Universidad Nacional de Concepcin

Facultad de Ciencias de la Salud Carrera de Odontologa

Ctedra de Histologa
09 III 2009 Ral M. Desvars Gonzlez

INTRODUCCIN A LA HISTOLOGA
TCNICAS HISTOLGICAS

OBJETIVOS
El objetivo de un curso de Histologa es conducir al estudiante a comprender la microanatoma de las clulas, los tejidos y los rganos, y a correlacionar la estructura con la funcin. Para ello, estudia cortes de tejidos humanos procesados de tal manera a ser observables al microscopio. El conocimiento de las tcnicas histolgicas es fundamental para comprender el por qu del aspecto de los tejidos al microscopio.

HISTOLOGA
Etimolgicamente se define como el estudio de los tejidos. En un sentido ms amplio, es la parte de la Medicina que se ocupa del anlisis de los tejidos que no son observables a simple vista (Anatoma Microscpica).-

Implica adems el estudio de las funciones celulares en condiciones normales del organismo humano.-

GENERALIDADES
Se define tcnica histolgica al conjunto de operaciones a que se somete un tejido a fin de posibilitar su estudio al microscopio.

El dispositivo rutinario es el microscopio ptico de campo claro: la luz debe "atravesar" el tejido a examinar para llegar a travs de distintas lentes al ojo. El tejido debe, por lo tanto, ser reducido a lminas muy delgadas y transparentes.-

ETAPAS
ETAPA PRE-LABORATORIAL: Obtencin de la muestra de tejido (procedimiento quirrgico). Identificacin de la muestra y datos clnicos pertinentes. Coloracin en un recipiente adecuado e inicio del proceso de fijacin, de ser pertinente.-

ETAPAS
ETAPA LABORATORIAL:
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Descripcin y muestreo. Fijacin (formol al 10%). Deshidratacin (alcohol). Aclaracin (xilol). Parafinacin (parafina). Bloqueo (centro de inclusin). Confeccin de cortes (micrtomo). Coloracin (H&E). Montaje (blsamo de Canad).

ETAPAS
ETAPA POST-LABORATORIAL.1. Realizacin del diagnstico anatomopatolgico con las tcnicas de rutina. 2. Redaccin del informe diagnstico. 3. Recomendaciones sobre tcnicas histolgicas especiales. 4. Entrega del informe diagnstico. 5. Revisin de diagnsticos o correlacin anatomoclnica.

MICROSCOPIO OPTICO
M. Compuesto: tiene varias lentes Factores que determinan la calidad de la imagen:
1- Amplificacin: es el aumento de la imagen 2- Poder de resolucin: capacidad de distinguir los detalles finos. Depende de la calidad de las lentes y de la longitud de onda de la luz. Menor es mejor

TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS

M. de campo claro:
Es el utilizado en la mayora de los laboratorios. Para formar una imagen a partir de un corte histolgico usa luz visible, por esto la muestra debe ser lo bastante fina como para que los haces de luz puedan atravesarla.

M. de contraste de fases:

M. de interferencia:

Posibilita la observacin de muestras sin colorear, por lo que resulta til para estudiar especmenes vivos. Es una modificacin del anterior que permite la cuantificacin de masa en los tejidos.

TIPOS DE MICROSCOPIOS OPTICOS

M. de interferencia diferencial o de Nomarski:
Tambin es una modificacin del microscopio de contraste de fase, que permite estudiar las propiedades de superficie de las clulas

M. de fluorescencia:
Permite la observacin de estructuras fluorescentes, ya sea naturales o artificiales.

M. con focal:
Se usa para estudiar la estructura de sustancias biolgicas. Combina partes de un microscopio de campo claro con equipo fluorescente y un sistema de barrido que emplea un rayo lser.

