ISOLAMENTO E CARACTERIZAO DE MICRO-ORGANISMOS

UNISA Universidade de Santo Amaro

Na natureza encontramos vrias espcies de micro-organismos (bactrias, fungos,

algas e protozorios) convivendo no mesmo ambiente.

Para estudar as propriedades de um determinado micro-organismo em particular, deve-se primeiramente isol-lo em cultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, onde todas as clulas na populao sejam idnticas (originrias de uma mesma clula parenteral)

CULTIVO DE CULTURAS PURAS MEIOS DE CULTURA Os ingredientes necessrios para o crescimento de micro-organismos podem ser supridos por um sistema vivo, como um hospedeiro animal ou vegetal, uma cultura de clulas, ou por uma mistura de todos os nutrientes requeridos juntos em um sistema artificial, denominado meio de cultura.

Os meios de cultura contm os materiais nutrientes para o cultivos dos

diferentes microrganismos.
Estes meios podem ser preparados no prprio laboratrio com ps desidratados, ou adquiridos prontos no comrcio em placas de Petri ou tubos de ensaio. Estes meios podem ser em caldo (lquido) ou gar (slido). Os meios lquidos so teis para a obteno de relativa grande biomassa de microrganismos e revelao de provas bioqumicas, mas no permitem a separao de dois ou mais microrganismos de espcies diferentes em uma populao mista, no possibilitando a observao de algumas caractersticas especficas dos microrganismos, como a morfologia de suas

colnias.

Para se determinar as necessidades nutricionais de um micro-organismo so

utilizados meios quimicamente definidos, ou seja, se conhece a composio exata de tais meios. Meios de cultura mnimos ou basais so meios onde somente so fornecidos elementos qumicos necessrios ao micro-organismo, na forma de molculas ou frmulas inicas simples. Nesses meios somente so encontrados uma nica fonte de carbono (geralmente

glicose), de nitrognio (sais de amnio ou nitratos), de fsforo,etc. e no so

detectados fatores de crescimento, aminocidos ou cidos nuclicos.

Meios com finalidades especiais so meios que fornecem informaes especiais sobre os micro-organismos: Meios seletivos so desenvolvidos para promover o crescimento de determinados micro-organismos em detrimento de outros, que tambm se encontram na amostra em questo. A prtica mais comum a incorporao

de substncias tais como antibiticos ou inibidores que propiciam tal seleo.

Ex.: Agar de Thayer-Martin seletivo para Neisseria gonorrhoeae e N. meningitidis onde os organismos contaminantes so inbidos pela colistina, nistatina, vancomicina e trimetroprim e MSB (sacarose e bacitracina) seletivos para Streptococcus mutans.

Meios diferenciais so desenvolvidos para facilitar a separao presuntiva de espcies de microrganismos que porventura estejam colonizando um mesmo ecossistema. Esses meios, via de regra, permitem a obteno de colnias com caractersticas fenotpicas diferenciadas (morfologia, colorao,etc), de acordo com o processamento de agentes cromognicos ou acares e indicadores incorporados ao meio. Ex.: gar-sangue (Porphyromonas e Prevotellas).

Meios de enriquecimento so variaes dos meios seletivos empregados para se estimular o crescimento de certos micro-organismos exigentes e que encontram-se particularmente presentes em pequeno nmero numa amostra que inclui grande nmero de outros da microbiota normal. Meios para anaerbios so meios pr-reduzidos empregados na coleta e manuteno de bactrias anaerbias, onde so adicionadas substncias redutoras (cido ascrbico 0,1%, cistena 0,1%, tioglicolato de sdio 0,1%) que se combinam com o oxignio e indicadores de oxi-reduo (azul de metileno, resazurina). Meios para o cultivo de bactrias simulam o habitat natural das bactrias. Pode ser adicionado sangue, soro animal, glicose, etc. Ex.: Brain Heart Infusion Agar BHI agar.

