Sei sulla pagina 1di 41

Biotecnologie vegetali

La trasformazione genica un insieme di tecniche che permettono : linserimento di un gene esogeno di interesse allinterno di un genoma ospite la sua integrazione stabile allinterno del genoma ospite la sua espressione corretta nel sistema della cellula ospite la sua trasmissione mendeliana alla progenie

La prima cellula vegetale resistente agli antibiotici stata prodotta dalla Monsanto nel 1982. La prima pianta trasgenica stata invece prodotta nelluniversit belga di Gent nel 1983
1

Le piante transgeniche sono uno strumento:

1. per verificare e studiare attraverso lintroduzione e lespressione specifica di geni nelle cellule vegetali, ipotesi concernenti la funzione del loro prodotto genico (genomica funzionale)

2. da un punto di vista applicativo, produrre linee di piante in grado di esprimere geni per caratteri pi desiderabili da un punto di voista agronomico

Il metodo di trasformazione ideale deve : essere efficiente indipendente dalla specie vegetale e dal genotipo veloce semplice poco costoso prevedere fasi di coltura in vitro il pi limitate possibili

Agrobacterium tumefaciens "Nature's Genetic Engineer"

Agrobatterio
Piano delle lezioni: Informazioni generali su Agrobatterio Sintomi Storia Le opine La galla del colletto Ceppi virulenti e avirulenti Basi genetiche e molecolari della formazione della galla Plasmide Ti T-DNA Geni vir Il trasferimento del T-DNA Geni citochinino-simile, geni auxino-simili, opine Agrobatterio come strumento per la ingegnerizzazione delle ceclluel vegetali
5

Classificazione sistematica di Agrobatterio


suddivisione -proteobatteri famiglia Rizobiacee genere Allorhizobium Mesorhizobium Sinorhizobium Rhizobium Azorhizobium Bradyrhizobium Agrobacterium specie

Tumefaciens Rizogenes Rubi Vitis Radiobacter

Full genome sequences


A. tumefaciens C58 (bv. 1) in 2001 A. vitis S4 (bv. 3) A. radiobacter K84 (bv. 2)

Agrobatterio un batterio gram-negativo del suolo. Infetta:


circa 600 dicotiledoni 42 gimnosperme

5 monocotiledoni (nessuna di interesse agronomico)

10

11

12

Agrobacterium tumefaciens

Intorno al 1950 si osserv che:

la presenza continua del batterio non necessaria per la crescita delle cellule della galla, che continuano a proliferare in vitro in maniera rapida e indefinita anche dopo la rimozione del batterio.

Le cellule della galla mostrano la sorprendente capacit di crescere anche in assenza di fitoormoni

Esse secernono composti del tutto sconosciuti alle normali cellule vegetali: le opine.
13

1976 Esistono ceppi di Agrobatterio virulenti e non virulenti Tutti i ceppi virulenti possiedono, oltre il normale DNA batterico, anche un plasmide di grosse dimensioni.

14

ceppo avirulento

ceppo virulento

15

Ceppi non virulenti trasformati con questo plasmide diventano


virulenti.

16

Un ceppo virulento, privato di questo plasmide, incapace di produrre tumori.

Questo plasmide fu detto plasmide Ti (tumor-inducing).


17

Cosa sappiamo oggi ?

Il meccanismo di infezione estremamente complesso.

Agrobatterio sfrutta i meccanismi di difesa delle piante per individuare piante potenzialmente suscettibili a infezione.

18

Il Plasmide Ti

Il plasmide Ti scomponibile in blocchi funzionali

Il Ti un plasmide di grosse dimensioni: 200-800 kbp


Il T-DNA misura circa 10--30 Kb.

opine

19

Il Plasmide Ti

LB
T-DNA

RB

Il T-DNA la sola parte del plasmide Ti che viene trasferita allinterno della cellula vegetale. E il solo elemento mobile. Mutazioni in questa regione provocano tumori con morfologie alterate.

20

LB e RB sono sequenze pressoch identiche di 25 paia di basi,

Tutto il DNA fra esse compreso viene trasferito alla cellula vegetale.

