MTODOS INSTRUMENTALES DE ANLISIS

APLICACIONES BIOLGICAS
CROMATOGRAFIA

INTRODUCCION A LAS SEPARACIONES
CROMATOGRAFICAS
Caractersticas bsicas de anlisis qumico

Sensible

Selectivo

Especfico (pocos casos)

DESCRIPCION GENERAL
Mikhail Tswett
1906
CROMATOGRAFIA (chroma-color y graphein-escribir)
Las primeras unidades
cromatogrficas de M.
Tswett para el anlisis de
pigmentos vegetales.

CLASIFICACION

Sgn. la manera en que la fase movil y la fase

estacionarias se ponen en contacto

Cromatografia en columna (FM: liquido, gas, fluido

supercritico)

Cromatografia plana (FM: liquido)

Sgn. tipo de fase movil y estacionaria, y los procesos de

transferencia de los solutos entre las fases

Cromatografia de liquidos (FM: liquido)

Cromatografia de gases (FM: gas)

Cromatografia de fluidos supercriticos (FM: fluido

supercritico)

Cromatografia en columna
Blas. Gral. F. Movil F. Estacionaria Fenomeno de interaccion
LC Liquido L-L Distribucion entre liquidos
inmiscibles
L-fase enlazada Distribucion entre liquido y
superficie enlazada
L-S Adsorcion
Intercambio ionico Intercambio ionico
Exclusion por tamano Distribucion / Exclusion
L-receptor Adsorcion por afinidad
GC Gas G-L Distribucion entre gas y liquido
G-fase enlazada Distribucion entre gas y superficie
enlazada
G-S Adsorcion
SFC Fluido
supercritico
Distribucion entre fluido supercritico
y superficie enlazada

BASES DE LA SEPARACION

Fig. 3.1 y 3.2 Q

Interacciones posibles
que condicionan la
afiniadad de los distintos
componentes

Hidrofobicas

Hidrofilicas

Puente hidrogeno

Dipolares

Electrostaticas

Constante de distribucion:

[ ] M
C
C
K
A
m
A
e
A
;

NOMENCLATURA

Cromatograma

Linea de base

Volumen de elucion: V
i

Tiempo de retencion:
t
Ri

Tiempo de retencion
corregido: t
Ri
=t
Ri
-t
0

Volumen de F. Movil: V
0

Tiempo de elusion de
F. Movil: t
0

Fig 3.4 q

VELOCIDAD DE MIGRACION DE LOS
COMPONENTES

Velocidad lineal media:

Velocidad lineal media del

analito:

Factor de capacidad: k
i

Relacion entre K y t
R

Relacion entre k y vel.

lineal

Factor de selectividad:
1
]
1

m in
;
cm
t
L
R
v
[ ]
min
0
;
cm
t
L
u
m
e
V
V
K
u v
+

1
1
0
0
'
t
t t
k
R

'
'
A
B
k
k

'
1
1
k
u v
+

CARACTERIZACION DE k y
k

K adecuado:

2-10 (pocos analitos)

0,5-20 (muchos analitos)

Ajustes de k mediante fuerza

de elusion de F. Movil:
modificacion de la proporcion
del solvente de F. Movil de
mayor afinidad con los
analitos

Cambio en la proporcion del

componenete activo de la F.
Movil

referencia: 1

depende de la afinidad del

analito con la F. Movil y la F.
Estacionaria

Ajustes de a variando la
interaccion entre el analito-F.
Movil-F. Estacionaria:

Cambiando componente
activo de la F. Movil
(MeOH, ACN)

Variacion de pH de F.
Movil

Agregados de aditivos

Cambio de Fase
estacionaria

ENSANCHAMIENTO DE BANDA EFICIENCIA
DE LA COLUMNA

Numero de platos teoricos:

N

Altura de plato teorico: H

Sgn. Martin y Synge

(picos gausianos
simetricos)

Sgn. Foley y Dorsey

(picos gausianos
asimetricos)

Fig 3.5 y 3.7Q

2
5 , 0
'
2
'
545 . 5 ; 16

,
_

,
_

W
t
N
W
t
N
R R
H
L
N
25 . 1
7 . 41
2
1 , 0
+

,
_

A
B
W
t
N
R

FACTORES QUE AFECTAN A H Y N

PROPIO DE COLUMNA

Particulas de la F.
Estacionaria

Diametro

Morfologia

Calidad de particula

Empacamiento de la F.
Estacionaria

Calidad

Envejecimiento

Canales (producido por

golpes)

