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La trasformazione genica un insieme di tecniche che permettono : linserimento di un gene esogeno di interesse allinterno di un genoma ospite la sua integrazione stabile allinterno del genoma ospite la sua espressione corretta nel sistema della cellula ospite la sua trasmissione mendeliana alla progenie
La prima cellula vegetale resistente agli antibiotici stata prodotta dalla Monsanto nel 1982. La prima pianta trasgenica stata invece prodotta nelluniversit belga di Gent nel 1983
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1. per verificare e studiare attraverso lintroduzione e lespressione specifica di geni nelle cellule vegetali, ipotesi concernenti la funzione del loro prodotto genico (genomica funzionale)
2. da un punto di vista applicativo, produrre linee di piante in grado di esprimere geni per caratteri pi desiderabili da un punto di voista agronomico
Il metodo di trasformazione ideale deve : essere efficiente indipendente dalla specie vegetale e dal genotipo veloce semplice poco costoso prevedere fasi di coltura in vitro il pi limitate possibili
Agrobatterio
Piano delle lezioni: Informazioni generali su Agrobatterio Sintomi Storia Le opine La galla del colletto Ceppi virulenti e avirulenti Basi genetiche e molecolari della formazione della galla Plasmide Ti T-DNA Geni vir Il trasferimento del T-DNA Geni citochinino-simile, geni auxino-simili, opine Agrobatterio come strumento per la ingegnerizzazione delle ceclluel vegetali
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Agrobacterium tumefaciens
la presenza continua del batterio non necessaria per la crescita delle cellule della galla, che continuano a proliferare in vitro in maniera rapida e indefinita anche dopo la rimozione del batterio.
Le cellule della galla mostrano la sorprendente capacit di crescere anche in assenza di fitoormoni
Esse secernono composti del tutto sconosciuti alle normali cellule vegetali: le opine.
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1976 Esistono ceppi di Agrobatterio virulenti e non virulenti Tutti i ceppi virulenti possiedono, oltre il normale DNA batterico, anche un plasmide di grosse dimensioni.
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ceppo avirulento
ceppo virulento
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Agrobatterio sfrutta i meccanismi di difesa delle piante per individuare piante potenzialmente suscettibili a infezione.
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Il Plasmide Ti
opine
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Il Plasmide Ti
LB
T-DNA
RB
Il T-DNA la sola parte del plasmide Ti che viene trasferita allinterno della cellula vegetale. E il solo elemento mobile. Mutazioni in questa regione provocano tumori con morfologie alterate.
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Tutto il DNA fra esse compreso viene trasferito alla cellula vegetale.
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Una regione esterna al T-DNA responsabile del trasferimento del TDNA. Tale regione detta vir. Essa non viene trasferita e quindi agisce in trans. Il T-DNA un elemento mobile ma non trasponibile, in quanto non codifica per prodotti capaci di mediare il suo proprio trasferimento. Mutazioni in questa regione annullano la formazione della galla.
Il numero di geni per operone diverso da operone a operone: virA, virG e virF hanno 1 gene virE, virC e virH virD ha 4 geni hanno 2 geni
virB ha 7 geni
I soli operoni espressi costitutivamente sono virA e virG
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Il meccanismo di infezione
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Rafforzamento del legame: sintesi di filamenti di cellulosa che provocano una stretta associzione batteriocellula vegetale
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Le proteine di Agrobacterium implicate nell'ancoraggio alla cellula vegetali sono i prodotti genici di un insieme di geni: chvA, chvB: Sintesi e secrezione dei polisaccaridi coinvolti nelladesione alle cellule vegetali Att: Legame con recettori (carboidrati e proteine) della parete della cellula vegetale cell Biosintesi di cellulosa coinvolta nella aggregazione e colonizzazione
cell
Geni cromosomiali di Agrobatterio che partecipano alla trasmissione del T-DNA nelle cellule vegetali 27
Plant vitronectin is only immunologically related to animal vitronectin. Animal vitronectin is an important component of the extracellular matrix and is also an receptor for several bacterial strains
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Quorum sensing in
Agrobacterium tumefaciens
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2. Riparo del punto di lesione con sintesi di polisaccaridi i parete e di lignina. Questo processo accompagnato da sintesi di zuccheri, composti fenolici (lignina e precursori di flavonoidi)., flavonoidi, pH acido (5.0 to 5.8) (le monocotiledoni meno). Fra i composti fenolici, ci sono acetosiringone e idrossiacetosiringone. 3. Intensa divisione cellulare (le monocotiledoni no)
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VirA kinase forms a dimer in vivo. This kinase has four domains: periplasmic, linker, kinase (phospho-donor and phosphoacceptor), and receiver. Each VirA kinase molecule phosphorylates the phosphoacceptor domain of the opposite subunit. The VirA kinase Periplasmic domain detects sugar with ChvE. Linker domain detects phenolic compounds and acidity. Receiver domain inhibit the complex through its phosphodonor domain
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AS, acetosyringone.
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Bacterial 2-Component Signal Transduction Systems 1. Component 1 : Sensor kinase i) Substrate receptor, signal recognition domain, input domain (periplasmic) ii) Signal transduction domain, membrane spanning region iii) Autokinase domain, phosphorylation domain (cytoplasmic) a) ATP binding (sub) domain b) phosphorylation-phosphotransfer (sub)-domain
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2. Component 2 : Response regulator i) Phosphorylation domain ii) DNA binding domain Simplest case: transcriptional activator when phosphorylated
First component is typically (auto)-phosphorylated on a His residue and transfers to a Asp group on the response regulator (second component).
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vir genes are silent in the absence of the host, but virA and vir G are constitutively transcribed at a low level
GUS staining can only be observed in ovaries 5 Agrobacterium infect the ovaries of days after inoculation flowers and is vanished 12 days after inoculation.
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Because the gynoecium of Arabidopsis were formed by two carpels How can Agrobacterium infects the and they remained ovaries of flowers? separated until three days before anthesis (flowering).
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