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Corso di Malattie del Sangue e degli Organi Emolinfopoietici

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Corso di Malattie del Sangue e degli Organi Emolinfopoietici

Lunghezza:
1,271 pagine
13 ore
Pubblicato:
Sep 4, 2020
ISBN:
9788835888703
Formato:
Libro

Descrizione

Questa nuova edizione del Corso di Malattie del Sangue e degli Organi Emolinfopoietici incorpora tutti gli aggiornamenti dell'ultima revisione della classificazione delle neoplasie del tessuto emopoietico e linfoide edita dall'Organizzazione Mondiale della Sanità. Inoltre, presenta in modo completo le più recenti acquisizioni biologiche e terapeutiche nell'ambito delle patologie dell'eritropoiesi, della piastrinopoiesi e della coagulazione del sangue, con particolare enfasi sia su molecole recentemente approvate, sia su farmaci in sperimentazione.
Sono passati 5 anni dalla stesura dell’ultima edizione di questo Manuale e a giudicare dalla mole di nuove acquisizioni di biologia, prognosi e terapia delle malattie del sangue sembra che sia passato un secolo. Le nuove conoscenze, nella maggior parte dei casi, hanno un impiego clinico che ha modificato il decorso di molte emopatie, la “qualità” della vita durante la terapia, la sopravvivenza e la percentuale di guarigioni. Lo studente di medicina deve sapere che, oggi, la maggior parte dei pazienti, compresi quelli a peggiore prognosi, possono essere curati ambulatorialmente con grandi vantaggi per la qualità della loro vita. Tutto questo è il frutto d’importanti acquisizioni di biologia molecolare, cellulare e di farmacologia che hanno portato alla sintesi di nuovi farmaci che vengono messi sul mercato con incredibile frequenza e mirati a distruggere le cellule patologiche risparmiando quelle sane. Sono farmaci ben tollerati e molto spesso somministrati per via orale.

La marcia verso la guarigione di tutte le malattie tumorali del sangue è "inarrestabile".
Sante Tura
Pubblicato:
Sep 4, 2020
ISBN:
9788835888703
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Tura

Capitolo 1

L’EMOPOIESI E LA CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA

Anna Rita FRANCO MIGLIACCIO¹

Valentina SALVESTRINI²

1 EMOPOIESI

1.1. INTRODUZIONE

Il sangue è un tessuto connettivo fluido che collega tutti gli organi del corpo trasportando ossigeno, sostanze nutritive, ormoni e rimuovendo tossine. Costituisce circa l’8% del peso corporeo e ha un volume diverso a seconda dell’età, del sesso e del peso dell’individuo. È composto da una parte fluida, il plasma, e da elementi figurati, ossia le cellule mature (globuli rossi, piastrine, granulociti, monociti e linfociti). Gli elementi figurati del sangue hanno in genere una vita limitata e attraverso un complesso sistema di regolazione dell’omeostasi cellulare devono essere costantemente reintegrati. Questo processo di regolazione è responsabile dell’enorme produzione cellulare che avviene ogni giorno nel nostro organismo; per fare un esempio consideriamo la produzione giornaliera di globuli rossi, le cellule responsabili del trasporto di ossigeno, e di neutrofili, le cellule deputate alla difesa dell’organismo contro le infezioni batteriche. Un individuo adulto ha in media un volume ematico di cinque litri, contenente circa 25 × 10¹² globuli rossi con un ciclo vitale di 120 giorni. Affinché il loro numero rimanga costante, il 50% di essi (12,5 × 10¹² cellule) deve essere sostituito ogni 120 giorni, ciò significa che il nostro organismo deve produrre circa 1 × 10¹¹ nuovi globuli rossi ogni giorno. I neutrofili, invece, hanno una vita media di 6 ore e per mantenere costante il loro numero di 25 × 10⁹, il nostro corpo deve produrre 12,5 × 10⁹ nuovi neutrofili ogni 6 ore, ossia 6,2 × 10¹⁰ al giorno.

L’insieme dei processi che regolano il mantenimento del numero fisiologico di cellule circolanti del sangue in condizioni di omeostasi e intervengono come compenso in caso di un aumento della richiesta da parte dell’organismo si chiama emopoiesi. L’emopoiesi, dalle parole greche αίμα «sangue» e ποιὲω creare , è un processo che si svolge principalmente nel midollo osseo e dà origine a tutte le cellule mature presenti nella sangue a partire da una cellula staminale emopoietica (hematopoietic stem cells, HSC).

Tale definizione è il frutto di una lunga discussione nel corso degli anni tra i sostenitori delle ipotesi deterministica e stocastica dell’emopoiesi. La prima ipotesi sostiene il ruolo chiave di fattori solubili, come le citochine, nella scelta del percorso differenziativo della HSC; la seconda ipotesi prevede che siano i fattori trascrizionali intrinseci della HSC a determinare la scelta di una precisa linea maturativa, in seguito ad oscillazioni casuali. Nonostante la teoria stocastica abbia rimpiazzato la teoria umorale entrambe le teorie hanno portato importanti contributi in campo ematologico. Primo fra tutti la scoperta di fattori di crescita emopoietici, come l’eritropoietina (EPO) e il fattore stimolante colonie granulocitarie (G-CSF, granulocyte-colony simulating factor, o CSF-3), ad oggi prodotti in larga scala con la tecnica del DNA ricombinante e utilizzati nella pratica clinica per stimolare la produzione di cellule differenziate, ma anche alla scoperta delle HSC e dei progenitori emopoietici (hematopoietic progenitor cells, HPC), nonché allo sviluppo di strategie terapeutiche mirate al ripopolamento midollare in seguito ad esposizione a radiazioni ionizzanti o farmaci chemioterapici (trapianto allogenico di midollo osseo).

Figura 1.1 Albero differenziativo delle cellule emopoietiche.

L’emopoiesi si può dividere in mielopoiesi e linfopoiesi ed è strettamente regolata non solo da fattori solubili ma anche da fattori stromali prodotti dal microambiente (Figura 1.1 e Tabella 1.1). La mielopoiesi comprende l’eritropoiesi (generazione di globuli rossi), la megacariocitopoiesi (produzione di piastrine), la granulo-monocitopoiesi (generazione di granulociti e monociti) e si verifica principalmente nel midollo osseo. La linfopoiesi dà origine a cellule B e cellule T e si verifica rispettivamente nel sistema midollo osseo/milza/linfonodi e nel timo.

Tabella 1.1 Principali fattori di crescita e di inibizione coinvolti nell’emopoiesi.

Figura 1.2 Modificazioni genomiche, epigenomiche e funzionali che avvengono nei vari compartimenti staminali durante le fasi di commissionamento e maturazione terminale.

Il processo emopoietico assume una struttura piramidale al vertice della quale si trova una ristretta popolazione di cellule primitive, con caratteristiche di auto-rinnovamento e multipotenzialità, da cui si dipartono compartimenti sequenziali all’interno della gerarchia emopoietica. Tali compartimenti si caratterizzano per la progressiva perdita di potenziale autoreplicativo, accompagnata da un aumento consensuale della specificità differenziativa attraverso un processo che viene definito commissionamento (Figura 1.2).

Grazie allo sviluppo di modelli knock-out/-in specifici, negli ultimi anni sono stati compiuti molti progressi nella comprensione del processo di commissionamento, mentre rimangono ancora da chiarire numerosi dettagli sul processo di maturazione terminale.

1.2. ANATOMIA E FISIOLOGIA DEL MIDOLLO OSSEO

Dopo la nascita e per tutta la vita adulta, la sede elettiva dell’emopoiesi è il midollo osseo, un tessuto specializzato presente nelle cavità delle ossa. Nei bambini l’emopoiesi si verifica nella cavità delle ossa lunghe (femore e tibia), mentre negli adulti si verifica principalmente nelle ossa trabecolari (vertebre, scapole, costole, sterno, bacino, cranio ed epifisi delle ossa lunghe). In condizioni fisiologiche, le cellule emopoietiche occupano circa il 25% dello spazio all’interno della cavità ossea (midollo rosso), mentre il restante 75% è occupato dal tessuto adiposo (midollo giallo). Tuttavia, se stimolato a produrre cellule emopoietiche mature, il midollo rosso può espandersi. Ciò si verifica in condizioni di stress acuto e cronico, dovuto ad esempio a sanguinamento massivo, stimolazione con fattori di crescita esogeni o stato anemico, e consente di aumentare la produzione di cellule ematopoietiche fino a 5-8 volte i livelli normali.

