CROMATOGRAFIA

Professor Juraci Loureno Teixeira

CROMATOGRAFIA
Michael Tswett - 1906

Separao da clorofila de uma mistura de pigmentos de planta.

Carbonato de clcio em p

Pequena quantidade de amostra

ter de petrleo Bandas separadas e de cores distintas.

ter de petrleo mistura de pigmentos

CaCO3

pigmentos separados

CROMATOGRAFIA

Kroma = cor

Graph = escrever

Escrevendo em cores

CROMATOGRAFIA
Princpio Bsico
Separao de misturas por interao diferencial dos seus componentes entre uma FASE ESTACIONRIA (lquido ou slido) e uma FASE MVEL (lquido ou gs).

USOS E APLICAES DA CROMATOGRAFIA

Ferramenta analtica para separao de misturas.
Combinada com qumica convencional ou instrumental identificar espcies qumicas.

CROMATOGRAFIA

Tcnica Fase Mvel Fase

L

Planar

Em coluna

Lquido

Gs

Fluido supercrtico

Lquido

FL

FL

FL

FL

Estacionria
L= lquido, S = slido, FL= fase ligada

TIPOS DE MECANISMOS

Depende do tipo de fase estacionria.

Transferncia dos componentes da fase mvel para a fase estacionria.

ADSORO Na superfcie das partculas slidas. PARTIO Entre os lquidos da fase mvel e da fase estacionria que fica nos poros de um suporte slido inerte.

LIGAES HETEROPOLARES Com componentes inicos da fase estacionria.

Separao dos Componentes

Velocidade de passagem de um soluto individual na fase estacionria depende da partio da molcula entre as duas fases. Kd = Ce / Cm
Kd = coeficiente de partio Ce = concentrao do soluto na fase estacionria

Cm = concentrao do soluto na fase mvel

Valor de Kd elevado.

O soluto tem maior afinidade com a fase estacionria.

Maior tempo de reteno.

Distncia percorrida por cada soluto num certo tempo.

Resultado das foras de eluio e resistncia.

 Substncias que se movimentam vagarosamente: mais fortemente presas fase estacionria.

Substncias que se movimentam rapidamente gastam uma frao de tempo menor de tempo na fase estacionria devido menor solubilidade ou afinidade a essa fase.

RAZO DE RETENO Indica sua migrao em relao fase mvel. Velocidade do soluto

R=

Velocidade da fase mvel

Frao de tempo que as molculas do soluto gastam na fase mvel em relao fase estacionria.

CROMATOGRAFIA EM PAPEL E CAMADA DELGADA

Rf =

Distncia percorrida pelo centro da zona do soluto

Distncia percorrida pela frente do solvente

CROMATOGRAFIA EM PAPEL

Tcnica simples e econmica de separao dos componentes de uma mistura. Cromatografia lquida-lquida e a separao ocorre por partio (ou absoro) do soluto entre os dois lquidos.

 Diferentes solubilidades relativas dos componentes da amostra na fase mvel (lquida) e na fase estacionria (lquida).

Componentes menos solveis tm uma movimentao mais rpida, enquanto os mais solveis sero seletivamente retidos com uma movimentao mais lenta.

FASE MVEL E FASE ESTACIONRIA

A celulose do papel constituda por 2.000 ou mais unidades de glicose anidra ligadas por tomos de oxignio. Um lquido polar como a gua ter grande afinidade pelas hidroxilas de cada glicose, formando pontes de hidrognio: fica retido e funciona como fase estacionria.

 Lquidos menos polares (solventes orgnicos): so repelidos por essa estrutura e funcionam como fase mvel.

carbono, benzeno, tricloroetileno, clorofrmio, ter etlico, acetato de etila, piridina, amnia, acetona, etanol, metanol, acetonitrila e gua

n-pentano, cicloexano, tetracloreto de

VANTAGENS
Simples e econmica.

Utiliza pequena quantidade de amostra.

Boa capacidade de resoluo.

Praticidade.

TIPOS
Ascendente.

Descendente.
Horizontal (circular).

Bidimensional.

CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

Consiste na separao dos componentes de uma mistura por migrao diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente preso sobre uma superfcie plana.

Superfcie: vidro plano ou alumnio.

VANTAGENS E DESVANTAGENS
Fcil execuo. Rapidez. Versatilidade. Grande reprodutibilidade. Baixo custo. Aplicao analtica ou preparativa.

 Mais sensvel e necessita de menor quantidade de amostra; entre 10 a 100 vezes mais sensvel do que a de papel.
Uso de reagentes de revelao corrosivos. Mais cara. Mais difcil de tirar as manchas da placa para anlise. Menor uniformidade para fazer a camada delgada.

Processo de Separao

Adsoro: o soluto separado entre uma fase estacionria slida e uma fase estacionria mvel lquida.

PROCEDIMENTO
A amostra dissolvida em um solvente adequado, ento, uma certa alquota desta soluo aplicada na regio de partida e o conjunto seco. A placa de TLC ento colocada em uma cmara de desenvolvimento ou cuba, o qual contm o solvente.

PROCEDIMENTO
Inicia-se o que chamamos de desenvolvimento cromatogrfico onde os componentes da amostra so influenciados pela ao de duas foras, opostas entre si. Capilaridade: a responsvel pelo avano do solvente ou fase mvel sobre a fase estacionria que contm a amostra.

PROCEDIMENTO
Interao: to logo se inicia a migrao da fase mvel, a amostra dissolvida e comea a ser arrastada pela fase mvel. Neste momento aparecem foras de interao entre os componentes da amostra e a fase estacionria. Estas foras de interao se opem fora de arraste da fase mvel (capilaridade) retardando o avano dos componentes da amostra.

Forma incorreta de aplicao

Forma correta de aplicao

As trs formas de aplicao resultam em boas condies de separao, dependendo da fase mvel escolhida.

Zona de aplicao - to pequena quanto possvel.

Hexano - o ponto de aplicao ficou o menor possvel. O ideal evitar o efeito de anel, como ocorreu com a gua.

CROMATOGRAFIA EM COLUNA

CROMATOGRAFIA DE ADSORO: CROMATOGRAFIA LQUIDA-SLIDA

A fase estacionria um slido de superfcie ativa, que pode ser: slica-gel, alumina ou celulose.

 O slido empacotado dentro da coluna de vidro e a fase mvel, que um solvente composto de um ou mais lquidos orgnicos, vai eluir os componentes da mistura atravs da coluna.

CROMATOGRAFIA GASOSA

um dos procedimentos mais utilizados nos laboratrios modernos. Excelente sensibilidade. capaz de separar e detectar centenas de compostos simultaneamente.

Vantagens
Rapidez.

Alto poder de separao e resoluo.

Alta sensibilidade 10-12 g. Trabalha com pequenas quantidades de amostra.

Desvantagens
Analisa somente componentes volteis. A preparao da amostra pode ser trabalhosa. No uma tcnica qualitativa eficiente resultado no conclusivo.

INSTRUMENTAO Gs de Arraste
Fase Mvel em CG: NO interage com a

amostra - apenas a carrega atravs da coluna. Assim usualmente referida como GS DE ARRASTE.

REQUISITOS
INERTE - No deve reagir com a amostra, fase
estacionria ou superfcies do instrumento. possam degradar a fase estacionria.

PURO - Deve ser isento de impurezas que

Impurezas tpicas em gases e seus efeitos: H2O, O2
oxida / hidroliza algumas FE icompatveis com DCE rudo no sinal de DIC

hidrocarbonetos

CUSTO - Gases de altssima pureza podem

ser muito caros.

C B A
PUREZA

A = 99,995 % (4.5) B = 99,999 % (5.0) C = 99,9999 % (6.0)

detector demanda um gs de arraste especfico para melhor funcionamento.

COMPATVEL COM DETECTOR - Cada

CUSTO

Injetor on-column Convencional

1 2

1 - Septo (silicone) 2 - Alimentao de gs de arraste) 3 - Bloco metlico aquecido 4 - Ponta da coluna cromatogrfica

Injeo on-column de lquidos

1 - Ponta da agulha da microseringa introduzida no incio da coluna. 2 - Amostra injetada e vaporizada instantneamente no incio da coluna. 3 - Plug de vapor de amostra forado pelo gs de arraste a fluir pela coluna.

