Cronograma de actividades - Modulo I

Lunes 8/8: presentacin de patgenos siembra en medios de enriquecimiento Martes 9/8: E. coli O157:H7 IMS y siembra en medios Salmonella repique en caldos selectivos Mircoles 10/8: E. coli O157:H7 lectura de placas y aislamiento en TSA Extraccin para PCR real time Salmonella repique en medios slidos

Cronograma de actividades - Modulo I -

Jueves 11/8: Bioqumicas /ltex /aglutinacin Curso de calidad : 5 S Viernes 12/8: PCR: - preparacin de master mix - carga de capilares - corrida lectura de las bioqumicas Interpretacin Informe de resultados Ver visita IRAM

INVESTIGACION DE SALMONELLA spp.

MODULO 1

Med. Vet. Mara Noel Olivera Servicio de Microbiologa INAL-ANMAT

GENERALIDADES Pertenecen a la familia Enterobacteriaceae Son bacilos G-, no esporulados, oxidasa muchos son mviles por flagelos pertricos Anaerobios facultativos T crecimiento amplio 7-48 C y pH 4-8 Caractersticas Son bacterias ubicuas Principal reservorio intestino de animales Alta capacidad de supervivencia en el ambiente Viabilidad y capacidad infectiva en agua (sem) y suelos (aos) Capacidad de infectar al hombre y los animales (portadores)

Alimentos implicados Alimentos de origen animal (huevos, carne, leche, pescado, marisco) Subproductos de origen animal (ovo productos y lcteos no pasteurizados) Alimentos sanos que se contaminan por otro alimento contaminado o por manipulador

Cules son los sntomas de la salmonelosis? 1. diarrea grave o leve, 2. fiebre 3. vmitos. 4. Sntomas adicionales pueden incluir escalofros, dolor de cabeza, nausea. Desaparecen a los 4 a 7 das Periodo de incubacin: entre 8 a 72 horas Autolimitante Riesgosa para poblacin suceptible: nios, embarazadas, ancianos e inmunocomprometidos

Prevencin Muere por calentamiento a 70C Contaminacin cruzada higiene de los utensilios/manipuladores/orden entre los alimentos crudos y cocidos cocinar los alimentos

EEUU brote en julio 2011------ por papayas de origen mexicano carne molida de pavo MADRID brote en marzo 2011---- en formula en polvo para lactantes

ISO 6579 : 2002

Mtodo horizontal para la deteccin de Salmonella spp.

ISO 6579:2002

Salmonella: microorganismos con colonias tpicas en medios de cultivos selectivos que poseen caractersticas bioqumicas y serolgicas especificas.

OBJETIVO: determinar presencia o ausencia de Salmonella en un volumen de alimento utilizando las pruebas en concordancia con el Standard Internacional.

ISO 6579:2002

Procedimiento
1- Enriquecimiento no selectivo:

X g de la muestra + 9 X ml de BPW (diluc. 1/10) Incubar a 37C +/- 1C, 18 hs. +/- 2 hs. Chocolates y productos con chocolates: agregar al BPW 50 g/l de casena o 100 g/l de leche en polvo descremada estril. Alimentos cidos: BPW doble concentracin

ISO 6579:2002
2. Enriquecimiento selectivo:

transferir 0.1 ml de BPW en 10 ml de caldo RVS. Incubar a 41,5C+/- 1C, 24 +/- 3 hs.

transferir 1 ml de BPW en 10 ml de caldo MKTTn. Incubar a 37C+/- 1C, 24 +/- 3 hs.

ISO 6579:2002
3. Estriado y aislamiento en placa:

A partir de RSV y MKTTn sembrar un ansada por agotamiento en superficie en agar XLD y en el segundo agar elegido . Incubar a 37C +/- 1C, 24 +/- 3 hs.

ISO 6579:2002

4. Aislamiento en agar nutritivo:

Seleccionar colonias tpicas y estriar en agar nutritivo. Incubar a 37C+/- 1C, 24 +/- 3 hs. de cada medio selectivo al menos una colonia tpica o sospechosa de Salmonella y 4 colonias ms primera es negativa

si

la

ISO 6579:2002

5. Confirmacin:

Pruebas bioqumicas en tubos o kits comerciales - TSI - LDC - Urea - - Galactosidasa - VP - Indol Serologa: - Antigenos O, Vi y H

ISO 6579:2002

ISO 6579:2002

6. Confirmacin definitiva: Una vez identificada la cepa como Salmonella spp. enviar al centro de referencia para su tipificacin.