Il midollo osseo ha una consistenza gelatinosa e le sue regioni rosse sono costituite non solo da cellule emopoietiche ma anche da un complesso sistema di cellule di origine mesenchimale (cellule staminali mesenchimali e fibroblasti), da cellule endoteliali vascolari e cellule del sistema nervoso che, insieme alla matrice extracellulare (fibronectina, collagene, glicoproteine di adesione e proteoglicani) costituiscono il cosiddetto microambiente midollare (Figura 1.3). Il microambiente ha una funzione sia di supporto meccanico sia di regolazione di tutto il processo emopoietico. Il midollo rosso si trova prevalentemente collocato in prossimità dell’endostio, a stretto contatto con gli osteoblasti. Le cellule emopoietiche presenti al suo interno si distribuiscono nel microambiente midollare in base al gradiente differenziativo: le HSC localizzano prevalentemente nei pressi dell’endostio mentre le HPC, più differenziate, si distribuiscono in prossimità dell’endotelio vascolare.

Durante tutta la vita dell’individuo, si osservano fenomeni di migrazione delle cellule staminali dal microambiente midollare verso la circolazione periferica e viceversa. Il primo fenomeno viene definito mobilizzazione, il secondo è detto homing; entrambi i fenomeni sono processi complementari in quanto le interazioni che devono essere distrutte per consentire il rilascio dei progenitori dal midollo sono le stesse che è necessario ristabilire per permettere loro di abbandonare la circolazione e ritornare nel microambiente midollare. Le principali interazioni che regolano l’homing e la mobilizzazione sono: 1) il legame tra integrine e matrice: le integrine VLA-4 e VLA-5, espresse dalle staminali, legano la fibronectina espressa dalla matrice e VCAM-1, espressa dalle cellule endoteliali e stromali; 2) il legame tra il recettore CD44, espresso dalle cellule staminali, e l’acido ialuronico, uno dei principali componenti della matrice, o la selectina-E; 3) l’interazione tra il recettore CXCR4 (C-X-C chemokine receptor type 4), espresso dai progenitori emopoietici, e il fattore CXCL12 (C-X-C chemokine ligand 12, o SDF-1), prodotto dalle cellule stromali. Tali interazioni promuovono la ritenzione delle cellule staminali a livello midollare. Affinché avvenga la mobilizzazione in circolo, tali interazioni devono essere distrutte e ciò avviene prevalentemente ad opera di enzimi ad attività proteolitica. Un esempio è rappresentato dalla secrezione di proteasi (ad esempio, MMP- 9) da parte dei neutrofili a livello midollare. Tale secrezione sembra essere uno dei principali meccanismi alla base dell’azione mobilizzante del fattore di crescita G-CSF, utilizzato in clinica per la mobilizzazione di cellule staminali emopoietiche per il trapianto autologo o allogenico.

Figura 1.3 Rappresentazione schematica delle componenti cellulari che costituiscono il microambiente emopoietico. Le HSC quiescenti si trovano in prossimità della nicchia endostale a stretto contatto con osteoblasti e MSC Nestin+, i quali forniscono fattori che promuovono la ritenzione nel midollo e la quiescenza (CXCL12, SCF, Ang-1, VCAM-1 e TPO). Le cellule HSC attivate e i progenitori localizzano prevalentemente nella nicchia perivascolare, che include cellule CAR e cellule endoteliali sinusoidali, ricca di fattori promuoventi il self-renewal delle cellule HSC attivate (SCF/c-kit, ligandi Notch…). Fanno parte del microambiente anche adipociti, coinvolti nella regolazione del numero di HSC, macrofagi, megacariociti e cellule nervose.

L’architettura tridimensionale del microambiente midollare è molto complessa e supporta l’emopoiesi in molti modi. Da un lato, il microambiente midollare fornisce supporto meccanico alle cellule emopoietiche attraverso un complesso sistema di molecole di adesione che ancorano i precursori alla matrice e alle cellule stromali (ad esempio, i precursori eritroidi sono associati alla fibronectina e la maturazione a reticolociti ne comporta il distacco, mentre i precursori granulopoietici sono legati all’emonectina). Dall’altro lato, il microambiente produce e rilascia fattori umorali che influenzano il differenziamento e la proliferazione cellulare durante tutta l’emopoiesi, e fornisce una compartimentalizzazione di tali fattori in zone specifiche del microambiente stesso.

I processi che regolano la produzione di cellule ematiche mature all’interno del microambiente sono:

Proliferazione simmetrica. È la divisione di una cellula madre in due cellule figlie con proprietà simili alla cellula di origine. Questa divisione non è associata a modificazioni né epigenetiche né morfologiche. In condizioni fisiologiche, la cellula staminale pluripotente utilizza questo meccanismo per l’auto-mantenimento o self-renewal, ossia per mantenere costante il proprio numero per tutta la vita. Tuttavia, in particolari condizioni di stress, anche i progenitori HPC possono andare incontro a divisione simmetrica al fine di generare un maggior numero di cellule mature in minor tempo.

Proliferazione asimmetrica. È la divisione di una cellula in due cellule figlie con proprietà funzionali leggermente diverse dalla cellula di origine. Questa divisione si verifica quando la HSC inizia il processo di commissionamento, genera il primo progenitore multipotente e continua con la generazione di progenitori e precursori con un lineage differenziativo più ristretto.

Differenziamento. È il processo attraverso cui la HSC genera precursori maturi. Questo processo comprende il commissionamento, durante il quale vengono impresse le informazioni genetiche relative a ciascun lineage differenziativo, e la maturazione terminale, durante la quale le cellule sono sottoposte a rimodellamento morfologico (Figura 1.2).

Commissionamento. Questo processo inizia a livello delle HSC, genera una serie di progenitori HPC progressivamente più limitati nel loro potenziale differenziativo e non comporta cambiamenti nella morfologia cellulare (Figura 1.1). Durante la fase di commissionamento, i progenitori HPC vanno incontro ad una serie di modificazioni epigenetiche (metilazione e acetilazione del DNA, attivazione dell’espressione dei fattori di trascrizione lineage-specifici) che inducono l’espressione di geni specifici di ciascun lineage (Figura 1.2). Tali modificazioni rendono accessibili regioni specifiche del DNA, definiti siti di ipersensibilità o enhancer, che rendono i promotori dei geni specifici per i lineage differenziativi disponibili per essere trascritti in mRNA dalla DNA polimerasi. Tali modificazioni epigenetiche sono generalmente irreversibili, tuttavia esiste una certa plasticità: pertanto, cellule in una fase precoce di commissionamento possono modificare il loro lineage differenziativo in risposta a determinati stimoli (come ad esempio il passaggio dal lineage megacariocitario a quello eritroide in caso di anemia). Il processo di commissionamento termina con la generazione di precursori morfologicamente riconoscibili, in quanto esprimenti alcune caratteristiche peculiari delle cellule mature finali.

Maturazione terminale. Questo processo inizia dalla formazione del primo precursore lineage-specifico e genera elementi con morfologia progressivamente più simile a quelli delle cellule ematiche mature (Figura 1.2). Durante questo processo, le cellule trascrivono gli mRNA per geni specifici di ciascun lineage e li traducono in proteine. In questa fase, le cellule subiscono modificazioni strutturali che consentono loro di acquisire una morfologia tipica della cellula funzionalmente differenziata. La regolazione dell’espressione genica in questa fase è principalmente post-trascrizionale e post-traslazionale. La maturazione terminale è associata alla riorganizzazione della membrana plasmatica e del citoplasma. Esempi di rimodellamento cellulare sono: l’estrusione del nucleo per produrre reticolociti anucleati durante l’eritropoiesi, la riorganizzazione del reticolo endoplasmatico in speciali strutture endosomiali, come i granuli delle piastrine e dei granulociti, ma anche la riduzione del numero di organelli citoplasmatici (mitocondri e ribosomi) attraverso processi di autofagia/mitofagia.

Amplificazione. L’amplificazione definisce il numero di cellule mature che sono generate da un singolo progenitore HPC. In condizioni basali, questo numero è geneticamente controllato ma in condizioni di stress può aumentare o diminuire. La regolazione dei livelli di amplificazione è garantita da una sorta di contatore intrinseco al progenitore HPC che è in grado di misurare il numero di divisioni subite e di attivare il processo di maturazione terminale una volta raggiunto il numero massimo di divisioni previste. Inizialmente era stato ipotizzato che questo contatore interno fosse rappresentato dalla lunghezza dei telomeri cromosomici che, diminuendo durante le varie divisioni mitotiche in quanto solo parzialmente duplicati dalla telomerasi, agirebbe da fattore limitante. Tale ipotesi è decaduta, in quanto poco coerente con l’osservazione che la lunghezza dei telomeri dei precursori HPC è in realtà solo lievemente ridotta con l’aumentare dell’età e quindi del numero di processi mitotici subiti. Più recentemente, è stato ipotizzato che, almeno nella linea differenziativa eritroide, la regolazione dei processi di amplificazione sia legata al bilanciamento dei livelli dei fattori di trascrizione GATA1 e GATA2 (fattori di trascrizione che si legano alla sequenza del DNA GATA). GATA2 è espresso nelle HSC e nei progenitori HPC più indifferenziati e controlla l’espressione di geni che codificano per le proteine coinvolte nella regolazione del ciclo cellulare. Con l’aumentare del numero cicli cellulari ai quali va incontro il progenitore HPC, l’espressione di GATA2 diminuisce e le cellule smettono di dividersi. Al contrario, GATA1 è espresso a livelli molto bassi nelle HSC e la sua espressione aumenta ad ogni divisione cellulare. Livelli sufficientemente elevati di GATA1 riducono l’espressione di GATA2, bloccando la proliferazione, e inducono l’espressione di geni che codificano per proteine necessarie per la maturazione.

