TEMA 3: ENZIMAS

1
Enzimas......... y mucho
ms....
Son proteinas, con excepcin de molculas
catalticas de ARN
Se requiere su conformacin nativa e
integridad para funcionar
Tienen pesos entre 6,000 y 1 x 10
6
Da
Algunas requieren componentes qumicos
adicionales: Cofactores, iones inorgnicos
(Fe 2+, Mg2+, Mn2+, Zn2+) y Coenzima
(complejos orgnicos).
2
Enzimas......... y mucho
ms....
Cualquier grupo que se una fuertemente a la
enzima se denomina grupo prosttico
(Holoenzima), denominndose la porcin
protica apoenzima.
Las coenzimas son transportadores transientes
de grupos funcionales especficos y derivan de
las vitaminas, en su mayora.
Algunas enzimas son modificadas
covalentemente por procesos de fosforilacin,
glicosilacin y otros: REGULACION

3
Clasificacin Internacional de
las Enzimas
4
1 Oxidoreductasas
Transferencia de electrones (iones
hidruro o tomos)
2 Transferasas
Reacciones de transferencia de grupos
3 Hidrolasas
Transferencia de grupos funcionales al
agua
4 Liasas
Adicin de grupos a dobles enlaces, o
remocin de dobles enlaces por
remocin de grupos
5 Isomerasas
Transferencia de grupos dentro de las
molculas para rendir formas
isomricas
6 Ligasas
Formacin de enlaces C-C, C-S, C-O y
C-N por reacciones de condensacin
acopladas a ruptura del ATP
5
oxidoreductasa
Transferasa
Liasas
Hidrolasas
Isomerasas
Ligasas
Clasificacin de las enzimas
(IUBM)
6
Oxidoreductasas
Dehidrogenasas, Oxigenasa
Peroxidasas, Reductasas
Catalasa, Hidroxilasas
Transferasas
Transaldolasa
Fosfomutasa
Quinasas
Hidrolasas
Esterasas, peptidasas
Fosfatasas, Fosfolipasas
Glicosidasas, Deaminasas
Liasas
Descarboxilasa, Aldolasa
Hidratasas, Dehidratasas
Sintasas, Liasas
Isomerasas
Racemasas, Epimerasas
Isomerasas, Mutasas
Ligasas
Sintetazas
Carboxilasa
7
Cu
2+
Cytochromo oxidasa
Fe
2+
Fe
3+
Cytochromo oxidasa, catalasa, peroxidasa
K
+
Pyruvato kinasa
Mg
2+
Hexoquinasa, G-6-fosfatasa, pyruvato kinasa
Mn
2+
Arginasa, ribonucletido reductasa
Mo Dinitrogenasa
Ni
2+
Ureasa
Se Glutathione peroxidasa
Zn
2+
Anhydrasa carbnica, alcohol dehidrogenasa,
carboxipeptidasa A y B
Algunos elementos inorgnicos cofactores de enzimas
8
Experimentos cinticos revelan
propiedades de las enzimas
1. Mediciones cinticas: eficiencia como catalizadores
2. Alteracin de V al variar [S] y [E]
3. Orden Cintico
-Nmero de molculas reaccionantes
-Orden Cero
-Primer Orden
-Segundo Orden
-Pseudo Primer Orden
9
10
S
P
A
[ P ]
At
=
V
=
k
[S]
k = constante de velocidad
Rapidez o eficiencia de una reaccin
Constante de proporcionalidad que refleja la
probabilidad de una reaccin bajo un set de
condiciones dadas
11
EL ORDEN CINTICO GENERAL
DE UNA REACCIN ES LA SUMA
DE LOS EXPONENTES EN LA
ECUACIN DE VELOCIDAD Y NOS
DICE CUNTAS MOLCULAS
ESTN REACCIONANDO EN LA
ETAPA MS LENTA DE LA
REACCIN.
Cuando la concentracin de uno de
los reactantes es tan alta que
permanece casi constante durante la
reaccin, se dice que es de orden
cero con respecto a ese compuesto,
y por ende el trmino de ese
reactante puede eliminarse de la
ecuacin.
12
| | | | | |
1
0
2
1
1
S k S S k V = =
Una reaccin de primer orden es
aquella que depende de la
presencia de un solo sustrato
13
| | S k V =
Las ecuaciones de velocidad en
la prctica corriente usan ms
de dos reactantes y esto las
hace demasiado complicadas,
pero se escogen condiciones a
voluntad de modo que se
efecten en varias etapas y que
cada etapa sea de primer orden
14
| | | |
1
2
1
1
S S k V =
S1 + S2 P1 + P2
Variables cinticas para una
reaccin enzimtica sencilla