Parmetros de Injeo
TEMPERATURA DO INJETOR - Deve ser

suficientemente elevada para que a amostra vaporize-se imediatamente, mas sem decomposio.
Regra Geral: Tinj = 50oC acima da

temperatura de ebulio do componente menos voltil.

Parmetros de Injeo
VOLUME INJETADO - Depende do tipo
de coluna e do estado fsico da amostra.
COLUNA
empacotada = 3,2 mm (1/4) capilar = 0,25 mm Amostras Lquidas
0,2 L ... 20 L 0,01 L ... 3 L

Amostras Gasosas
0,1 ml ... 50 mL

0,001 ml ... 0,1 mL

Slidos: convencionalmente se dissolve em um solvente adequado e injeta-se a soluo.

Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG ? Misturas cujos constituintes sejam VOLTEIS (=evaporveis)

DE FORMA GERAL:

CG aplicvel para separao e anlise de misturas cujos constituintes tenham PONTOS DE EBULIO de at 300oC e que sejam termicamente estveis.

1
2

Observao: em vermelho: temperatura controlada

4

5
1 - Reservatrio de Gs e Controles de Vazo / Presso. 2 - Injetor (Vaporizador) de Amostra. 3 - Coluna Cromatogrfica e Forno da Coluna. 4 - Detector. 5 - Eletrnica de Tratamento (Amplificao) de Sinal. 6 - Registro de Sinal (Registrador ou Computador).

Microseringas para Injeo

Microseringa de 10
L:
mbolo agulha (inox 316)

corpo (pirex)

Microseringa de 1 L (seo ampliada):

corpo
agulha

guia mbolo (fio de ao soldado ao guia)

Colunas: Definies Bsicas

Recheada com slido pulverizado (FE slida ou FE lquida depositada sobre as partculas do recheio)

EMPACOTADA = 3 a 6 mm L = 0,5 m a 5 m

Paredes internas recober-tas com um filme fino (fra-o de m) de FE lquida ou slida

CAPILAR = 0,1 a 0,5 mm L = 5 m a 100 m

Temperatura da Coluna

p0 = f

Estrutura qumica do analito Temperatura da coluna

Presso de vapor Velocidade de migrao

Temperatura da coluna

ANALITO ELUI MAIS RAPIDAMENTE (MENOR RETENO)

TEMPERATURA DA COLUNA

CONTROLE CONFIVEL DA TEMPERATURA DA COLUNA ESSENCIAL PARA OBTER BOA SEPARAO EM CG

Eficincia de Sistemas Cromatogrficos

A migrao um analito pela coluna provoca inevitavelmente o alargamento da sua banda:

TEMPO

Efeitos do alargamento excessivo de picos:

Picos mais largos e Separao deficiente de analitos com retenes menos intensos = menor detectabilidade prximas.

EFICINCIA - Capacidade de eluio com o

mnimo de disperso do analito.

FASES ESTACIONRIAS
LQUIDOS Depositados sobre a superfcie de: slidos porosos
inertes (colunas empacotadas) ou de tubos finos de materiais inertes (colunas capilares)

FE lquida SUPORTE Slido inerte poroso

Tubo capilar de material inerte

FASES ESTACIONRIAS
Para minimizar a perda de FE lquida por volatilizao, normalmente ela :

Entrecruzada: as cadeias polimricas so quimicamente ligadas entre si

Quimicamente ligadas: as cadeias polimricas so presas ao suporte por ligaes qumicas

Fatty Acids in Potato Chips

Fatty Acids, C2-C7

Aroma Volatiles from Stored Apples

Sterols in Olive Oil

Sterols in Olive Oil

Distilled Lime Oil

Orange Oil

5% SP-2100/0.1% SP-401 on 100/120 SUPELCOPORT 75C (2 min) to 175C at 4C/min nitrogen, 20mL/min FID , 0.2L