OBTENCION DE LA PIEZA
De tres fuentes puede provenir el material humano: las autopsias, las biopsias y las piezas operadas: Autopsias: Son las piezas que se obtienen de un cadver. Para histologa normal es necesario que se trate de un cadver fresco y que no haya sido atacado por ninguna lesin, por lo menos el rgano que se quiere estudiar.-

OBTENCION DE LA PIEZA
Biopsias: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida con el objeto de estudiarlos al microscopio y efectuar un diagnstico histopatolgico. Piezas operadas: Los tejidos que han sido extrados de las intervenciones quirrgicas, generalmente tumores u rganos inflamados.-

FIJACION
La fijacin tiene por objeto matar las clulas y conservarlas, hasta donde sea posible, en el estado en que se encontraban durante la vida. Es un mtodo histolgico destinado a obtener preparados duraderos que conservan la estructura morfolgica y qumica de las clulas y tejidos al estado vivo. Permite realizar, posteriormente, los procedimientos de coloracin o de identificacin que facilitan el completo conocimiento de su constitucin ntima. Se llaman fijadores a las sustancias qumicas o a los agentes fsicos que se utilizan para tal fin.

CUALIDADES DE UN FIJADOR
1. Actuar con rapidez, matando y fijando a las clulas antes de que aparezcan los fenmenos agnicos o post mortem (autlisis, desintegracin, etc.).2. Poseer alto poder de penetracin para asegurar la fijacin correcta hasta en las capas profundas de la pieza a fijar.3. Conservar, en lo posible, los detalles estructurales que presentaban in vivo.4. Permitir o favorecer el empleo de los procedimientos necesarios para su observacin ulterior (ejecucin de cortes, coloracin, etc.).-

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CUALIDADES DE UN FIJADOR
5. Impedir la desaparicin de los elementos solubles durante la fijacin o despus de ella.6. Impedir o, al menos, no provocar estructuras artificiales (estructuras que no existen en el tejido en vivo pero que aparecen en los preparados histolgicos.7. No retraer excesivamente los tejidos ni volverlos friables o quebradizos.-

FIJADORES QUIMICOS SIMPLES

a) Formol al 10%: es el ms usado. Su empleo es aconsejable en todos los casos en que no se disponga de un fijador especial, principalmente cuando se trata de fijar rganos o tejidos para estudios histolgicos topogrficos.b) Alcohol etlico absoluto o de 96%: se usa generalmente en microqumica. c) Alcohol metlico: se lo emplea con frecuencia para fijar frotis desecados (sangre, mdula sea, ganglio, bazo, lquidos de puncin, etc.).d) cido smico al 1 2%: es poco penetrante pero enrgico, conserva muy bien estructuras celulares.e) Bicromato de potasio al 3-5%.-

FIJADORES QUIMICOS COMPUESTOS

En su composicin intervienen un nmero variable de fijadores simples racionalmente elegidos con el fin de completar la accin de cada uno de ellos o atenuar sus defectos. a) Lquido de Fleming: mezcla cromo-osmio-actica.
b) Lquido de Zenker: mezcla bicromato-sublimado-actica.

c) Lquido de Helly: mezcla Zenker-formol.d) Lquido de Bouin: mezcla picro-formos-actica.e) Liquido de Duboscq-Brasil: o Bouin alcohlico.-

DESHIDRATACION
Las piezas al ser retiradas del fijador estn embebidas en agua, impidiendo que sean penetradas por la parafina.Por lo tanto, en primer lugar, se deben deshidratar los tejidos sumergindolos en lquidos anhidros.Para evitar alteraciones provocadas por una deshidratacin brusca, se procede escalonadamente utilizando, preferentemente, alcohol etlico de graduacin creciente.-

ACLARACION
El trmino aclaracin se refiere a la impregnacin por un disolvente (como el xilol o el tolueno) de la parafina.Las piezas perfectamente deshidratadas se sumergen en el disolvente.Lo que hace el disolvente es preparar al tejido para la impregnacin con parafina, debido a que el mismo es miscible tanto con el alcohol como con esta ltima.-

PARAFINACION
Es la penetracin de la parafina para solidificar el tejido y facilitar su corte en lonjas ultrafinas.Se sumergen las piezas en parafina (56-58 de punto de fusin), mantenida lquida en la estufa a no ms de 62 Celsius.Despus de 1 a 2 horas se renueva la parafina.-

BLOQUEO
Es la inclusin definitiva o formacin del bloque de parafina conteniendo el tejido a ser cortado.En moldes de metal especiales (barras de Leuckart) se vierte la parafina fundida, del mismo punto de fusin de la que ha servido para la penetracin.Se colocan las piezas orientndolas y luego se pone el molde en heladera o sobre una plancha fra.A los 15-30 minutos la parafina se habr solidificado completamente.-