EXTERNO A COLUMNA

Tuberias

Longitud

Diametro

Detector

Volumen

Geometria

Geometria del pico

Anterior

Posterior

UTILIDAD DE N Y H

Comparacion de materiales y metodos bajo iguales

condiciones de trabajo

Optimizacion de metodo analitico

Control de idoneidad de un metodo analitico

Control del estado de la columna durante su vida util

PROCESOS DE ENSANCHAMIENTO DE
BANDAS

Ensanchamiento de banda intracolumnar (H)

Caudal de fase movil

Difusion longitudinal

Resistencia a la transferencia de masas en la F.

Estacionaria

Resistenca la transferencia de masas en la F. Movil

Proceso multipasos

Ensanchamiento de banda extracolumnar (

2
)

Detector

Volumen de las partes del cromatografo entre el

inyector y el detector

Volumen de inyeccion

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Caudal de fase movil

Magnitud de efectos cineticos

dependen del tiempo de
contacto entre FE y FM

Los H
min
para LC se dan a
caudales menores que para
GC debido a los caudales de
trabajo

En general H
LC
<H
GC

Longitud de columnas de
LC<<GC => eficiciencia
GC>>LC

Fig 24.7 SL

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Difusion longitudinal

Difusion de analitos desde

zonas mas concentradas a
mas diluidas

El ensanchamiento long. se
produce en la direccion del
flujo de la FM

A > u < tiempo de residencia

del analito < difusion

B/u
L
0; B/u
G
>0

Fig 24.7 SL
u
D k
u
B
M D
2

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Coeficientes de trasferencia de masa (C
E
y C
M
)

El equilibrio de particion entre las dos fases es MUY

LENTO por lo que siempre se trabaja fuera del equilibrio.
Las moleculas mas afectadas son las que se encuentran
en el frente o cola de la banda.

Los analitos necesitan tiempo para difundir desde el

interior de las fases hasta la interfase donde se produce
el reparto

El ensanchamiento long. se produce perpendicular a la

direccion del flujo de la FM

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Transferencia de masas en la F. Estacionaria

L-L: C
E
es directamente proporcional al cuadrado del
espesor de pelicula inmobilizada e inversamente
proporcional a la velocidad de difusion del analito

L-S: C
E
es directamente proporcional al tiempo necesario
para adsorberse/desorberse de la superficie solida e
inversamente proporcional a la constante de velocidad de
primer orden con que se da este proceso
E
f
E
D k
u d qk
u C
L
2 '
2 '
) 1 ( +

2 '
'
) 1 (
2
k
u k t
u C
D
E
S
+

Ensanchamiento de banda intracolumna
Transferencia de masas en la F. Movil

Proceso muy complejo. Solo se conocen las variables

que lo gobiernan. Velocidad de transferencia de masa:

Inversamente proporcional a la velocidad de difusion

del analito en la fase movil

Directamente proporcional al cuadrado del diametro de

la particula de la soporte solido

Directamente proporcional a la velocidad lineal de la F.

Movil
u
D
u d f
u C
M
p
M
) , (
2

Ensanchamiento de banda intracolumna
Difusion de Eddy (proceso multipaso)

Multitud de caminos posibles por donde puede atravesar el

analito.

A u > nro de transferecia de caminos por lo que la

velocidad analito tiende velocidad media

A u
mod
< nro de transferecia de caminos por lo que habra
mayor ensanchamiento de banda

A u el efecto de ensanchamiento de banda por multiplicidad

de caminos es independiente del caudal.