1.3. LA CELLULA STAMINALE EMOPOIETICA

Il costante processo di rinnovamento cellulare assicurato giornalmente dall’emopoiesi si fonda sulla presenza di una ristretta popolazione di cellule staminali adulte, chiamate cellule staminali emopoietiche. Le HSC sono una popolazione molto rara; si calcola che nell’uomo non rappresentino più dello 0,005-0,01% di tutta la popolazione midollare e che nel midollo di un topo adulto ce ne siano non più di qualche centinaio.

Queste cellule sono gli unici elementi del sistema emopoietico che possiedono due proprietà fondamentali:

capacità di self-renewal o auto-rinnovamento, ossia la capacità di andare incontro a divisione asimmetrica e generare due cellule figlie con potenziale di staminalità intatto. Questa proprietà è cruciale per il mantenimento di un reservoir di cellule staminali in grado di sostenere il processo emopoietico per tutta la durata della vita di un individuo. In condizioni basali, le cellule staminali si trovano in uno stato quiescente, durante il quale vanno incontro a continui processi di riparazione del DNA al fine di limitare l’accumulo di lesioni genetiche (Figura 1.2). Quando si trovano in fase G0 del ciclo cellulare, le HSC mostrano una ridotta capacità metabolica associata ad un diminuito contenuto di mitocondri. In seguito a stimolazione, possono attivarsi, uscire dalla fase G0 del ciclo cellulare e contribuire all’emopoiesi. Perciò, in assenza della capacità di self-renewal, le continue stimolazioni alle quali è sottoposto un individuo durante tutta la sua vita potrebbero portare al loro esaurimento;

la pluripotenzialità, ovvero la capacità di dare origine a tutte le cellule terminalmente differenziate del sangue. Grazie a questa proprietà, ogni singola cellula staminale emopoietica è in grado di generare tutte le filiere differenziative appartenenti sia alla mielopoiesi sia alla linfopoiesi, come osservato in topi trapiantati con una singola HSC.

Queste due proprietà assicurano che: 1) l’omeostasi emopoietica sia mantenuta, grazie ad una continua sostituzione degli elementi danneggiati o senescenti; 2) le HSC, se trapiantate, siano in grado di rigenerare il sistema emopoietico a lungo termine per tutta la durata della vita del ricevente.

La popolazione di cellule staminali non è una popolazione omogenea. A causa delle modificazioni epigenetiche che avvengono nelle prime fasi dello sviluppo, la più famosa delle quali è la lyonizzazione del cromosoma X, il compartimento delle HSC adulte è in realtà composto da un pool eterogeneo di cloni che differiscono in minima parte. Può accadere che cloni di HSC apparentemente identici dal punto di vista genetico mostrino, ad esempio, capacità proliferative o di riparazione del danno diverse. Inoltre, sebbene l’emopoiesi adulta sia globalmente policlonale, non tutte le HSC contribuiscono contemporaneamente a tale processo e alcune di loro possono rimanere in fase G0 per tutta la vita di un individuo attivandosi, ad esempio, solo in caso di trapianto. Tale processo è denominato successione clonale. Una conseguenza della successione clonale è che, con l’età, soltanto alcuni cloni di HSC vengono selezionati, diventando così la popolazione predominante in un processo di restrizione progressiva del pool di staminali. La restrizione clonale, oltre ad essere responsabile dello sbilanciamento dell’emopoiesi in senso mieloide osservata nell’anziano, è probabile che porti alla selezione di cloni che, riducendo la loro capacità di riparare danni al DNA, sono più proni ad accumulare lesioni genetiche maligne. Tale processo potrebbe giustificare la maggior incidenza di leucemie in età avanzata.

1.4. CARATTERISTICHE MORFOLOGICHE E FUNZIONALI DEL COMPARTIMENTO STAMINALE EMOPOIETICO

Il compartimento staminale ha un’organizzazione di tipo gerarchico con al vertice le cellule staminali emopoietiche più indifferenziate, rappresentate da cellule pluripotenti in grado di dare origine a tutti gli elementi maturi del sangue. Dalla proliferazione di queste cellule prendono origine le cellule staminali multipotenti, che possono differenziare o per la mielopoiesi o per la linfopoiesi e dalle quali, per ulteriore restrizione differenziativa, derivano i progenitori commissionati, specifici per la produzione di cellule ristrette ad una singola linea differenziativa (eritroblasti, megacariociti, mieloblasti, monociti e linfoblasti) (Figura 1.1).

L’attività proliferativa delle cellule staminali è inversamente proporzionale al loro livello differenziativo: ne deriva che la gran parte delle cellule staminali pluripotenti si trova in fase G0 del ciclo cellulare, mentre una rilevante percentuale di progenitori commissionati risulta in fase attiva di sintesi di DNA (Figura 1.2).

Sia le cellule staminali sia i progenitori commissionati non sono morfologicamente riconoscibili al microscopio, ma possono essere identificati mediante metodi di analisi che valutano le loro proprietà funzionali e fenotipiche.

Caratterizzazione funzionale

I test funzionali si basano sulla valutazione della capacità proliferativa e differenziativa e sono rappresentati dai saggi di ripopolamento in vivo o saggi clonogenici in vitro.

I saggi di ripopolamento si effettuano mediante trapianto di una popolazione cellulare derivante da un topo donatore in un topo ricevente, al quale è stata distrutta l’emopoiesi endogena mediante esposizione a radiazioni ionizzanti o farmaci chemioterapici. Questo tipo di saggio mira a valutare se la popolazione cellulare trapiantata è in grado di ricostituire l’emopoiesi dell’ospite e riflette la capacità di auto-mantenimento della cellula staminale.

I saggi clonogenici in vitro possono essere a breve o a lungo termine e valutano i vari sottogruppi di staminali in base al tipo di progenie che ciascuno di loro è in grado di generare in presenza di una combinazione nota di citochine. Le colture sono eseguite in terreno semisolido (ad esempio, metilcellulosa o agar); poiché le cellule generate da un singolo progenitore HPC crescono a stretto contatto l’una con l’altra formando colonie, il numero di queste corrisponde al numero dei progenitori presenti nella popolazione cellulare analizzata. Nelle colture a lungo termine (LTC-IC, long term culture-initiating cell), i saggi clonogenici sono preceduti da alcune settimane in cui le cellule midollari sono tenute in coltura in presenza di uno stroma aderente; tali saggi a lungo termine permettono la quantificazione dei progenitori emopoietici primitivi.

Figura 1.4 Esempi di saggi clonogenici in vitro. A) BFU-E, colonia eritroide caratterizzata da una forma compatta con confini ben definiti e da un’intensa colorazione rossa; B) CFU-GM, colonia di granulociti-macrofagi caratterizzata da cellule disperse e traslucide; C) CFU-GEMM, colonia multilineage composta da nuclei centrali compatti e ben definiti associati a cellule traslucide disperse nelle zone più distali della colonia.

In base al tipo di precursori generati, i progenitori HPC si possono dividere in multi-lineage, se generano colonie contenenti cellule di più lineage differenziativi, e lineage-restricted, se generano colonie contenenti cellule di un solo lineage differenziativo. Secondo questi criteri di coltura, i progenitori HPC sono definiti come unità formanti colonie (CFU) seguite da un acronimo che specifica il potenziale differenziativo, ossia il lineage della progenie che hanno generato (Figura 1.4 e Tabella 1.2). Le CFU vengono quindi definite multi-lineage (o CFU-GEMM) se le loro colonie contengono granulociti, eritroblasti, megacariociti e monociti, bi-lineage se le loro colonie contengono eritroblasti e megacariociti (CFU-EM) o granulociti e monociti (CFU-GM) e uni-lineage se contengono solo megacariociti (CFU-Meg), granulociti (CFU-G) o monociti (CFU-M). Un’eccezione è rappresentata dai progenitori eritroidi che sono divisi in precoci (BFU-E) e tardivi (CFU-E). Si distinguono, inoltre, HPC che danno origine a colonie contenenti eosinofili (CFU-Eos), cellule dendritiche (CFU-DC) o cellule basofile (CFU-Bas).