OBTENCION DE CORTES
El objeto de la inclusin es hacer posible la reduccin del tejido a cortes lo suficientemente delgados como para permitir el paso de la luz para examinarlo al microscopio.Los micrtomos son instrumentos de gran precisin que proporcionan cortes delgados parejos y de espesor graduable.Los cortes ms corrientes son los de 4-6 micrmetros (1 micrmetro = 0,001 milmetros).-

TIPOS DE MICROTOMOS
Tipo deslizamiento: en este caso la pieza queda fija mientras la cuchilla se desliza por unas guas especiales merced a un soporte al que se sujeta la cuchilla con unos tornillos.Tipo Minot: en este caso la cuchilla queda fija y es la pieza la que se desliza sujeta a una platina, sta se desliza verticalmente cuando se hace girar una manivela. Permite obtener cortes seriados en forma de cinta.-

TIPOS DE MICROTOMOS
Cristato: consta de un micrtomo tipo Minot incluido en una cmara de congelacin. El volante de inercia que controla la realizacin del corte permanece en el exterior, mientras que la cuchilla y el mecanismo de avance estn situados dentro de la cmara fra (normalmente a -20 Celsius).-

COLORACION
Luego de realizado el corte, se procede a rehidratarlo para permitir su coloracin. Colorantes: reciben esta denominacin las sustancias que pueden conferir color a otros cuerpos.Coloracin: es el proceso mediante el cual un cuerpo es teido por una sustancia colorante, sin perder el color cuando es lavado con el disolvente utilizado al preparar la solucin colorante.-

COLORANTES
Los colorantes ms utilizados rutinariamente para tejidos fijados con formol al 10% e incluidos en parafina son la hematoxilina y la eosina, o simplemente H&E.-

HEMATOXILINA
Es un colorante vegetal: azul Colorante bsico = Basfilo Demuestra la forma nuclear

Para ser utilizada debe ser oxidada previamente. Los agentes oxidantes pueden ser: el aire (varios meses de exposicin) u oxidantes artificiales (xido de mercurio, permanganato de potasio, dicromato potsico, etc.).Es un colorante directo, pero en la prctica se lo utiliza en forma de lacas hematoxilnicas (se utiliza alumbre de potasio o de sodio como mordiente para preparar la solucin colorante), comportndose en este caso como un colorante indirecto.-

EOSINA
Es un colorante artificial:rosa Colorante cido Afn por estructuras cargadas positivamente (constituyentes citoplasmticos) =estructuras acidfilas = Eosinfilas.Presenta autofluorescencia espontnea.Se la emplea tanto en soluciones acuosas como alcohlicas.Para colorear se emplea generalmente una batera de coloracin.-

MONTAJE
Luego de la coloracin, se deshidrata el corte y se procede a la aclaracin y montaje definitivo, lo que permite obtener un preparado en condiciones de ser observado y protegido del ambiente para evitar su deterioro.La deshidratacin se realiza con alcoholes de graduaciones crecientes.-

MONTAJE
La aclaracin se realiza con xilol o carboxilol.Para el montaje se limpia el portaobjeto alrededor del corte y se deposita sobre el mismo una gota de Blsamo de Canad disuelto en xilol y se cubre con un cubreobjeto.Se deja secar unas horas antes de su observacin al microscopio.

ETAPAS
ETAPA PRE-LABORATORIAL. Obtencin de la muestra de tejido (procedimiento quirrgico). Identificacin de la muestra y datos clnicos pertinentes. Coloracin en un recipiente adecuado e inicio del proceso de fijacin, de ser pertinente.-

ETAPAS
ETAPA LABORATORIAL. Descripcin y muestreo. Fijacin (formol al 10%). Deshidratacin (alcohol). Aclaracin (xilol). Parafinacin (parafina). Bloqueo (centro de inclusin). Confeccin de cortes (micrtomo). Coloracin (H&E). Montaje (blsamo de Canad).-

ETAPAS
ETAPA POST-LABORATORIAL. Realizacin del diagnstico anatomopatolgico con las tcnicas de rutina. Redaccin del informe diagnstico. Recomendaciones sobre tcnicas histolgicas especiales. Entrega del informe diagnstico. Revisin de diagnsticos o correlacin anatomoclnica.-

FIN!