K
1
y K
-1
gobiernan la V de asociacin y
disociacin de E con S, respectivamente
Kcat, mide la actividad cataltica de una enzima
Velocidades iniciales: curvas de progreso A|P|/
At, pendientes del origen
15
P E ES S E + +
K
1
K
-1
Kcat
Estudia la V de una reaccin y como cambia en respuesta
a cambios en los parmetros experimentales
Ecuacin de Michaelis-Menten
16
| |
| | S Km
S V
V
+
=
max
0
17
E saturada con S, velocidad
Independiente de [S]
[S] ++ reaccin de primer orden con respecto a S
De segundo orden: [E]
1
[S]
1

[S] intermedias, orden con respecto a S
es fraccionado, decrece de 1
ero
a orden 0
x b
ax
y
+
=
| |
| | S Km
S V
Vo
+
=
max
Hiprbola rectangular
| || | S E
Km
Kcat
Vo =
| || |
0
S E Kcat Vo =
Qu postularon Michaelis-
Menten?
La E se combina primero con S forma ES en un
proceso relativamente rpido y es reversible


ES luego se rompe en un paso lento y d E (libre) y
el P de la reaccin


En cualquier momento de la reaccin la enzima
existe en dos formas: E (libre) o combinada ES.

18
K
1
K
-1
K
2
K
-2
ES S E +
P E ES +
Al comienzo V depende de [S] y el equilibrio
ir a la derecha

La Vmax se alcanza cuando E est como ES:
saturacin

La reaccin luego alcanza el estado
ESTACIONARIO, [ES] y otros intermediarios
permanecen constantes en el tiempo

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Qu es Vmax ?
Ecuacin de V para la regin de pseudoprimer
orden de la curva:
Vo (saturacin) = Vmax = K [E][S]
0
= K [E]total = Kcat [ES]
En la Saturacin casi todas las molculas de E
existen como ES y aqu opera Kcat: constante
de V para la conversin de ES a E (libre) y
producto
Kcat = Vmax/ [E]total, la cual es la medida de V
con la cual una enzima puede catalizar una
reaccin

20
Qu es Km ?
Km es la [S] a media saturacin de E
Tiene unidades de concentracin
Puede ser la constante de disociacin para el
complejo ES, cuando Kcat es despreciable:
-A menor Km, ms firmemente se fija el S a E
-Se usa para estimar la [S] dentro de una clula
21
22
23
24
Indica la eficiencia cataltica de las
enzimas:
-Km: estabilidad del complejo [Elibre][S] /
[ES]
-Kcat: mide la actividad cataltica de una
enzima y de cuantas reacciones por segundo
puede catalizar una molcula enzimtica.
-Kcat tiene valores ~ 10
3
s
-1
-Kcat / Km tiene valores ~ 10
8
a 10
9
M
-1
s
-1


25
26
27
28
La mayor velocidad a la cual dos solutos sin carga pueden aproximarse
entre si por difusin
Cmo trabajan las enzimas?
Sitio activo
Sustrato
Afectan las velocidades de reaccin, no el equilibrio
29
Alineacin de grupos reactivos
Formacin de intermediarios inestables cargados
Rearreglo de enlaces
Otras transformaciones
La energa de activacin AG
++
seala la diferencia de energa
entre el estado de transicin y el basal
Porqu existen las barreras de
activacin?
Son cruciales para la vida
La estabilidad de una molcula aumenta con su barrera
Si no fuera as, macromolculas complejas revertiran
espontneamente a formas moleculares ms simples y el
orden elevado de estructura y los procesos metablicos
complejos de las clulas no existiran
30
31
32
INHIBICIN REVERSIBLE
El inhibidor se une con fuerza no-covalente a
la Enzima
Al unirse a E interfiere con su actividad y
evita la formacin de ES y posteriormente E
+ P
Se usan para investigar los mecanismos
enzimticos y descifrar las vas
metablicas
Ayuda a estudiar la especificidad de una
enzima
33
Arquitectura fsica y qumica del sitio
activo
Se puede eliminar con dilisis o filtracin
en gel


Se clasifican en:
Inhibidores Competitivos
Inhibidores Acompetitivos
Inhibidores No-competitivos

| || | | | EI I E Ki / =
34
Inhibicin Competitiva
Es comn que S se unan en el mismo sitio
activo, pero algunos inhibidores se unen a
sitios diferentes al del S y sigue siendo
competitiva

La capacidad para formar ES depende de la
cantidad de S e I presentes y de sus
afinidades relativas
35
La formacin de EI se puede revertir
aumentando [S]
Mientras ms potente el inhibidor se
necesita ms [S] para tener la media
saturacin o Km = Km (aparente)
Vmax no se afecta con la presencia
de este Inhibidor