Tabella 1.2 Nomenclatura dei vari compartimenti staminali emopoietici e fattori di crescita che ne regolano le funzioni. In grassetto sono indicati i fattori indispensabili per la crescita in vitro e in vivo.

Caratterizzazione fenotipica

Oltre alle proprietà funzionali sopradescritte, le cellule staminali e i progenitori emopoietici si caratterizzano per specifiche caratteristiche immunofenotipiche. Il fatto che il microambiente emopoietico sia organizzato in compartimenti e che le cellule staminali emopoietiche e i progenitori rispondano a differenti combinazioni di fattori di crescita ha portato ad ipotizzare che, anche se morfologicamente simili, HSC e HPC abbiano un diverso profilo antigenico (molecole di adesione, recettori per fattori di crescita) utilizzabile per l’identificazione e l’isolamento.

L’utilizzo di anticorpi monoclonali in grado di evidenziare la presenza o assenza di particolari antigeni cellulari e l’impiego di tecniche di citofluorimetria a flusso hanno consentito di identificare, a partire dall’intera popolazione midollare, differenti classi di cellule staminali e di progenitori emopoietici commissionati, dotati di differenti caratteristiche immunofenotipiche di membrana (Figura 1.5).

Figura 1.5 Profilo antigenico dei compartimenti staminali emopoietici nel topo (A) e nell’uomo (B), classificati secondo la caratterizzazione funzionale in vivo.

Combinando le proprietà funzionali con le caratteristiche immunofenotipiche, nel topo è possibile distinguere tre sottopopolazioni di HSC: le long-term HSC (LT-HSC), le short-term HSC (ST-HSC), e le HSC multipotenti (MPP). Se trapiantate, le LT-HSC contribuiscono all’emopoiesi dell’ospite dopo alcuni mesi e sono in grado di dare origine a tutte le cellule del sangue per tutta la vita dell’animale. Le ST-HSC, e ancor di più le MPP, contribuiscono all’emopoiesi dell’ospite nelle prime settimane ma poi vanno incontro ad esaurimento.

Sono inoltre state identificate diverse sottopopolazioni di progenitori HPC: i progenitori mieloidi comuni (CMP, che corrispondono alle CFU-GEMM); i progenitori eritroidi/megacariocitari (MEP, che corrispondono alle CFU-ME); i progenitori granulocitari/macrofagici (GMP, che corrispondono alle CFU-GM) e i progenitori linfoidi comuni (CLP) (Figura 1.5).

Nell’uomo, il primo importante marcatore fenotipico identificato come peculiare della popolazione di HSC e HPC è l’antigene CD34. L’antigene CD34 è una glicoproteina transmembrana espressa dall’1-3% delle cellule del midollo osseo, dallo 0,01-0,1% delle cellule mononucleate del sangue periferico e dallo 0,1-0,4% delle cellule del cordone ombelicale. Nonostante l’enorme rilievo che tale antigene ha assunto nella biologia delle cellule staminali, la sua caratterizzazione funzionale è ancora dibattuta, anche a causa dell’assenza di proteine, con funzione nota, omologhe al CD34. L’ipotesi attualmente più accreditata è che questa glicoproteina intervenga nella modulazione dei processi di adesione ed homing midollare delle cellule staminali. La generazione di anticorpi monoclonali diretti contro l’antigene CD34 ha aperto la strada non soltanto all’identificazione immunofenotipica dei progenitori emopoietici, ma anche alla definizione di sistemi di separazione immuno-mediata di questa rara frazione cellulare, entrambi utili in ambito diagnostico ma anche per finalità terapeutiche di tipo trapiantologico.

Le cellule CD34+costituiscono una popolazione di cellule eterogenee tra loro. È stato dimostrato che la popolazione CD34+ è altamente arricchita in una sua frazione che non esprime un altro antigene, chiamato CD38 (cellule CD34+/CD38-), e che corrisponde al 5% del totale. I progenitori commissionati per le varie linee maturative, invece, co-esprimono questi due antigeni (CD34+/CD38+) e rappresentano il restante 95% delle cellule CD34+ totali. Diversi studi condotti a metà degli anni Novanta hanno contribuito ad affermare l’esistenza di una componente staminale, nel compartimento emopoietico sia murino che umano, caratterizzata dall’assenza dell’antigene CD34 ed in grado, tuttavia, di ripopolare l’emopoiesi di ospiti irradiati letalmente. La relazione che intercorre tra cellule CD34- e cellule CD34+ è ancora oggetto di studio: un’ipotesi che è stata avanzata è che l’espressione dell’antigene CD34 rappresenti la manifestazione di un diverso grado di attivazione funzionale all’interno dello stesso compartimento staminale. In base a questo modello, la frazione CD34- potrebbe contenere cellule staminali in fase di quiescenza che, una volta attivate, acquisirebbero in parallelo l’antigene CD34.

L’espressione dell’antigene CD34 sulle cellule staminali emopoietiche e sui progenitori commissionati si associa sia all’espressione di antigeni non-lineage specifici (Thy1, CD38, HLA-DR, CD45 RA, CD71), sia all’assenza di marcatori più specifici per le fasi successive di maturazione della linea T-linfocitaria, B-linfocitaria, mieloide e megacariocitaria (Figura 1.5). Più recentemente anche l’antigene CD133 è stato associato alla popolazione di cellule staminali emopoietiche; tuttavia, l’espressione di questo antigene non è esclusiva per il ramo emopoietico, comprendendo anche cellule di altri distretti, come ad esempio il tessuto nervoso, endoteliale ed epatico.

Lo sviluppo delle tecniche di citofluorimetria a flusso ha rivoluzionato i processi di caratterizzazione delle cellule mature del sangue, permettendo di identificare le varie popolazioni in tempo reale attraverso metodiche standardizzate non più influenzate dall’operatore (Figura 1.6).

Figura 1.6 Analisi citofluorimetrica di un campione di sangue cordonale marcato con anticorpi anti CD45 e anti CD14. I gates identificano la popolazione dei granulociti (CD45low, CD14medium), dei linfociti (CD45high, CD14negative) e dei monociti (CD45high, CD14high).

1.5. REGOLAZIONE INTRINSECA ED ESTRINSECA DELL’EMOPOIESI

I meccanismi di regolazione che inducono una cellula staminale ad autoreplicarsi o a differenziare verso linee emopoietiche ben definite e, successivamente, a maturare, possono essere regolati da fattori estrinseci (citochine) o intrinseci (fattori di trascrizione) alle cellule stesse.

Fattori intrinseci

Le citochine comprendono i fattori di crescita propriamente detti (ad esempio EPO, G-CSF), le chemochine (ad esempio CXCL12) e le interleuchine e possono essere suddivise in multilineage e lineage-specifiche (Tabella 1.1). Le citochine multilineage stimolano la proliferazione e il commissionamento delle cellule staminali emopoietiche pluripotenti e agiscono senza specificità di lineage. Appartengono a questa categoria: SCF (stem cell factor), FLT3L (ligando del recettore FLT3), TPO (trombopoietina), IL-6 (interleuchina 6), IL-3. Le citochine lineage-specifiche inducono il differenziamento all’interno delle singole linee maturative e comprendono ad esempio: G-CSF, M-CSF (monocyte-colony stimulating factor), EPO, TPO.

La loro azione avviene attraverso il legame a specifici recettori di membrana. Tali recettori sono costituiti da proteine transmembrana con un dominio extracellulare, che possiede il sito di legame per la citochina, e un dominio citoplasmatico che possiede il sito catalitico. Può accadere che alcuni recettori si associno formando complessi recettoriali le cui subunità vengono condivise da più citochine, come accade per IL-3 e GM-CSF (granulocyte-macrophage colony-stimulating factor). I fattori di crescita esercitano la propria funzione di regolazione del processo emopoietico in combinazione con altre citochine, come mostrato nella Tabella 1.2. L’entità della risposta cellulare alla stimolazione da parte di citochine emopoietiche dipende dall’intensità di espressione dello specifico recettore sulla cellula stessa (Figura 1.7). All’aumentare del grado di differenziamento, la cellula emopoietica diminuisce l’espressione dei recettori per i fattori di crescita multi-lineage (ad esempio cKIT o FLT3) e aumenta quelli per i fattori lineage-specifici (ad esempio EPOR, recettore per EPO nelle cellule eritroidi). Un’eccezione è rappresentata dai recettori per IL-3 e GM-CSF i cui livelli di espressione sono massimali nei progenitori HPC e ne guidano l’amplificazione.