21

22

Una regione esterna al T-DNA responsabile del trasferimento del TDNA. Tale regione detta vir. Essa non viene trasferita e quindi agisce in trans. Il T-DNA un elemento mobile ma non trasponibile, in quanto non codifica per prodotti capaci di mediare il suo proprio trasferimento. Mutazioni in questa regione annullano la formazione della galla.

vir A, vir B, vir C, vir D, vir E, virG sono operoni essenziali


virF, virH sono operoni inessenziali La regione vir un segmento di 40 kb che contiene 25 geni classificabili in 8 operoni che codificano per funzioni essenziali per il trasferimento del T-DNA allinterno della cellula vegetale:
23

Il numero di geni per operone diverso da operone a operone: virA, virG e virF hanno 1 gene virE, virC e virH virD ha 4 geni hanno 2 geni

virB ha 7 geni
I soli operoni espressi costitutivamente sono virA e virG

24

Il meccanismo di infezione

25

Il meccanismo di attacco un processo in due step

Adesione : con sintesi e secrezione di polisaccaridi per lancoraggio

Rafforzamento del legame: sintesi di filamenti di cellulosa che provocano una stretta associzione batteriocellula vegetale

26

Le proteine di Agrobacterium implicate nell'ancoraggio alla cellula vegetali sono i prodotti genici di un insieme di geni: chvA, chvB: Sintesi e secrezione dei polisaccaridi coinvolti nelladesione alle cellule vegetali Att: Legame con recettori (carboidrati e proteine) della parete della cellula vegetale cell Biosintesi di cellulosa coinvolta nella aggregazione e colonizzazione
cell

chv = chromosomal virulence

Geni cromosomiali di Agrobatterio che partecipano alla trasmissione del T-DNA nelle cellule vegetali 27

I recettori vegetali sembrano proteine simili alle vitronectine

Plant vitronectin is only immunologically related to animal vitronectin. Animal vitronectin is an important component of the extracellular matrix and is also an receptor for several bacterial strains

28

Plant Pathology. G.N. Agrios. 2005

29

30

Quorum sensing in

Agrobacterium tumefaciens

31

Le dicotiledoni rispondono a ferita attivando molteplici strategie di difesa:

1.

Produzione e secrezione di composti antimicrobici per prevenire linfezione da parte di microrganismi.

2. Riparo del punto di lesione con sintesi di polisaccaridi i parete e di lignina. Questo processo accompagnato da sintesi di zuccheri, composti fenolici (lignina e precursori di flavonoidi)., flavonoidi, pH acido (5.0 to 5.8) (le monocotiledoni meno). Fra i composti fenolici, ci sono acetosiringone e idrossiacetosiringone. 3. Intensa divisione cellulare (le monocotiledoni no)

32

VirA kinase forms a dimer in vivo. This kinase has four domains: periplasmic, linker, kinase (phospho-donor and phosphoacceptor), and receiver. Each VirA kinase molecule phosphorylates the phosphoacceptor domain of the opposite subunit. The VirA kinase Periplasmic domain detects sugar with ChvE. Linker domain detects phenolic compounds and acidity. Receiver domain inhibit the complex through its phosphodonor domain
33

AS, acetosyringone.

34

Bacterial 2-Component Signal Transduction Systems 1. Component 1 : Sensor kinase i) Substrate receptor, signal recognition domain, input domain (periplasmic) ii) Signal transduction domain, membrane spanning region iii) Autokinase domain, phosphorylation domain (cytoplasmic) a) ATP binding (sub) domain b) phosphorylation-phosphotransfer (sub)-domain

35

2. Component 2 : Response regulator i) Phosphorylation domain ii) DNA binding domain Simplest case: transcriptional activator when phosphorylated
First component is typically (auto)-phosphorylated on a His residue and transfers to a Asp group on the response regulator (second component).

The EnvZ/OmpR System of E. coli


36

37

vir genes are silent in the absence of the host, but virA and vir G are constitutively transcribed at a low level

VirG interacts with the vir box to activate transcription.

Vir box contains a

conserved 12bp sequence NCAATTGAAA Py which VirG may bind as dimer.


38

Transformation of Arabidopsis is very easy!


1. Transformation

2. Collect seeds 3. Select for transgenic plants Before After


39

GUS staining can only be observed in ovaries 5 Agrobacterium infect the ovaries of days after inoculation flowers and is vanished 12 days after inoculation.

40

Because the gynoecium of Arabidopsis were formed by two carpels How can Agrobacterium infects the and they remained ovaries of flowers? separated until three days before anthesis (flowering).

41