Meios para o cultivo de fungos os fungos podem crescer em uma mistura simples contendo glicose, uma fonte de nitrognio inorgnico ou orgnico e alguns minerais. Em geral esses meios tm uma concentrao maior de acar (4%) e um pH menor (3,8 a 5,6) que o meio para cultivo bacteriano (pH 6,5 a 7,5). Ex.: Sabouraud Agar.

FATORES QUE INFLUENCIAM A ESCOLHA DO MEIO A origem do material a ser analisado A espcie que se imagina estar presente na amostra As necessidades nutricionais dos organismos.

MTODOS DE CULTIVO Inoculao Quando o inculo (material colocado no meio de cultura), obtido de uma suspenso original da amostra, colocado dentro ou sobre um meio geleificado (gar), as clulas so imobilizadas e cada uma ir se multiplicar produzindo uma colnia isolada. Cada colnia nada mais do que clulas individuais agrupadas, com ancestral nico, visvel a olho nu. Tcnica de esgotamento por estrias: atravs de uma ala ou agulha de semeadura esgota-se o material por meio de estrias na superfcie do meio. Tcnica da semeadura em superfcie: o inculo espalhado na superfcie do gar com o auxlio de uma ala de vidro (ala de Digralsky).

Tcnica da semeadura em superfcie: o inculo espalhado na superfcie do gar com o auxlio de uma ala de vidro (ala de Digralsky). Mtodo de pour-plate: uma suspenso de clulas misturada com gar fundido a 45C, que se verte em uma placa de Petri. Quando o gar se solidifica, as clulas so nele imobilizadas e crescem, formando colnias. Se a suspenso de clulas que ser inoculada foi previamente diluda, as colnias formadas estaro bem separadas, com alta probabilidade de ser derivada de uma nica clula. Mas para se ter certeza disso necessrio repicar uma colnia do tipo desejado, suspend-la em soluo apropriada e replaque-la. Este procedimento dever ser repetido quantas vezes for necessrio, o que ir assegurar a obteno de uma cultura pura.

Um outro mtodo de obteno de cultura pura o de diluio com extino. A suspenso original da amostra diluda seriadamente e semeiam-se

amostras de cada diluio.

Se apenas algumas amostras de uma diluio particular exibirem crescimento, presume-se que essas culturas se originaram a partir de clulas isoladas.

Este mtodo utilizado somente quando no possvel o cultivo em placa

por algum motivo e deve ser empregado apenas para se isolar o tipo de
organismo predominante em uma populao mista.

MANIPULAO DO CRESCIMENTO DOS MICRO-ORGANISMOS Por vezes, extremamente difcil reproduzir o crescimento microbiano em meios artificiais, assim como este ocorre em ambiente natural. Para contornar este problema reproduz-se em laboratrio as condies ideais para o crescimento do Micro-organismo que se deseja isolar, tais como: diferentes meios de cultura que contenham os nutrientes exigidos pelo microrganismo temperatura de incubao aerao, pH.

Quando se deseja identificar a maior parte das espcies presente em uma amostra de uma populao mista de micro-organismos deve ser realizada a semeadura em tantos meios e condies de incubao diferentes quantos sejam necessrios para se obter o crescimento da maioria das espcies presentes na amostra. Para o isolamento de um tipo particular de micror-oganismo presente em uma populao mista, alguns recursos podem ser empregados de acordo com as caractersticas do microrganismo desejado, tais como meios diferenciais, meios seletivos, meios enriquecidos, o aquecimento do material, ao de lcalis ou cidos fortes, e inoculao em animal sensvel.

ISOLAMENTO DE AERBIOS Estes microrganismos requerem oxignio para sua sobrevivncia. Aps a semeadura em placas ou tubos com meio de cultura, estes so mantidos em estufa a 37C em presena de oxignio do ar atmosfrico. Existem grupos de microrganismos, como a Neisseria gonorrohoeae, que necessitam nveis elevados de dixido de carbono (CO2), neste caso pode ser utilizado o mtodo da jarra microaerfila. Aps semeados, os meio so colocados dentro da jarra juntamente com uma vela acesa que ento fechada hermeticamente. Aps a vela se apagar ser obtida uma quantidade reduzida de oxignio livre e um teor de dixido de carbono de aproximadamente 10%.