Figura 1.7 Diagramma che descrive le modificazioni in termini di espressione e di densità dei recettori per i fattori di crescita coinvolti nel differenziamento eritroide da HSC a eritroblasto. In parallelo, sono indicati i fabbisogni cellulari per i corrispondenti fattori di crescita, necessari per la crescita in vivo e in vitro.

I geni che codificano per tali recettori fanno parte di un pool di geni che sono regolati, attraverso meccanismi epigenetici, nelle fasi di preparazione al differenziamento e alla maturazione terminale (Figura 1.8).

La scoperta di questo complesso network di citochine ha permesso di identificare combinazioni di fattori di crescita che vengono ancora oggi utilizzate per studiare la proliferazione e la maturazione delle cellule staminali in vitro. Rimane ancora da chiarire la combinazione di fattori di crescita in grado di sostenere il self-renewal delle LT-HSC in vitro; ad oggi, tutte le combinazioni sviluppate sono in grado di indurne la proliferazione e il differenziamento in ST-HSC o HPC.

Figura 1.8 Esempio delle modificazioni che avvengono, durante il differenziamento da HSC a eritroblasto, a carico dei fattori di trascrizione e dei geni che codificano per proteine necessarie ad esplicare le funzioni specifiche degli eritrociti. È possibile creare un diagramma simile per ogni lineage differenziativo del sistema emopoietico.

In aggiunta alle citochine che sono indispensabili per l’emopoiesi, numerosi fattori di crescita possono regolare tale processo o in sinergia con fattori indispensabili o modulandone l’espressione. Un esempio di questa famiglia di citochine è rappresentato dall’IL-6, la quale non possiede un recettore con un sito di legame specifico sui progenitori HPC ma ne regola la proliferazione inducendo l’espressione di TPO.

La crescita dei progenitori emopoietici dipende anche da fattori solubili con regolazione negativa: tra questi, il fattore di trasformazione neoplastica-β (TGF-β) è stato il più studiato. TGF-β inibisce l’emopoiesi attraverso vari meccanismi: 1) induce la quiescenza delle HSC attraverso il pathway di SMAD; 2) blocca l’inibizione della proliferazione delle HSC Smad5-dipendente; 3) attraverso la via di segnalazione di Smad-4, accelera la maturazione in senso eritroide inducendo anemia; 4) inibisce la maturazione terminale dei megacariociti riducendo la produzione di piastrine.

Altri regolatori negativi dell’emopoiesi sono: 1) la proteina infiammatoria macrofagica-1α (MIP-1α), prodotta da macrofagi attivati, cellule linfoidi e fibroblasti, che inibisce la capacità clonogenica delle cellule CD34+ stimolate con EPO, IL-3 e GM-CSF; 2) il fattore di necrosi tumorale-α (TNF-α), che inibisce la capacità proliferativa dei progenitori emopoietici indotta da G-CSF; 3) gli interferoni (INFs) (Tabella 1.1).

I fattori di regolazione dell’emopoiesi sono prodotti principalmente dalle cellule accessorie mieloidi e dalla componente stromale del midollo osseo. La stessa matrice extracellulare partecipa al controllo dell’emopoiesi lagandosi a fattori di crescita e presentandoli in forma attivata alle cellule emopoietiche staminali.

Fattori estrinseci

Fanno parte di questo gruppo i fattori di trascrizione che, attivando specifici programmi trascrizionali, assicurano il differenziamento e la maturazione durante il processo di emopoiesi. Possono essere suddivisi in regolatori master e accessori a seconda che siano in grado di indurre il commissionamento e la matuazione da soli o che funzionino da supporto agli altri. Alcuni esempi sono: PU.1, responsabile del commissionamento granulo-monocitario; CEBPA e RARA responsabili della granulocitopoiesi; GATA1 e GATA2 responsabili della eritro-megacariocitopoiesi, WNT, Notch, OCT-4 e BM1 importanti per il mantenimento della staminalità delle cellule emopoietiche.

Fattori intrinseci e fattori estrinseci interagiscono tra loro e si influenzano a vicenda durante tutto il processo differenziativo. Tuttavia, mentre è chiaro come l’attivazione di un programma genetico trascrizionale specifico di un lineage maturativo preceda l’effetto della stimolazione citochinica e la renda possibile piuttosto che esserne una conseguenza (ad esempio, gli enhancer che regolano l’espressione di fattori di trascrizione sono attivati prima che la cellula esprima i recettori per fattori di crescita lineage-specifici), non è chiaro come la regolazione estrinseca controlli l’espressione di fattori di trascrizione associati a specifici lineage differenziativi (Figura 1.8). Recentemente è stato proposto che i fattori di crescita non regolino l’espressione ma piuttosto l’attività dei fattori di trascrizione controllando la loro traslocazione al nucleo.

1.6. IL MICROAMBIENTE EMOPOIETICO

Il midollo osseo costituisce un microambiente unico nella sua capacità di favorire e supportare l’emopoiesi. Al suo interno coesistono, infatti, la componente emopoietica appena descritta e una componente stromale (Figura 1.3). Quest’ultima è costituita da elementi cellulari di origine mesenchimale: le cellule staminali mesenchimali, gli osteoblasti, gli osteoclasti, le cellule adipose, le cellule endoteliali e le cellule del sistema nervoso simpatico. La funzione del microambiente emopoietico non è soltanto di supporto meccanico ma anche di regolazione della capacità proliferativa e differenziativa delle cellule staminali e dei progenitori emopoietici.

A tutt’oggi il microambiente emopoietico è un’entità difficile da definire, sia dal punto di vista morfologico sia funzionale. Per gran parte degli anni Novanta, gli studi sull’interazione delle cellule staminali con il microambiente emopoietico si sono basati su saggi colturali in vitro in presenza di cellule stromali di origine midollare. La svolta significativa è avvenuta con l’utilizzo di modelli in vivo (topi knock-out) specifici per questo ambito di studio. Queste indagini, unite allo sviluppo di nuove tecnologie di imaging in vivo, hanno permesso di identificare almeno due entità anatomofunzionali, chiamate nicchie emopoietiche, responsabili del mantenimento di cellule staminali quiescenti e dell’induzione della loro proliferazione e differenziamento: la nicchia endosteale e la nicchia vascolare. La nicchia endosteale è costituita prevalentemente da osteoblasti, osteoclasti e cellule mesenchimali ed è localizzata a livello dell’endostio. La sua funzione principale è quella di assicurare la quiescenza cinetica e l’auto-mantenimento delle cellule staminali. La nicchia vascolare è costituita principalmente da cellule sinusoidali endoteliali e periciti. La sua funzione prevalente è quella di regolare i meccanismi di maturazione e mobilizzazione nel circolo delle cellule staminali emopoietiche (Figura 1.3). Studi con progenitori emopoietici marcati ex vivo e poi tracciati in vivo hanno mostrato che cellule staminali più indifferenziate sembrano prediligere una localizzazione prossima all’endostio, mentre le cellule in via di differenziamento o prossime alla maturazione terminale sembrano acquisire progressivamente posizioni più distali, in prossimità dei vasi.

Il ruolo del microambiente nella regolazione dell’emopoiesi è stato dimostrato in studi su modelli murini caratterizzati da un difetto genetico che porta ad anemia (mutazione white, W, e mutazione Steel, Stl). Tali studi hanno dimostrato che il trapianto di midollo da un topo Stl/Stl ad un topo W/W risolve l’anemia nel topo ricevente ma che non è vero il contrario. Inoltre l’insorgenza di anemia in topi wild-type si osserva solo in seguito a trapianto di midollo da un topo W/W ma non da un topo Stl/Stl. Queste osservazioni hanno portato Till e McCullock, i padri delle cellule staminali, a ipotizzare che le mutazioni W fossero a carico del compartimento staminale mentre le mutazioni Stl alterassero le funzioni di supporto del microambiente. Studi successivi hanno dimostrato che le mutazioni Stl e W si trovano su geni che codificano, rispettivamente, per SCF (anche conosciuto come cKIT ligando o fattore di Steel) espresso dalle cellule stromali, e per il suo recettore cKIT, che viene espresso dalle cellule staminali emopoietiche (Tabella 1.1). Il fattore di crescita SCF prodotto dalle cellule stromali si è scoperto essere una delle citochine essenziali per la proliferazione e la maturazione delle cellule staminali, rendendo così l’asse cKIT/ SCF un importante meccanismo di regolazione dell’emopoiesi da parte dello stroma. Oltre a fornire la dimostrazione della relazione funzionale tra le HSC e la loro nicchia, gli esperimenti sopra descritti hanno avuto importanti implicazioni cliniche. La prima osservazione che si ottiene da questi studi è che dopo un trapianto allogenico le cellule stromali rimangono quelle dell’ospite: sebbene il midollo del donatore contenga cellule staminali mesenchimali (MSC) in grado di dare origine a tutti gli elementi dello stroma, le MSC del donatore non sono in grado di attecchire nel midollo del ricevente. La seconda osservazione è che una difettiva emopoiesi dovuta a carenze dello stroma, come quelle indotte da alte dosi di chemioterapici o di radiazioni ionizzanti, potrebbero non essere compensate da un trapianto di midollo.