7. Informe de resultados: Indicar presencia o ausencia de Salmonella spp. en la cantidad de muestra analizada (por gramos o mililitros para muestras lquidas)

Investigacin de Salmonella

Bacteriological Analytical Manual (BAM)

Captulo 5 Versin: Diciembre 2007

BAM-FDA

Preparacin de la suspensin inicial:

Alimento Yema de huevo en polvo, leche fluda , preparados a base de polvos ( tortas , galletitas, ej) Huevo con cscara Leche en polvo Medio de enriquecimiento

Caldo lactosado estril

Caldo TSB + sulfato ferroso Agua destilada estril+ verde brillante Caldo TSB

Especias

BAM-FDA

1. Enriquecimiento:
25 g de muestra + 225 ml de diluyente (dilucin 1/10)
Ajustar el pH 6.8 / 0.2 Homogeneizar: 2 minutos

2. Incubacin
Incubar a 35C+/- 1C durante 24h +/- 2 h

BAM-FDA

3.Enriquecimiento selectivo
Alimentos sospechosos de contener S. Typhi
1ml en 10ml de Caldo Selenito (CS) y 1ml en 10ml de Caldo Tetrationato (TTB) Otros Alimentos 0.1ml en 10ml de caldo Rappaport-Vassilliadis (RV) y 1ml en TTB

BAM-FDA

Incubacin del enriquecimiento selectivo

Alimentos sospechosos de contener S. Typhi
Caldo selenito y caldo TT ---------24 -/+2 hs a 35C
Alimentos con baja carga microbiana Caldo RV --------24-/+ 2hs a 42 -/+ 0.2C Caldo TT ---------24-/+2hs a 35 -/+ 2.0C Alimentos con alta carga microbiana Caldo RV --------24-/+ 2hs a 42 -/+ 0.2C Caldo TT ---------24-/+2hs a 43 -/+0.2C

BAM-FDA

4.Aislamiento en medios slidos

Pasar un ansada de TT / RV / SC

agar Sulfito Bismuto (BS)

agar Xilosa Lisina Desoxycolato (XLD)

agar Hektoen (HE)

Incubacin de los medios slidos 24 hs-/+ 2hs a 35C

BAM-FDA

5. a) Identificacin de colonias tpicas

Medio HE: colonias azul-verdosas con o sin centro negro , algunas cepas pueden originar colonias completamente negras

Medio XLD: colonias rosas con o sin centro negro.

Medio BS: colonias marrones o grises con o sin centro negro ( puede requerir incubacin de 48 -/+ 2hs)

BAM-FDA

5.b) Identificacin de colonias atpicas

Medio HE y XLD: colonias atpicas amarillas con o sin centro negro. Medio BS: colonias atpicas verdes con poco o nada de ennegrecimiento del medio a su alrededor . No olvidar la incubacin adicional de 24 hs

En cualquiera de los casos elegir 2 colonias atpicas

BAM-FDA

6.Pruebas presuntivas
Tomar colonias caractersticas y sembrar en:

TSI
LIA (anaerobiosis-4 cm fondo de tubo) 35C 24 -/+2hs

BAM-FDA

7.Lectura de Pruebas presuntivas

Se consideran colonias sospechosas aquellas que: TSI: reaccin cida abajo (amarillo)/alcalina arriba (rojo) con o sin produccin de H2S

LIA: reaccin alcalina abajo (prpura) la mayora con H2S

BAM-FDA

8.Confirmacin de colonias sospechosas:

ureasa (convencional/ test rpido) Serologa flagelar (H) polivalente Si urea es (-): -caldo lisina decarboxilasa -caldo base prpura con 0.5% dulcitol

-caldo triptona ( triptofano)

Serologa somtica (O) polivalente Pruebas bioqumicas adicionales

BAM-FDA

9.Pruebas adicionales:
Pruebas
Glucosa (TSI) Lisina descarboxilasa (LIA) H2S (TSI y LIA) Ureasa Caldo Lisina Descarboxilasa Caldo Dulcitol rojo de fenol

Reaccin +
amarillo prpura ennegrecimiento de color rojo-prpura color prpura color amarillo y / o gas

Reaccin rojo amarillo No ennegrecimiento ningn cambio de color color amarillo no gas, sin cambiar de color

Salmonella
+ + + + +

Prueba Voges-Proskauer
Prueba citrato de Simmons Prueba del Indol Prueba polivalente flagelar Prueba Polivalente somticas Caldo Lactosa rojo de fenol

color rosa a rojo

azul color rojo en la superficie aglutinacin aglutinacin color amarillo y / o gas

ningn cambio de color

verde sin cambio de color en la superficie sin aglutinacin sin aglutinacin sin gas, sin cambiar de color

variable + + -

BAM-FDA

10.Identificacin presuntiva:

Utilizar kits comerciales (API 20E, Enterotube II, Enterobacteriaceae II, MICRO-ID)

Interpretacin de los resultados para su correcto informe: kit comercial + serologa H y O positivas: presuntivo Salmonella descartar aquellos cepas que no corresponden segn criterio AOAC En caso de no poder llegar a la confirmacin, enviar la cepa a un centro de referencia

Deteccin de Salmonella spp. en alimentos

ICMSF
International Commission on Microbiological Specifications for Foods

ICMSF

Los mtodos para el aislamiento e identificacin pueden dividirse en 6 etapas:

1. Enriquecimiento no selectivo
2. Enriquecimiento selectivo 3. Siembra en medios selectivos y diferenciales 4. Caractersticas bioqumicas 5. Anlisis antignico en 2 fases: sueros polivalentes y monovalentes 6. Tipificacin por medio de bacterifagos

ICMSF

1. Enriquecimiento no selectivo:

Objetivo

recuperacin de aquellas Salmonellas que pudieron sufrir dao

Eleccin del medio adecuado: -Caldo Lactosado, -Agua Peptonada tamponada, -Agua destilada + verde brillante, -AD con leche descremada + VB -adicin de Tergitol 7

ICMSF

1. Enriquecimiento no selectivo:

X g de la muestra en 9 volmenes del medio de enriquecimiento (dil. 1/10)

Homogeneizar e incubar a 35-37 C por 18-24 hs

ICMSF

2.Enriquecimiento selectivo:

1. 1ml del pre-enriquecimiento en 10ml de Caldo Selenito Cistena (SC) Incubar en Bao Mara 43 C -/+ 0.05C 24 hs

2. 1ml del pre-enriquecimiento en 10ml de Caldo Tetrationato Verde Brillante(TVB) Incubar 43C -/+ 0.05C 24 hs

ICMSF

3.Siembra en medios selectivos y diferenciales:

Sembrar cada uno de los tubos de SC y TVB en: Agar Verde Brillante e incubar 24 hs a 35-37C Agar Sulfito de Bismuto e incubar 48 hs a 35-37C Queda a eleccin del laboratorio y se respetan las indicaciones del fabricante

ICMSF

Caractersticas de las colonias

Agar Verde Brillante: incoloras, rosa o fucsia o traslcidas a opacas, con el medio que las rodea de color rosa a rojo.

Agar Sulfito de Bismuto: marrones o grises a negro, a veces con brillo metlico . El medio que las rodea puede ir cambiando desde marrn hasta negro con el tiempo . Pueden aparecer colonias atpicas de color verde con halo poco o nada oscurecido.

ICMSF

4. Identificacin de Salmonella:
Se puede llegar a la identificacin mediante pruebas bioqumicas y serolgicas con los sueros comerciales. Se enva la muestra a un centro de referencia para su confirmacin definitiva

bioqumica

Sembrar en TSI y Agar Lisina Hierro 2 ms colonias sospechosas de cada uno de los 3 los medios selectivos. Incubar 24 hs a 35-37C

ICMSF

TSI tpico: c / alc con o sin H2S TSI atpico : c / c porque fermentan la sacarosa y lactosa tambin. Agar lisina hierro tpico: alcalino en todo el medio con o sin H2S

ICMSF
Pruebas serolgicas: Reaccin con el antisuero polivalente O ( somtico ):
Diluir y ensayar los antisueros con cultivos testigos. 1. Depositar una pequea cantidad del cultivo sospechoso sobre el extremo de un portaobjetos. 2. Depositar una gota de Sn fisiolgica y emulsionar con el cultivo mediante una aguja limpia. 3. Aadir una gota del antisuero polivalente O y mezclar. 4. Repetir la operacin sin el agregado del antisuero. 5. Balancear durante 1 min y observar sobre fondo oscuro si hubo o no aglutinacin. (+) aquel cultivo que aglutina en la mezcla cultivo - sn. fisiolgica - antisuero (-) aquel cultivo que NO aglutina ensayar antisuero polivalente H.

ICMSF
Reaccin con el antisuero polivalente H (flagelar ) 1.Diluir y ensayar los antisueros con cultivos testigos 2.Aadir 5ml de Sn. Salina formolada al 0.6% a 5ml de un cultivo en caldo H de 24hs.

3.Depositar 0.02ml del antisuero diluido en un tubo de ensayo adecuado y aadir 1ml del caldo formolado.
4.Preparar un control negativo sustituyendo el antisuero por Sn salina formolada. 5.Incubar ambos tubos a 50C 1h en un bao de agua. 6.Balancear durante 1 min y observar sobre fondo oscuro si hubo o no aglutinacin. (+) aquel cultivo que aglutina en la mezcla cultivo - sn. salina formolizada antisuero y no hay aglutinacin en el control negativo. (-) aquel cultivo que NO aglutina.

 Conclusiones:
la norma ISO permite adaptar la tcnica a los diferentes alimentos. Utiliza un medio como enriquecimiento ( BPW ), RV y MKTTn como caldos selectivos y 2 medios slidos para el aislamiento. El BAM separa a los alimentos, en cuanto a su paso de enriquecimiento, utilizando varios caldos y suplementos . Sugiere 3 caldos selectivos que luego se pasan a 3 medios slidos. La ICMSF divide en 6 etapas la identificacin sin exigencia en el pre-enriquecimiento . Utiliza 2 caldos y 3 medios slidos selectivos. De los resultados del TSI y agar Lisina Hierro se puede realizar la serologa.

MUCHAS GRACIAS!

Med. Vet. Mara Noel Olivera mnolivera@anmat.gov.ar