Fig 24.8 SL y 3.8 Q

Ensanchamiento de banda intracolumna
Difusion de Eddy

Fracciones de F. Movil estancada en fase estacionaria: el

analito debe difundir de los liquidos estancados antes que
pueda producirse la transferencia con la F. Movil en
movimiento y la F. Estacionaria:

Fenomeno directamente proporcional u

Fenomeno inversamente proporcional a la D

M

Fenomeno directamente proporcional al diametro de

particulas debido a que aumenta el tamano de poro

Ensanchamiento de banda intracolumnar
Ecuacion de Van Deemter

Variable influyentes en el
ensanchamiento de bandas

Diametro de particulas

Viscosidad de la F. Movil

Diametro de columna

Mejor empacamiento de
columna

Temp.: reduce D

Grosor de la F.
Estacionaria

Fig. 24.9 y24.10 SL

u C u C
u
B
H
M E
+ +

Ensanchamiento de banda extracolumnar

Dispersion del pico:

T
2

En la
T
2
,
ec
2
es constante. Esto implica que el
ec
2
es mas
relevante:

Para picos poco retenidos

H pequenos

Menor radio de la columna

porosidad HL r
T T ic
inyeccion ector uniones tuberia ic T
ec ic T
: ; ) (
2 2 2
2 2
det
2 2 2 2
2 2 2

+ + + +
+

Ensanchamiento de banda extracolumnar
Detector

Contribuciones:

Componenete hidraulicos:

Tuberia y uniones:

Longitudes minimas

Diametros minimos

Volumen de celda: 1/10 volumen del pico

Geometria de celda: tal que evite turbulencias

Componente electronico

Constante de tiempo (): 10% W

muy pequena (rta. rapida): senal ruidosa

muy elevada (rta. lenta): perdida del pico,

aplastamiento o confusion con el adyacente

Ensanchamiento de banda extracolumnar
Volumen de partes del cromatografo (inyector
detector); Volumen de inyeccion

Volumen de partes del cromatografo (inyector detector)

Longitudes y diametros de tuberias y conexiones

minimos

Efecto menos notorios para picos con k elevados

Volumen de inyeccion:

V
iny.max.
2
=(

Kr
2
)
2
HL

: incremento de variancia permitido (5%)

K: cte. Dependiente del perfil de inyeccion (K

2
=12,
perfil de inyeccion normal)

Valores recomendados:

Dolan: 1/6 volumen del pico de interes

Novotny: 17 l, col. Convencionales y 1.7 l para

col. microbore

OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA

Finalidad: lograr separacion de analitos en el menor

tiempo posible mediante:

Reduccion de ensanchamiento de picos: H

Modificacion de la velocidad relativa de migracion: y

k

Resolucion: medida cuantitativa de la capacidad de

separacion

R=1,5: separacion completa de 2 analitos

R=0,75: separacion incompleta de 2 analitos

Fig 24.11 SL
2 2
B A
W W
z
R
+

OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA

Influencia de la R sobre el t
B

Efectos cineticos que contribuyen al ensanchamiento

de bandas

Termino de selectividad que depende del analito

Termino dependiente del analito y la columna

Factores termodinamicos que no dependen de N ni L

Influencia de k y sobre R
4
1
1
'
'
N
k
k
R
B
B

,
_

,
_

( )
( )
2
2
'
3
' 2
1
1 16

,
_

B
B
B
k
k
u
R H
t

OPTIMIZACION DE EFICIENCIA DE COLUMNA

Efecto de la variacion de k
sobre R
Q
k
k
R
B
B

,
_

1
'
'
( )
( )
3
2
'
'
'
1
B
B
B
k
k
Q t
+

Orden de variacion:
1. N
2. k
1.

APLICACIONES: ANALISIS CUALITATIVO

Mediante identificacion de picos

En funcin datos cromatograficos solamente

Tiempo de retencion

Grafica de Log t
R
vs. Nro. de atomos de carbono

Indice de Kovats

Multiples columnas

Respuesta de dectores relativas

Pretratamiento de muestra

Cromatografias secuenciales

En funcin datos cromatograficos y otros datos

Analisis de grupos funcionales y elementales

Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas

Retencion de picos

Sin identificacion de picos

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de tiempo de retencion
Principios fundamentales de la identificacion
1. Si el t
R
de un componenete A es igual al del
componenete desconocio, esto no prueba que el
compuesto desconocido es el componente A
2. Si el t
R
de un componenete A no es igual al del
componenete desconocio, esto prueba que el
compuesto desconocido no es el componente A
3. Si no se observa ningun pico al t
R
del compuesto A,
esto prueba que el componente A no esta presente en
la muestra, al menos a los niveles de deteccion de la
tecnica