ISOLAMENTO DE ANAERBIOS Durante a preparao dos meios, estes so fervidos para que a maior parte do oxignio dissolvido seja retirada. O gs nitrognio livre de oxignio colocado nos tubos contendo o meio, e ento um agente redutor deve ser adicionado (normalmente

cistena), o qual remove os ltimos traos de oxignio. Os meio so esterilizados em

autoclave na completa ausncia de oxignio. Cmara de anaerobiose: a manipulao dos microrganismos realizada dentro da cmara que contm luvas especiais acopladas parede da cmara. A atmosfera dentro da cmara uma mistura de hidrognio, dixido de carbono e nitrognio. O material introduzido ou removido da cmara por meio de um sistema fechado para o ar. Qualquer resduo de oxignio na

cmara removido pela reao com o hidrognio, na presena do catalisador

paldio.

Jarras de anaerobiose: os meios inoculados so colocados em uma jarra juntamente com um envelope que contm substncias qumicas que geram hidrognio e dixido de carbono. Este sistema inadeqado para o cultivo de anaerbios estritos. Mtodo de Veillon: o microrganismo inoculado em meio slido em coluna alta, crescendo no fundo do tubo de ensaio. Para os anaerbios so utilizados meios reduzidos, que so meios de cultura com a adio de um agente redutor (ex.: tioglicolato de sdio), que so capazes de absorver o oxignio ou gerar H2 e CO2.

MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAO MICROBIANA Existe uma variedade de tcnicas para quantificar o crescimento bacteriano. Os dois mtodos quantitativos mais comuns so aqueles que avaliam o nmero de clulas UFC/mL Unidade Formadora de Colnias por mL ex.: Contagem celular microscpica ou eletrnica, contagem em placa ou atravs de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda atravs da estimativa de unidades de absorbncia da massa de clulas em caldo ou outras suspenses (turbidez).

MEDIDA DO CRESCIMENTO DA POPULAO MICROBIANA Existe uma variedade de tcnicas para quantificar o crescimento bacteriano. Os dois mtodos quantitativos mais comuns so aqueles que avaliam o nmero de clulas UFC/mL Unidade Formadora de Colnias por mL ex.: Contagem celular microscpica ou eletrnica, contagem em placa ou atravs de membrana filtrante e aqueles que medem o peso celular ou ainda atravs da estimativa de unidades de absorbncia da massa de clulas em caldo ou outras suspenses (turbidez).

O estudo da morfologia das colnias crescidas em meio slido (forma, dimenses, estrutura, brilho, etc) ir possibilitar uma identificao preliminar, mas no definitiva do organismo estudado, j que muitas espcies podem produzir colnias que no diferem entre si. (ex.: algumas colnias de E. coli so indistingveis das de Shigella quando cultivadas em gar- Hektoen).

Caractersticas Morfolgicas Os micro-organismos podem ser observados ao microscpio ptico utilizando-se preparaes fixadas e coradas. Preparaes a fresco (em gota pendente ou preparaes entre lmina e lamnula), so teis quando a estrutura do microrganismo pode ser distorcida pelo calor ou agentes qumicos utilizados na preparao do material seco e corado, podendo ser utilizadas tambm quando o microrganismo no se cora facilmente ou para observar motilidade ou ingesto de alimentos particulados.
As tcnicas de colorao servem para mostrar as vrias estruturas dos microrganismos (flagelos, membranas, cpsulas), identificar suas estruturas internas e ajudar a identificar e separar microrganismos similares. As coloraes podem ser feitas com um ou mais corantes.