36
Inhibidores competitivos
Los Inhibidores son por lo general
anlogos no metabolizables del
sustrato
Derivado del sustrato
Sustrato alterno de la enzima
El producto de la reaccin

37
38
Inhibicin Competitiva
| | ES kp v =
| |
| |
| | | | | | EI ES E
ES kp
Et
v
t
+ +
=
| |
| |
| | E
Ks
S
ES =
| |
| |
| | E
K
I
EI
i
=
P E ES S E + +
I
+
EI
Ki
Ks Kp
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
| |
|
|
.
|

\
|
+ +
|
|
.
|

\
|
=
E
K
I
E
K
S
E
E
K
S
E k
v
i s
s
t p
| |
| | | |
i s
s
K
I
K
S
K
S
V
v
+ +
=
1
max
| |
| |
| | S
K
I
K
S
V
v
i
s
+
|
|
.
|

\
|
+
=
1
max
39
| |
| |
| | S
K
I
K
S
V
v
i
s
+
|
|
.
|

\
|
+
=
1
max
40
Inhibicin Acompetitiva
Se une reversiblemente al complejo
ES y no a E, generando ESI inactivo

Es comn en los sistemas de
mltiples reactantes, en los cuales
se enlaza solamente al complejo ES
41
Vmax ser menor
Km aparente decrece, debido a la
utilizacin de ES por el I

42
43
Inhibicin Acompetitiva
P E ES S E + +
+
I
ESI
| | ES kp v =
| |
| |
| | E
Ks
S
ES = | |
| |
| | I
K
ES
ESI
i
=
Ki
Ks Kp
| |
| | | | | | ESI ES E
ES kp
E
v
t
+ +
=
| |
| || |
| |
| || | | || || |
|
.
|

\
|
+ +
=
Ks Ki
E I S
Ks
S E
E
Ks
S E
E kp
v
t
.
| |
| |
| |
|
.
|

\
|
+ +
=
Ki
I
S Ks
S
V
v
1
max
| |
| | S Km
S V
v
o +
=
max
| |
| | S
Km
S
V
v
+
=
o
o
max
44
| |
| | S
Km
S
V
v
+
=
o
o
max
45
Inhibicin No-Competitiva
Se unen tanto a E como a ES, de modo que
se pueden formar complejos EI y ESI, ambos
inactivos
Por lo general, I no es semejante a S
Se comporta como un removedor de E de la
solucin, por tanto decrece la Vmax pero no
cambia Km.
Esta inhibicin no se supera al aumentar [S]
46
No-competitiva pura: Cuando el I se fija a E y
ES con igual afinidad
No-competitiva mixta: cuando las afinidades
de unin del I a E y ES son diferentes
La inhibicin puede ser revertida por dilisis
exhaustiva de la enzima inhibida, siempre y
cuando la reaccin entre E e I no sea
covalente.

47
48
Inhibicin No-competitiva
| |
| || | | || || |
Ki Ks
S I E
Ks
S EI
ESI
.
= =
| |
| || |
Ki
I E
EI =
| |
| || |
| | | | | || |
| | E
Ki Ks
I S
Ki
I
Ks
S
Ks
S E
E kp
v
t
|
.
|

\
|
+ + +
=
.
1
| |
| |
| |
| |
|
.
|

\
|
+ +
|
.
|

\
|
+
=
Ki
I
S
Ki
I
Ks
S
V
v
1 1
max
| |
| | S Km
S
V
v
o o +
=
max
| |
| | S Ks
S
V
v
+
=
o
max
49
| |
| | S Ks
S
V
v
+
=
o
max
50
Inhibicin Irreversible
Se enlazan de forma covalente y estable a la E,
se combinan y destruyen un grupo funcional
que es esencial para la catlisis

No es revertida por dilisis a menos que el
enlace sea lbil qumicamente como un ester o
un tioester
51
Para que se usan? Permiten identificar aa del
sitio activo por sustitucin especfica de sus
cadenas laterales
Ejemplo: el grupo thiol del sitio activo de la
gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa
reacciona con -cloromercuribenzoato, el cual
no revierte con dilisis ni adicin de S.

52
Drogas como inhibidores enzimticos:
antimetabolitos
-Sulfa (sulfanilamida), agente
antibacterial, compite con el cido -
aminobenzico (PABA)
Dihidropteroate synthetasa
cido flico
53
Methotrexato, evita la biosntesis de purinas
y pirimidinas, es anlogo del dihidrofolato,
compitiendo con este por la dihidrofolato
reductasa