback negativo . . . . . . . . . . Errore nel feedback negativo . . . . Errore nel feedback del sodio . . . . Feedback positivo . . . . . . . . . . . Feedforward . . . . . . . . . . . . . . Comunicazione cellulare . . . . . . . Vie di controllo omeostatiche . . . . La risposta dipende dal recettore . . Azioni del sistema nervoso . . . . . .

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8 8 10 10 11 11 12 13 13 14 15 15 16 17 18 18 21 22 23 23 25 28 29 29 30 31 31 33 34 34 35 36 37 38 39 39 40 41 44 45 46 48 48 49 50 51 52 54 54 55

La diusione semplice . . . . . . . . . Velocit di diusione . . . . . . . . . . Diusione attraverso le membrane . . Graco del coeciente di ripartizione Struttura della gramidicina . . . . . . Esempi di canali ionici . . . Selettivit dei canali ionici . Meccanismo di selettivit . Meccanismo di selettivit 2 Gating dei canali ionici . . Recettori e agonisti . . . . . Refrattariet . . . . . . . . Patch-clamp . . . . . . . . . Struttura dei canali ionici . Canali di tipo chimico . . . Connessoni e altri canali . . Canali per il potassio . . . . Canali voltaggio-dipendenti Struttura ACQ1 . . . . . . Graco della saturazione . . GLUT . . . . . . . . . . . . Trasporto del glucosio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Esistenza del potenziale . . . . . . . . . . Esempio di riesso semplice . . . . . . . . Neurone aerente sensoriale . . . . . . . . Trasmissione dei segnali nelle varie cellule Situazione ionica cellulare . . . . . . . . . Situazione sperimentale . . . . . . . . . . Misurazione della permeabilit al potassio Graco . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Permeabilit sodio-potassio . . . . . . . . Potenziali e ussi . . . . . . . . . . . . . . Pompa sodio-potassio . . . . . . . . . . . Equazione di Goldman . . . . . . . . . . .

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Elenco delle figure

4.13 4.14 4.15 4.17 4.16 4.18 4.19 4.20 4.21 4.22 4.23 4.24 4.25 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.12 5.11 5.13 5.14 5.15 5.16 5.19 5.17 5.18 5.20 5.21 5.22 5.23 5.24 5.25 6.1 6.2 6.3 6.4 6.5 6.6 6.7 6.8 6.9 6.10 6.11 6.12 6.13 6.14 6.15 6.16 6.17 6.18 6.19 148

Cambiamento di potenziale e depolarizzazione . Trasportatori del cloro . . . . . . . . . . . . . . Modello elettrico della membrana . . . . . . . . Canali del cloro in adulto e bambino . . . . . . Circuito elettrico . . . . . . . . . . . . . . . . . Propagazione lungo la bra . . . . . . . . . . . Circuito equivalente semplicato . . . . . . . . Membrana come condensatore . . . . . . . . . . Sommazione temporale . . . . . . . . . . . . . . Dispersione dell'impulso . . . . . . . . . . . . . Dispersione lungo i nodi . . . . . . . . . . . . . Potenziale e distanza . . . . . . . . . . . . . . . Integrazione neuronale . . . . . . . . . . . . . .

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Potenziali e soglia . . . . . . . . . . . . . . . . . . Curva del potenziale . . . . . . . . . . . . . . . . . Potenziali nelle varie cellule muscolari . . . . . . . Curva di stimolazione di un neurone . . . . . . . . Accomodazione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Refrattariet . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Stimolazione mantenuta in soglia . . . . . . . . . . Da ampiezza a frequenza . . . . . . . . . . . . . . Potenziali e conduttanze . . . . . . . . . . . . . . . Struttura dei canali voltaggio-dipendenti . . . . . . Ciclo di Hodgkin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Azione dei canali del sodio . . . . . . . . . . . . . . Potenziale di soglia . . . . . . . . . . . . . . . . . . Voltage clamp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Graco delle conduttanze . . . . . . . . . . . . . . Patch clamp a un singolo canale . . . . . . . . . . Patch clamp in vivo . . . . . . . . . . . . . . . . . Struttura del canale potassio . . . . . . . . . . . . Apertura probabilistica dei canali . . . . . . . . . . Propagazione del potenziale . . . . . . . . . . . . . Propagazione del potenziale 2 . . . . . . . . . . . . Velocit in rapporto alla membrana come circuito Potenziali a livello del cuore . . . . . . . . . . . . . Velocit di conduzione e mielina . . . . . . . . . . Nodi di Ranvier . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tipica sinapsi . . . . . . . . . . . . . . . Sinapsi elettriche e chimiche . . . . . . . Gap junction . . . . . . . . . . . . . . . Bidirezionalit . . . . . . . . . . . . . . Assenza di ritardo sinaptico . . . . . . . Sinapsi chimiche . . . . . . . . . . . . . I due tipi di vescicole . . . . . . . . . . . Potenziale eccitatorio . . . . . . . . . . Meccanismo sinaptico . . . . . . . . . . Regolazione diretta e indiretta . . . . . Esempi di canali . . . . . . . . . . . . . Struttura di una placca neuromuscolare Autoradiograa con bungarotossina . . Canali per ACH . . . . . . . . . . . . . Sito di legame per ACH . . . . . . . . . Canali e rapsina . . . . . . . . . . . . . L'azione del curaro . . . . . . . . . . . . Potenziale di inversione . . . . . . . . . Applicazione del patch clamp . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

Elenco delle gure 6.21 6.20 6.22 6.23 6.24 6.25 6.26 6.28 6.29 6.30 6.31 6.27 6.32 6.33 6.34 6.35 6.36 6.37 6.38 6.39 6.40 6.42 6.41 6.43 6.44 6.45 6.46 6.47 6.48 6.49 6.50 6.51 6.52 6.53 6.54 6.55 6.56 6.57 Canali nicotinici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Potenziale di placca e potenziale d'azione . . . . . . . . . . . Agonisti e antagonisti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Recupero dell'acetilcolina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Canali ionotropici . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Reuptake del glutammato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vari recettori del glutammato . . . . . . . . . . . . . . . . . . Selettivit dei canali . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Voltaggio dipendenza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Meccanismo del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Plasticit sinaptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Potenziali di inversione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sinapsi inibitoria . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Potenziale di inversione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sinapsi eccitatoria e inibitoria attivate contemporaneamente . Inibizione sul soma . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Sinapsi con amine biogene . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Recettori metabotropici e ionotropici . . . . . . . . . . . . . . G coupled receptors . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Trasduzione del segnale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Vie di trasduzione . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Regolazione della trascrizione . . . . . . . . . . . . . . . . . . Attivazione diretta di proteine G . . . . . . . . . . . . . . . . Secondi messaggeri gassosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Importanza del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ritardo sinaptico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Rilascio del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Potenziale in miniatura e potenziale totale . . . . . . . . . . . Aumento intracellulare del calcio . . . . . . . . . . . . . . . . Criofrattura di membrana . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mobilizzazione delle vescicole dal pool . . . . . . . . . . . . . Struttura tipo di una vescicola . . . . . . . . . . . . . . . . . Ciclo di esocitosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Complesso SNARE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Ciclo di una vescicola . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Meccanismi di esocitosi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Accumulo in vescicola dei neurotrasmettitori . . . . . . . . . Riciclo dei neurotrasmettitori . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110 111 112 112 114 115 116 117 117 118 119 120 121 122 123 124 126 127 128 128 129 130 131 131 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 142 144 144 146

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Elenco delle tabelle

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