EFECTO DE ALANINA Y GLICINA EN EL MEDIO DE CULTIVO SOBRE EL DESARROLLO DE EMBRIONES BOVINOS PRODUCIDOS IN VITRO

SEMILLERO BIOTECNOLOGIA DE LA REPRODUCCION ANIMAL

Andrs Camilo Lpez

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Introduccin
Haga clic para modificar el estilo de La transferencia de embriones producidos in vitro subttulo del patrn
en nuestro medio. Esta tcnica, que consta de varios procesos consecutivos no es del todo eficiente, debido a la el ambiente ideal para el (PIV)

es la biotecnologa reproductiva de mayor crecimiento

complejidad de imitar

oocito y para el embrin en formacin. La tasa de produccin promedio es de 37-38%, lo cual evidencia una prdida importante de este material gentico en aquellas estructuras 6/11/12 que no logran

Planteamiento del Problema

La baja produccin in vitro relacionada con el bloqueo del clivaje en el desarrollo temprano y que causa apoptosis o muerte embrionaria; este bloqueo es desencadenado por los elevados niveles de radicales libres derivados del metabolismo in vitro y que ocasionan un dao grave a nivel celular.

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Objetivo general

Evaluar el efecto de Alanina y Glicina en diferentes concentraciones en el medio de cultivo sobre el desarrollo de embriones bovinos producidos in vitro.

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Objetivos especficos

1.

Evaluar

el

efecto

de

tres

diferentes

concentraciones de Alanina y Glicina en el medio de desarrollo sobre el clivaje de embriones bovinos in vitro.

2.

Evaluar

el

efecto

de

tres

diferentes

concentraciones de Alanina y Glicina en el medio de desarrollo sobre el porcentaje de embriones que alcanzan el estadio de Mrula -- Blastocisto.

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Objetivos especficos

3.

Evaluar

el

efecto

de

tres

diferentes

concentraciones de Alanina y Glicina en el medio de desarrollo sobre el porcentaje de embriones en eclosin.

4.

Evaluar

el

efecto

de

tres

diferentes

concentraciones de Alanina y glicina en el medio de cultivo sobre la calidad de los embriones PIV a travs de la tincin de Tunel.

5.

Evaluar

el

efecto

de

tres

diferentes

concentraciones de Alanina y glicina en el medio de cultivo sobre la formacin de glutatin por el embrin.
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Referente terico

Segn lo descrito por Sreenan y Diskin (1994), la tasa de fertilizacin despus de que la vaca ha sido servida puede ser de un 90%, mientras que la tasa de paricin promedio para un mismo servicio puede ser inferior al 50% (Humblot 2001), gran parte de esta prdida es el resultado de la mortalidad embrionaria que ocurre entre los das 8 y 18 despus de la reproduccin (Sreenan et al., 2001). Entre los das 18 y 50, ms del 10-15% de los embriones mueren.

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Referente terico

En estudios recientes, se ha documentado que, la principal causa de mortalidad embrionaria temprana eta asociada a alteraciones metablicas, ocasionadas por grupos de radicales libres, producto de los procesos metablicos oxidativos y que no son debidamente eliminados por los mecanismos barredores propios del embrin provocando en l, un bloqueo en el proceso de divisin celular, sobre todo en el paso de 8 16 clulas.

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Referente terico
Los aminocidos juegan un papel importante como osmoltos, tampones intracelulares, quelantes de metales pesados y fuentes de energa; tambin funcionan como precursores para reguladores fisiolgicos como el oxido ntrico y poliaminas (Elhassan 2001). Alanina y glicina se sabe que son dos de los principales aminocidos en medios que contienen clulas del oviducto bovino, las altas concentraciones de estos aminocidos estn presentes en el oviducto de mamferos. Tambin se sabe que alanina y glicina participan en rutas metablicas importantes para el mantenimiento de la competencia del embrin ( Bondioli
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Referente terico
La Glicina y Alanina son considerados osmoltos orgnicos o zwiterinicos que protegen contra el dao por cambios en la osmolaridad, que son causados por la acumulacin de NaCl durante el cultivo (Kerri 1997). La glicina ayuda a mantener el equilibrio acido-base y la estabilidad del pH intracelular. La alanina por su parte, es un aminocido con alta tasa de recambio y considerado como un importante osmoprotector (Kerri 1997 2007)
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METODOLOGI Tipo de estudio A Tipo experimental.

Localizacin
Laboratorio

de Biotecnologa de la Reproduccin

animal LABRA

Tamao de la Muestra
Los oocitos se distribuirn al azar en grupos de 20 en cuatro cultivos, con ocho repeticiones para el proceso de maduracin, fertilizacin y cultivo in vitro.
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Recoleccin
Los ovarios sern obtenidos en el
Haga clic para modificar el estilo de matadero municipal de Ceret, Los subttulo del patrn

oocitos sern colectados por el mtodo de aspiracin directa de los folculos que tenan entre 2 y 5 mm de dimetro
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Fertilizacin in vitro
Despus de la maduracin, los oocitos sern lavados tres veces en medio de fertilizacin TAL FERT suplementado con 10 g/ml de heparina y PHE (0.25 mM epinefrina, 1 mM hiptaurina, 3 mM penicilamida).

Cultivo in vitro de
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LOS MEDIOS DE CULTIVO EMBRIONARIO

v

T. 1: Medio base sin suplemento de Alanina ni Glicina (control).

T. 2: Medio base suplementado con 5 mM de Alanina y 10 mM de Glicina.

T. 3: Medio base suplementado con 10 mM de Alanina y 20 mM de Glicina.

T. 4: Medio base suplementado con 20 mM de Alanina y 30mM de Glicina.

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Evaluacin Embrionaria Temprana (Estado 2-8 Clulas)

Se realizar de manera directa el da 3 del cultivo, mediante observacin con estereoscopio, se evaluaran las tasas de divisin de 2 a 8 clulas.

Evaluacin Embrionaria al Estado de Mrula-Blastocito.

6/11/12 Ser realizada de forma directa en un

Evaluacin de Blastocistos Eclosionados

La evaluacin de la tasa de blastocistos eclosionados se determinar de forma directa bajo un estereoscopio, el da 9 pos inseminacin.

Anlisis estadstico
Los resultados correspondientes a la tasa de desarrollo embrionario, sern analizados a travs de un anlisis de varianza (ANAVA), y se establecern diferencias significativas por medio de la prueba de Duncan.

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Referencias Bibliograficas

Elhassan, Y.M., Wu, G., Leanez, A.C., Tasca, R.J., Watson, A.J. and Westhusin, M.E. (2001) Amino acid concentrations in fluids from the bovine oviduct and uterus and in KSOM-based culture media. Theriogenology 55, 19071918. Kerri MD, Baltz JM. Organic Osmolytes and Embryos: Substrates of the Gly and Transport Systems Protect Mouse Zigotes against the effects of raised Osmolarity. Biol Reprod 1997. Bondioli, K.R., Hawk,H.W.and Wall, R.J. (1995) Effect of glycine and alanine on co-culture of bovine blastocysts. Theriogenology 43, 170.

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GRACIAS POR SU ATENCION

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