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IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA
IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA
IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA
E-book92 pagine42 minuti

IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA

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Info su questo ebook

E' pervenuta, nel laboratorio dove ho svolto la mia attività di tesi,all'osservazione una donna con caratteristico quadro clinico di talassemia intermedia.L'analisi molecolare della mutazioni B-talassemiche più frequenti nel Meditarraneo ha evidenziato in eterozigosi la mutazione IVSI-6.
(T->C).L'analisi di sequenziamento dei geni beta globinici ha evidenziato una nuova mutazione che cade in posizione -30 caratterizzata dalla sostituzione nucleotidica T->G nel TATA BOX e relative al sito cap del gene b-globinico.La TATA BOX è un elemento fondamentale per il corretto inizio della trascrizione genica e in letteratura sono state descritte finora 6 mutazioni che cadono in una regione compresa tra -31 a -28 bp prossimale alla TATA BOX e relative al sito cap del gene b-globinico.Queste mutazioni,la -31 A->G,la - 29A->G,le sostituzioni -28 A->G ed A->C,la -30 T->A e -30 T->C diminuiscono l'efficienza di trascrizione e portano alla comparsa di fenotipi beta talassemici di varia entità. Allo scopo di caratterizzare da un punto di vista funzionale il difetto molecolare individuato,si è clonato il frammento di DNA in cui cade la mutazione nel vettore plasmidico pGEM T-easy.Sono stati svolti esperimenti di mutagenesi sito specifica volti ad ottenere costrutti contenenti le altre mutazioni già note in letteratura e che cadono in questa regione del promotore.I frammenti ottenuti sono stati clonati nel vettore di espressione PGL4 allo scopo di effettuare saggi funzionali,utilizzando il gene reporter della luciferasi. I risultati ottenuti da questi esperimenti indicano che la nuova mutazione -30(T->G)determina una riduzione dell'attività trascrizionale del promotore b-globinico rispetto al promotore wild-type.Tale riduzione è ,inoltre, leggermente superiore a quella della altre due mutazioni finora riportate nella TATA BOX (-30T->A E -30 T->C) .Questi studi potrebbero contribuire a chiarire i meccanismi di regolazione dell'espressione dei geni globinici ,ai fini anche di un eventuale sviluppo di nuovi approcci terapeutici nel trattamento delle emoglobinopatie.
LinguaItaliano
Data di uscita19 mar 2012
ISBN9788863697025
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    IDENTIFICAZIONE E CARATTERIZZAZIONE FUNZIONALE DI UNA NUOVA MUTAZIONE BETA TALASSEMICA - VALENTINA ILARDI

    Bibliografia

    1.INTRODUZIONE

    1.1 STRUTTURA E FUNZIONE DELL’Hb

    L’emoglobina è una proteina globulare deputata al trasporto dell’O2 nel sangue dei vertebrati. Essa, infatti, è contenuta nei globuli rossi cui conferisce loro il caratteristico colore rosso. La sintesi dell’emoglobina, che avviene nel midollo osseo, inizia a livello dei proeritroblasti policromatofili e continua, in misura minore, anche nei reticolociti che conservano ancora ammassi ribosomici deputati alla sintesi della molecola (1).

    La produzione di questa cromoproteina necessita di tre eventi: la sintesi delle catene globiniche, la formazione di protoporfirina IX e la captazione del ferro.

    L’emoglobina, infatti, è un’emoproteina coniugata dal peso molecolare di 64 kDa, costituita da una frazione proteica ad alto peso molecolare, rappresentata da quattro catene globiniche, e da una frazione non proteica ovvero da quattro gruppi prostetici, detti eme, dal peso molecolare di 616 dalton e contenenti un atomo di ferro (2) (Fig.1).

    Nella globina vi sono due coppie di unità polipeptidiche, ciascuna formata da otto eliche (denominate da A a H) e assemblate in forma pressocchè sferica, in cui ogni catena è portatrice del gruppo prostetico eme contenente un atomo di ferro.

    L’eme è una ferro-protoporfirina 9 con un atomo di Fe bivalente (Fe++) che ha sei valenze di coordinazione, di cui quattro legano l’azoto dei quattro anelli pirrolici che costituiscono l’eme e le rimanenti due sono legate l’una al gruppo imidazolico di un residuo istaminico della globina, e l’altra è atta a legare l’ossigeno (Fig.2). In tal modo l’eme è sospeso in un interstizio di forze non polari (tasca) della globina e ciò rende possibile la formazione di un legame reversibile del ferro con l’ossigeno senza che esso venga ossidato alla forma ferrica (Fe+++).

    Fig.1: Struttura quaternaria dell’emoglobina

    Fig.2: Ferroprotoporfirina (EME)

    Le quattro catena globiniche si combinano nella struttura quaternaria della proteina in modo da formare un tetraedro regolare di circa 6,0 nm di diametro. Con l’inserimento e la cessione dell’ossigeno si determinano due strutture quaternarie: una per la forma ossigenata (forma T) e una per la forma deossigenata (forma R).

    La proprietà del tetrametro di passare dalla configurazione sterica T (tesa, cioè ove le quattro singole molecole sono strette tra loro) che possiede una bassa affinità per l’O2, alla configurazione rilasciata (R) avente forte affinità per l’O2, si chiama effetto cooperatore; questo permette una cessione di O2 adeguata alle necessità cellulari secondo la normale tensione di esso. L’effetto cooperatore, consistente nella capacità di passare dalla forma a scarsa affinità, man mano che l’O2 si lega all’eme, alla forma a forte affinità, agevola la saturazione in O2 a livello dei polmoni; viceversa nei tessuti, l’effetto cooperatore agevola la cessione dell’O2 alle cellule, man mano che l’Hb, persi i primi atomi di O2, prende la forma a bassa affinità (3).

    Il diverso pH tissutale e la presenza di 2,3-disfosfoglicerato (2-3-DPG) all’interno dell’eritrocita influenzano l’affinità per l’O2, cioè la fissazione e la liberazione di esso. Con l’aumento dell’acidità a livello dei tessuti per l’accumulo di anidride carbonica, il pH è più basso che nel sangue arterioso, e ciò facilita il trasferimento dell’O2. Anche il 2,3-DPG fa diminuire l’affinità per l’ossigeno dell’emoglobina, perché si lega ad essa solo quando è nello stato deossigenato. Ceduto l’O2 nei tessuti, l’Hb fissa la CO2 diventando solo per il 30% circa carbamino-Hb. Attraverso la parete alveolare ogni molecola di Hb fissa una molecola di O2, per ogni suo gruppo eme, e diventa ossiemoglobina (HbO2); questo avviene per diffusione attraverso l’epitelio dell’alveolo, l’endotelio del capillare, il plasma sanguigno e la membrana

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