Colorao simples: realizada com uma nica soluo corante. As clulas coram-se uniformemente com esta tcnica. (ex.: Violeta de genciana) Colorao diferencial: envolve mais de uma soluo corante. Evidencia diferenas entre as clulas microbianas ou parte das clulas. (ex.: Colorao de Gram, Colorao de Zihel-Nielsen) Colorao de Gram O microbiologista pode utilizar a colorao de Gram do material obtido de colnias isoladas para obter, atravs de observao ao microscpio ptico, maiores informaes sobre a morfologia celular. A maioria das bactrias pode ser dividida em dois grupos distintos de acordo com os resultados apresentados pelo Gram: Bactrias Gram-positivas coram-se em violeta escuro Bactrias Gram-negativas coram-se em vermelho Essa diferena na colorao est relacionada com a espessura e estrutura das paredes celulares das bactrias.

Microscopia ptica Os microscpios de luz conseguem uma ampliao mxima til de cerca de 1000x o tamanho original do espcime. Com algumas modificaes, incluindo oculares de alta potncia a ampliao mxima do microscpio luminoso pode chegar a aproximadamente 2000x. A imagem formada pelas objetivas tambm ampliada pelas lentes oculares. Assim, a combinao do sistema de lentes da objetiva e o sistema de lentes oculares produz a ampliao. Existem diversos tipos de microscpio de luz: Microscpio de campo claro, de campo escuro, de fluorescncia, de contraste de fase

O microscpio eletrnico produz uma ampliao mxima til de cerca de 200.000 400.000x o tamanho original do espcime, devido ao alto poder de resoluo proporcionado pelo comprimento de onda muito curto dos feixes de eltrons utilizados, em vez da luz. Este microscpio permite o exame de vrus e das ultra estruturas das clulas microbianas. Existem avanos mais recentes na microscopia, como aquelas que utilizam computadores, outras fontes de iluminao, ou novas tcnicas de colorao

Caractersticas Metablicas Existem vrios testes laboratoriais que podem determinar a atividade metablica (metabolismo oxidativo, metabolismo fermentativo, catabolismo protico) de um organismo. O registro das reaes realizadas por uma espcie microbiana til e muitas vezes essencial para sua identificao Caractersticas Fisiolgicas Condies fsicas como a atmosfera gasosa, a temperatura, o pH, a luminosidade e os fatores de crescimento prprios de cada microrganismo tambm fornecem parmetros para a identificao. Por exemplo, os microrganismos do corpo humano crescem a 35C e os do oceano a temperaturas entre 4 e 20C.

Caractersticas Antignicas Uma clula microbiana apresenta estruturas fsicas em sua superfcie que podem agir como antgeno e induzir, desta forma, a produo de anticorpos. Os anticorpos produzidos em animais de laboratrio podem ser usados para detectar a presena de antgenos nicos em culturas bacterianas e so usados para caracterizar microrganismos Caractersticas patognicas A inoculao do microrganismo em hospedeiro sensvel (animal, plantas ou micrbios), com a finalidade de reproduzir a doena, poder determinar se este ou no um patgeno.

Caractersticas genticas Atravs dos avanos na biologia molecular surgiram tcnicas que permitem realizar anlises genticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade, atravs de mtodos mais sensveis e precisos

CONSERVAO DE CULTURAS PURAS Aps a obteno de uma cultura pura dever ser adotado um mtodo de conservao destas culturas vivas por um perodo de tempo de acordo com o objetivo do estudo a ser realizado. Conservao por um curto perodo (dias a meses): Armazenagem temperatura de refrigeradores (4C a 10C) Repiques freqentes Conservao por longos perodos: Nitrognio lquido a -196C Freezers a -70C/ -120C Liofilizao congelamento a seco - as amostras so congeladas, desidratadas e fechadas vcuo, o que possibilita a viabilidade das culturas por muitos anos. Esta tcnica permite a obteno de uma coleo de microrganismos como referncia, por exemplo. Para o isolamento dos microrganismos em laboratrio deve ser observada a atmosfera gasosa ideal para o crescimento de cada clula microbiana em particular.