Il microambiente esercita le proprie funzioni di controllo sui precursori emopoietici attraverso vari meccanismi: 1) interazioni cellulari dirette; 2) secrezione di fattori solubili; 3) elaborazione di una matrice cellulare. Studi su modelli knock-out hanno permesso di individuare molecole, fattori di trascrizione e vie di trasduzione del segnale intracitoplasmatiche coinvolte nella regolazione dei rapporti tra microambiente emopoietico e cellule staminali. In particolare, le vie legate a NOTCH, Wnt e PTEN, insieme ai fattori BMI1 e HOXB4, sembrano essere essenziali per il mantenimento delle capacità di self-renewal delle cellule staminali. L’asse costituito da angiopoietina1/Tie2 sembra invece essenziale nel trasdurre segnali nella nicchia vascolare. Fondamentali sono anche alcune molecole di adesione che permettono alla cellula staminale di modulare il contatto e la permanenza all’interno della nicchia. Tra queste spiccano il recettore CD44 e le integrine VLA-4 e VLA-5. CD44 lega l’acido ialuronico e altre componenti della matrice extracellulare, come la selectina-E espressa sulla superficie delle cellule endoteliali dei sinusoidi midollari. Le integrine VLA-4 e VLA-5, espresse sulla superficie delle cellule staminali, sono in grado di legare una delle principali componenti della matrice extracellulare, la fibronectina, nonché la molecola VCAM-1, costitutivamente espressa da cellule endoteliali e stromali, promuovendo la sopravvivenza e l’attecchimento dei progenitori emopoietici. È stato dimostrato che la somministrazione in vivo di anticorpi anti-VLA-4 induce mobilizzazione di progenitori emopoietici nel sangue periferico.

Un cenno particolare merita l’asse trasduzionale CXCL12/CXCR4, il quale gioca un ruolo centrale nella biologia del comportamento migratorio delle cellule staminali emopoietiche, come precedentemente descritto. In particolare, l’interazione tra il recettore CXCR4, espresso dai progenitori emopoietici, e la chemochina CXCL12, prodotta dalle cellule stromali, svolge un ruolo cardine nel promuovere la ritenzione di tali cellule a livello midollare, nonché nel favorire il ripopolamento del midollo dopo trapianto.

All’interno della componente stromale, le cellule staminali mesenchi-mali ricoprono un ruolo chiave nella fisiologia del midollo osseo e nella regolazione dell’emopoiesi, grazie alla capacità di modulare il microambiente midollare sia in termini di composizione cellulare (ad esempio, differenziando in osteoblasti) sia di composizione umorale e strutturale (secernendo citochine, fattori di crescita e componenti della matrice extracellulare). Le MSC sono cellule immature con capacità transdifferenziativa, ossia dietro opportuna stimolazione da parte di citochine sono in grado di differenziare in osteoblasti, adipociti, condrociti, fibroblasti, cellule endoteliali e mioblasti. Le MSC si distinguono per l’espressione di alcuni marcatori fenotipici (CD90, CD44, CD73, CD105, STRO-1 e CD29), per l’assenza dei marcatori emopoietici (CD34, CD38, CD45, CD14 e HLA-DR) e per la capacità funzionale di generare colonie di cellule fibroblastoidi (CFU-F) in vitro. Esperimenti di trapianto xenogenico hanno dimostrato la capacità delle cellule stromali di migliorare la ricostituzione ematologica. Inoltre le cellule staminali mesenchimali hanno importanti effetti anti-infiammatori e immunomodulanti, caratteristiche che garantiscono loro un diretto controllo sul sistema immunitario bloccandone l’attivazione. Tutto ciò le rende interessanti, dal punto di vista clinico, in caso di trapianto di midollo, in quanto in grado di accelerare il recupero emopoietico dopo il trapianto e ridurre la malattia da trapianto contro l’ospite (vedasi Capitolo 6).

Cellule staminali e microambiente risultano essere strettamente interconnessi, rappresentando un’unica unità funzionale. Tale connessione è ulteriormente dimostrata dal fatto che le cellule emopoietiche differenziate sono a loro volta in grado di influenzare il microambiente. Ad esempio, i macrofagi residenti nel midollo osseo sono in grado di implementare la capacità delle MSC di indurre la proliferazione delle HSC in seguito a trapianto e, inoltre, contribuiscono al continuo rimodellamento della matrice extracellulare degradando e riassorbendo i suoi componenti. Un altro esempio è rappresentato dai megacariociti, i quali sono in grado di promuovere la proliferazione degli osteoblasti e delle cellule endoteliali attraverso il rilascio di fattori di crescita, come BMP4 e VEGF. Inoltre, attraverso il rilascio di TGF-β, possono indurre i fibroblasti a produrre componenti della matrice extracellulare.

Capitolo 2

FISIOPATOLOGIA E CLINICA DELL’ERITROPOIESI

Emanuele ANGELUCCI¹

Alessandro BROCCOLI²

Fabiana BUSTI³

Antonio DE VIVO²

Domenico GIRELLI³

Gabriele GUGLIOTTA²

Federica PILO

Marta STANZANI²

1 ERITROPOIESI

1.1. ORGANIZZAZIONE GENERALE

L’eritropoiesi è il sistema cellulare deputato al rinnovamento continuo dei globuli rossi giunti al termine della loro vita fisiologica o distrutti prematuramente. Ogni giorno ogni essere umano produce 200 bilioni di nuovi eritrociti utilizzando circa 20 mg di ferro. Il tempo impiegato mediamente per la formazione di un nuovo eritrocito è di 14-18 giorni. Gli stadi maturativi dell’eritropoiesi a partire dalla cellula staminale totipotente sono solo parzialmente conosciuti. L’eritropoiesi viene virtualmente divisa in una fase di maturazione precoce definita eritropoietina-dipendente e in una fase tardiva chiamata ferro-dipendente L’unità anatomo-funzionale a ciò preposta prende il nome di eritrone. Esso risulta costituito dai progenitori commissionati per l’eritropoiesi morfologicamente non riconoscibili (BFU-E, CFU-E), dai precursori eritroidi morfologicamente riconoscibili (proeritroblasti ed eritroblasti) e dai globuli rossi maturi. Essi si dispongono all’interno della nicchia emopoietica in modo concentrico non casuale intorno alla cellula macrofagica responsabile del rilascio controllato delle molecole di ferro indispensabili per la fase terminale della maturazione dell’eritrocito, costituendo la cosiddetta isola eritroide.

I progenitori eritroidi sono identificabili in base alla capacità di generare in vitro colonie di grandi dimensioni (BFU-E) o di piccole dimensioni (CFU-E) di precursori eritroidi e di eritrociti maturi, ricchi di emoglobina, che conferiscono alle colonie stesse un aspetto caratteristicamente rosseggiante.

Le BFU-E (erythroid burst forming units) sono a loro volta suddivisibili in due sottopopolazioni: una ancestrale, costituita dalle early BFU-E, l’altra, più matura, costituita dalle late BFU-E. Queste ultime danno origine alle CFU-E (erythroid colony forming units).

Le caratteristiche biologiche delle BFU-E e CFU-E sono differenti. Le BFU-E mantengono in parte le caratteristiche di automantenimento; sono per lo più in fase G0 del ciclo cellulare; si trovano, oltre che nel midollo osseo, anche nel sangue periferico e presentano l’antigene CD34 e gli antigeni HLA di classe II. Le CFU-E rappresentano un gradino ulteriore della maturazione: hanno perduto la capacità di automantenimento, sono per la maggior parte in fase S del ciclo cellulare, non circolano nel sangue periferico, non esprimono in superficie l’antigene CD34 e gli antigeni HLA di classe II, acquisiscono proteine di superficie specifiche della serie eritroide, come la glicoforina A e gli antigeni del sistema Rh. Inoltre, sono dotate di un elevato numero di recettori per l’eritropoietina e per la transferrina.