Factores a tener en cuenta en la precision de los datos

Control de temperatura

1% repetividad en t
R
, debe mantenerse la T en 0.3
o
C

Control de flujo del F. Movil

1% de variacion de flujo afectara 1% el t

R

Volumen de inyeccion

Sobrecarga varia los t

R

Empaque, cantidad de F. Estacionaria, antigedad, usos

previos, etc.
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de tiempo de retencion

t
r
= f(condiciones experimentales)
Comparacin anlito y compuesto de referencia analizado igual
condiciones
Ms aconsejable aadirlo a la mezcla
Cpto no
retenido
Cpto referencia
Analito
t
m
t
R(S)
t
R(a)
t
R
= t
R
- t
m
r(a,s) = t
R
(a)/t
R
(s)
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de tiempo de retencion

Basada en la dependencia lineal entre entre Log t

R
y Nro.
de atomos de carbono de una serie homologa

Sencilla de armar: basta con 2 puntos

Fig 7.3, pag399,Grob

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de grafica de Log t
R
vs. Nro. de atomos de carbono

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de Indice de Kovats
Basado en una serie normal de alcanos como referencia

Teoria:
A: anlito
N y n: nro. de C alcanos
V
A
: volumen de eluc. de A corregido

Practica: requerimientos

Al menos 3 alcanos de serie homologa

Al menos uno eluira antes y el otro luego del analito A

Fig 7.4 400 Grob

,
_

+
' '
' '
log log
log log
100 100
N n
N A
V V
V V
N I

El uso de 2 o mas columnas incrementa la probabilidad

de acertar la identificacion de un pico desconocido, pero
no es conclusivo

Las columnas deben ser diferentes basadas en los

indices de Mc Reynolds

La caracterizacion se basa en el indice de retencion

relativo del pico desconocido

Tambien debe corresponder la caracterizacion

cuantitativa del pico desconocido con las distintas
columnas
ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de multiples columnas

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de respuesta de dectores relativas

Detectores selectivos

El flujo de la salida de la
columna es dividido hacia
2 o mas detectores

Cromatografia de peso
molecular (GC)

Basada en la senal de dos

detectores de ensidad de
gas, dos columnas y dos
gases de distinta densidad
(Ej: CO
2
y SF
6
)

Fig 7.5 403 Grob

( )
1
2
1
1
2
1
2

,
_

,
_

A
A
K
MW MW
A
A
K
MW
GC GC

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de cromatografias secuenciales

Cromatografia bidimensional

Precolumnas de retencion

Precolumnas de reaccion

Pirolisis controlada (GC)

Analisis de grupos funcionales y elementales

Examinacion preliminar

Medicion de variables fisicas (bp, ind. de refraccion,

densidad)

Reacciones selectivas

Hifenacion (acoplamiento) de tecnicas analiticas

LC-ESI-MS, LC-CI-MS, LC-TOF MS, LC-AAS, LC-ICP-

OES, LC-ICP-MS.

Retencion de picos

Purge and trap

ANALISIS CUALITATIVO
En funcin de datos cromatograficos y otros datos

Fingerprints

Para identificacion de un grupo de picos

No se realiza una identificacion individual del pico

Basado en la apariencia general de los picos, tR vs. Conc. y la

relacion de area de picos definidos
ANALISIS CUALITATIVO
Sin identificacion de picos

APLICACIONES: ANALISIS CUANTITATIVO

Normalizacion de areas

Estndar externo

Sin agregado de estndar interno

Con agregado de estandar interno

ANALISIS CUALITATIVO

Tiempo de retencion

Grafica del Log t

R
vs. Numero de carbono

Indices de Kovats

Multiples columnas

Respuesta de diferentes detectores

Pretratamiento de muestra

Cromatografia en serie

Analisis cuantitativo

Rapidez

Simplicidad

Costo bajo

Gran aplicabilidad

Informacion cuantitativa

APLICACIONES
Analisis cuantitativo

Calibracion baseada en:

Altura de pico

Area de pico

Metodos de cuantificacion:

Estndar externo

Sin agregado patron

Con agregado patron

Normalizacion de areas

CROMATOGRAFIA DE GASES

CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Analisis de grupos funcionales y elementales

APLICACONES