I precursori eritroidi derivano per differenziazione dai progenitori eritroidi (Tabella 2.1) ma, contrariamente a questi ultimi, sono morfologicamente riconoscibili al microscopio ottico. Essi comprendono sia proeritroblasti ed eritroblasti (basofili, policromatofili, ortocromatici) sia i reticolociti midollari e circolanti (Figura 2.1). Nell’adulto gli eritroblasti si trovano solo nel midollo osseo, della cui popolazione cellulare costituiscono circa il 25%. Quando la concentrazione cellulare di emoglobina arriva a superare il 20%, l’eritroblasto ortocromatico cessa di proliferare ed espelle, per un meccanismo chimico legato alla acidificazione emoglobinadipendente del citoplasma, il nucleo e diventa reticolocito. Il reticolocito è un eritrocito giovane che conserva alcuni mitocondri, RNA messaggero e RNA ribosomiale per la sintesi dell’emoglobina. In 2-4 giorni queste strutture citoplasmatiche si perdono ed il reticolocito diviene eritrocito maturo, la cui vita media è di circa 120 giorni (Tabella 2.1).

Tabella 2.1

Figura 2.1 Eritropoiesi normale. Citologia da mieloaspirato. È mostrato un isolotto di eritroblasti costituito da cellule eritroidi nelle diverse fasi maturative: 1 - eritroblasti basofili; 2 - eritroblasti policromatofili; 3 - eritroblasti ortocromatici.

1.2. FATTORI DI REGOLAZIONE DELLA ERITROPOIESI

La differenziazione eritroide avviene in risposta a specifici stimoli da parte di citochine, fattori di trascrizione e proteine di trasduzione del segnale che cooperano tra loro per indirizzare la maturazione verso la linea eritroide: per tale motivo vengono definiti lineage restricted. Tutte queste molecole hanno come bersaglio cellulare progenitori e precursori eritroidi nei differenti stadi differenziativi (Figura 2.2).

Nella fase più immatura è sicuramente fondamentale lo stem cell factor (SCF) con il suo recettore, espresso soprattutto nelle cellule CD34+, e l’IL-3. Essi rimangono altamente espressi durante il passaggio da BFU-E a CFU-E per poi progressivamente sparire a livello di eritroblasti policromatofili.

Il fattore di trascrizione chiave dell’eritropoiesi, definito master of transcription, è sicuramente GATA1 (GATA binding factor 1). Esso promuove la sopravvivenza cellulare tramite l’attivazione dei geni antiapoptotici della famiglia del BCL (BCL-XL) e favorisce l’espressione del recettore dell’eritropoietina (EPOR); inoltre attiva il programma di sintesi globinica e dell’eme eritroide-specifica. Al contrario, sopprime l’espressione di fattori trascrizionali non specificamente eritroidi quali GATA2, tipico invece della megacariocitopoiesi.

Figura 2.2 Citochine che agiscono stimolando l’eritropoiesi.

Altri regolatori della differenziazione eritroide sono il KLF1 (Kruppel-like factor 1) e FOXO3 (Forkhead box O). Quest’ultimo nelle fasi precoci di maturazione regola la progressione del ciclo cellulare e modula i fattori coinvolti nell’apoptosi, mentre nella fase tardiva partecipa all’espressione dei geni responsabili dei processi di enucleazione cellulare e produzione delle difese antiossidanti (fondamentali in questa fase di maturazione per l’elevata produzione di specie reattive dell’ossigeno pro-ossidanti).

La transferrina (Tf) ed il corrispettivo recettore cellulare (TfR-1) rappresentano altri fondamentali regolatori dell’eritropoiesi soprattutto nella fase ferro-dipendente, così come il growth differentiating factor 11 (GDF11) e le immunoglobuline A (IgA).

GDF11 e altri membri della famiglia del tumor growth factor (TGF-β), legandosi ai corrispettivi recettori transmembrana (ACVR2A-ACVR2B) tramite l’attivazione del segnale SMAD 2/3, favoriscono la trascrizione di geni responsabili di una maturazione tardiva aberrante.

1.3. ERITROPOIETINA

L’eritropoietina (EPO) è una glicoproteina del peso molecolare di 30,4 kDa, la cui sintesi è codificata da un gene localizzato sul cromosoma 7.

Nell’adulto oltre l’80% dell’EPO viene prodotta dal rene, più specificamente da cellule interstiziali corticali adiacenti ai tubuli prossimali. Una piccola quota di EPO viene sintetizzata anche nel fegato dagli epatociti e dalle cellule interstiziali.

L’apporto di ossigeno ai tessuti è il principale fattore fisiologico che regola la produzione di EPO: in risposta all’ipossia viene stimolata la sintesi di HIF-1α (hypoxia inducible factor-1-α), che interagisce con il promotore del gene che codifica la sintesi di EPO formando un fattore di trascrizione che regola positivamente l’espressione del gene stesso. Ne consegue un aumento esponenziale del numero di cellule produttrici di EPO, e quindi un incremento dell’ormone circolante. Altri fattori (fra cui alcune citochine) concorrono a regolare la sintesi di EPO: IL-6 la incrementa, mentre IL-1, TNF-α e TGF-β la inibiscono.

L’EPO circolante si lega ad uno specifico recettore, appartenente alla superfamiglia dei recettori per i fattori di crescita, che è presente sulla superficie cellulare dei precursori eritroidi. Il numero di recettori per cellula varia a seconda dello stadio maturativo: i precursori più immaturi (early BFU-E) ne possiedono una piccola quantità (< 100), e si osserva un progressivo incremento man mano che la cellula si differenzia e matura, fino ad arrivare ad un massimo di circa 1.100 recettori per cellula allo stadio di CFU-E/proeritroblasto. A questo punto il numero di recettori comincia progressivamente a diminuire, arrivando a 100-200 a livello degli eritroblasti e quasi a zero nei reticolociti circolanti.

Il pathway del segnale di trasduzione dell’EPO è complesso ed è stato a tutt’oggi descritto solo in parte. L’EPO agisce legandosi al suo recettore (EPOR), che appartiene alla famiglia dei recettori per le citochine di tipo I, costituito da un dominio transmembrana e da una porzione citoplasmatica. La stimolazione di EPOR determina una modifica della sua conformazione che attiva la tirosin-chinasi citoplasmatica JAK2.

Attraverso l’attivazione di JAK2, EPOR innesca diversi segnali di trasduzione i quali agiscono in un complesso ma ben orchestrato meccanismo che previene l’apoptosi e promuove la proliferazione e la differenziazione eritroide.

Tra questi il pathway più importante è sicuramente JAK2-STAT5. STAT5 è capace, se attivato, di favorire l’espressione di diversi geni antiapoptotici eritroidi, quali BCL-XL. Altri segnali attivanti che producono lo stesso risultato sono RAS, MAPK, PI3K, ad oggi tuttavia solo parzialmente descritti.

Nell’individuo sano la concentrazione di EPO sierica, determinata con metodi radioimmunologici o immunoenzimatici, è pari a 10-30 mU/mL. Se il rene è integro e non sono presenti condizioni, come la flogosi, che tramite alcune citochine inibiscono la sintesi di EPO, la concentrazione sierica di quest’ultima aumenta esponenzialmente con il diminuire dell’emoglobina. È pertanto possibile, studiando individui normali e pazienti anemici con risposta eritropoietinica adeguata (ad esempio pazienti affetti da anemia sideropenica), costruire in ogni laboratorio una curva di risposta eritropoietinica fisiologica all’anemia e calcolare su questa base la regressione esponenziale dell’EPO sierica in rapporto all’emoglobina o all’ematocrito. In tal modo è possibile valutare in ogni singolo paziente anemico se la risposta eritropoietinica è adeguata o meno all’entità dell’anemia, rapportandola alla curva di riferimento (Figura 2.3).

Figura 2.3 Regressione esponenziale dell’eritropoietina sierica (EPO) in rapporto all’ematocrito. I pazienti la cui concentrazione di EPO è compresa nell’area retinata hanno una risposta eritropoietinica fisiologica; sotto tale area mostrano una risposta ertropoietinica inadeguata (insufficienza eritropoietinica relativa) (modificato da: Cazzola M, Beguin Y, 1992).

1.4. RISERVA FUNZIONALE DELL’ERITRONE E MECCANISMI DI RIPRISTINO FISIOLOGICI

L’eritrone, alla stessa guisa di altri organi o linee cellulari, ha una capacità di modulare la produzione in funzione delle richieste. Se, in condizioni di base, l’eritrone produce ogni giorno 20-30 mL di eritrociti contenenti 7 g di emoglobina, in caso di necessità (emolisi, emorragie, ipossia da alta montagna) ha la potenziale capacità di aumentare la produzione della quota di eritrociti e di emoglobina che genera in condizioni di base fino a 8 volte nel bambino e 5 volte nell’adulto. Si deve a questa elasticità produttiva il mantenimento dell’equilibrio eritrocitario-emoglobinico anche in presenza di insulti citotossici o di perdite ematiche quantitativamente contenute, così frequenti nel corso della vita dell’uomo.

Meccanismo EPO-dipendente

Fas e Fas ligand (FasL) sono membri della famiglia del tumor necrosis factor (TNF) e corrispettivo recettore. Il loro legame determina l’attivazione della cascata delle caspasi responsabile dell’inizio dell’apoptosi cellulare.

Gli eritroblasti immaturi esprimono Fas mentre quelli in uno stato maturativo più avanzato esprimono il FasL. Qualora la produzione eritroide sia fisiologicamente sufficiente, la loro interazione all’interno dell’isola eritroide di maturazione favorisce l’arresto maturativo e l’innesco dell’apoptosi delle cellule immature attraverso l’attivazione delle caspasi; in caso di emorragie o emolisi, all’interno dell’isola eritroide si attiva un meccanismo che protegge le cellule immature dall’apoptosi e ne favorisce invece la differenziazione e maturazione.

L’aumento di EPO prodotto in queste circostanze favorisce la produzione di heat shock protein 70 (HSP70), la cui traslocazione nucleare permette la protezione di GATA1 dal clivaggio fisiologico che avviene attraverso l’attivazione di Fas-FasL e la cascata delle caspasi. In assenza dell’effetto protettivo di HSP70, GATA1 viene degradato dall’attivazione delle caspasi e il progenitore eritroide subisce l’apoptosi.

Questo modello in cui il destino dei precursori eritroidi è determinato dalla localizzazione di HSP70 nel nucleo è stato dimostrato essere alterato nelle patologie caratterizzate da eritropoiesi inefficace quali talassemie, sindromi mielodisplastiche e diseritropoiesi congenite.

Meccanismo ferrodipendente

L’omeostasi del ferro è fondamentale per una eritropoiesi efficace così come l’eritropoiesi è fondamentale per mantenere una adeguata omeostasi del ferro.

Durante lo stimolo per un’aumentata produzione di EPO (come abbiamo visto avvenire in caso di perdite emorragiche o emolisi) si ha una risposta di iperplasia eritroblastica compensatoria che causa un aumento della produzione dell’ormone eritroferrone (ERFE) EPO-STAT5 dipendente. ERFE viene secreto in circolo e a livello epatico e ha la proprietà di sopprimere la produzione di epcidina.

L’epcidina è il regolatore cardine dell’afflusso/efflusso del ferro cellulare. La sua soppressione determina un aumento dell’assorbimento di ferro a livello intestinale, un aumentato rilascio di ferro dai depositi epatici e una maggiore attività di riciclo dei macrofagi splenici. Il risultato è un’aumentata disponibilità di ferro per una maggiore eritropoiesi compensatoria.

1.5. ERITROPOIESI INEFFICACE

Si definisce eritropoiesi inefficace l’incapacità di produrre un adeguato numero di cellule eritroidi mature. Il risultato è un’iperplasia di cellule eritroidi immature a livello midollare che si manifesta con anemia a livello periferico.

Anche nell’individuo sano esiste una quota fisiologica di eritropoiesi inefficace dell’ordine di circa il 25%.

CAUSE DI ERITROPOIESI INEFFICACE

Tabella 2.2

PATOLOGIE CARATTERIZZATE DA ERITROPOIESI INEFFICACE

Tabella 2.3

Un importante fattore da tenere in considerazione quando si parla di diseritropoiesi è che, con l’aumentare dell’età, le isole eritroidi midollari diminuiscono fisiologicamente di numero e aumentano di taglia: ciò è dovuto verosimilmente alla riduzione del numero delle cellule staminali totipotenti e alla compensatoria iperproliferazione dei progenitori eritroidi. Per tale motivo, la diseritropoiesi aumenta fisiologicamente con l’età avanzata. Nei pazienti con sindromi mielodisplastiche, oltre ad essere state riscontrate tali anomalie delle isole eritroidi, sono state descritte anche anomalie strutturali ed è stato documentato come la densità delle isole eritroidi in questi pazienti correli inversamente con la sopravvivenza. L’alterazione della struttura e del numero delle isole eritroidi può essere osservata anche in altre condizioni patologiche, quali l’anemia aplastica e le sindromi da insufficienza midollare.

Ad oggi non esiste un unico marcatore di diseritropoiesi da poter utilizzare dal punto di vista diagnostico-terapeutico. Esso infatti dovrebbe quantificare in un unico valore il livello di aumentata proliferazione, ridotta differenziazione ed aumentata apoptosi, le tre caratteristiche principali dell’eritropoiesi inefficace. Al momento, pertanto, è necessario utilizzare quelli più comunemente riproducibili nei nostri laboratori:

la conta dei reticolociti;

il dosaggio dell’EPO;

la conta delle cellule eritrocitarie nucleate (nucleated red blood cells, NRBC).

Marcatori riservati al momento alle sole finalità sperimentali sono ERFE, growth differentiation factor 11 (GDF11), epcidina, GATA 1.

Le cause di eritropoiesi inefficace sono riassunte nella Tabella 2.2. Un’alterazione a carico di uno o più fattori determinanti il destino della proliferazione e differenziazione eritroide dà origine a diseritropoiesi. La maggior parte di tali alterazioni non è ancora del tutto chiarita, ma tutti i fattori di trascrizione e i pathways coinvolti sono possibili target terapeutici

La Tabella 2.3 mostra le patologie più comuni caratterizzate da diseritropoiesi e i meccanismi deficitari sottostanti.

2 ERITROCITI

L’eritrocito (Tabella 2.4) è una cellula priva di nucleo, a forma di disco biconcavo (discocito). Il suo diametro è di 6-8 mm, il suo spessore di circa 2,5 mm, il suo volume di 80-100 mm³. L’eritrocito normale contiene da 27 a 32 pg di emoglobina in soluzione (Figura 2.4).

L’emoglobina costituisce il 30-36% del volume dell’eritrocito: questo assume O2 e scarica CO2 a livello alveolare polmonare e cede O2, caricando CO2, a livello periferico (respirazione tessutale). L’eritrocito veicola l’emoglobina e la protegge dall’ossidazione: infatti l’emoglobina, per trasportare (assumere e cedere) O2, deve essere protetta nei confronti di un’ossidazione permanente. L’eritrocito svolge queste due funzioni grazie alla struttura della sua membrana e al suo apparato metabolico ed enzimatico.

ERITROCITI

Tabella 2.4

Figura 2.4 Eritrociti normali. Nel sangue periferico, gli eritrociti appaiono come cellule tondeggianti, a contorno citoplasmatico regolare, caratterizzate da un’area tingibile periferica e da una porzione centrale pallida, in considerazione della classica morfologia a disco biconcavo.

Membrana eritrocitaria

La membrana dell’eritrocito costituisce la struttura fisica più importante di questa cellula che, come si è detto, è priva di nucleo e di strutture citoplasmatiche. La struttura della membrana eritrocitaria è tale da assicurare alla cellula la deformabilità necessaria per poter attraversare i vasi capillari e il filtro splenico (polpa rossa). Il diametro di un vaso capillare è infatti inferiore (2-3 mm) rispetto a quello di un globulo rosso. Quest’ultimo, pertanto, per superare tale ostacolo, deve essere in grado di subire una deformazione passiva reversibile, passando dalla forma a disco biconcavo a quella ellissoidale.

I componenti fondamentali della membrana eritrocitaria sono per il 52% proteine, per il 40% lipidi e per l’8% carboidrati. Da un punto di vista strutturale possono essere riconosciuti: 1) un doppio strato lipidico; 2) un fitto reticolo di proteine che attraversano il doppio strato lipidico (proteine integrali) e che lo sostengono (proteine del citoscheletro).

Il doppio strato lipidico costituisce una barriera capace di impedire il libero passaggio dei soluti. Esso è composto in prevalenza da fosfolipidi e colesterolo non esterificato e, in minore quantità, da acidi grassi liberi e da glicolipidi. Le molecole lipidiche sono assemblate in modo tale che le loro porzioni idrofobiche siano orientate verso l’interno, mentre le estremità idrofiliche polari siano rivolte all’esterno, verso la superficie plasmatica o verso il citoplasma. Lo strato lipidico esterno scambia liberamente molecole di colesterolo con il plasma.

Come precedentemente accennato, le proteine della membrana eritrocitaria possono essere divise in due gruppi: 1) le proteine integrali (banda 3, glicoforine) che attraversano il doppio strato lipidico; 2) le proteine del citoscheletro (spectrina, proteina 4.1, actina, anchirina, proteina 4.2)

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