Cromatografa liquida de alta eficiencia

Cromatografa de lquidos es porque la mayora de los compuestos no son suficientemente voltiles para que se les pueda aplicar la cromatografa de gases La HPLC utiliza presin elevada que forsa al disolvente a pasar por una columna que contiene partculas muy finas obteniendo separaciones de gran resolucin

El proceso cromatografico

La cromatografa de lquidos se hace con columnas empaquetadas. Las partculas pequeas aseguran mayor eficacia pero requieren mayor presin. La eficacia de una columna empaquetada aumenta al disminuir el tamao de las partculas de la fase estacionaria.

Una razn por la cual las partculas originan mejor resolucin es que permite un flujo ms uniforme a travs de la columna. Cuanto ms pequea son las partculas, menor es la distancia en la que debe difundirse el soluto en la fase mvil. La desventaja que tienen las partculas pequeas es la resistencia que ofrecen al flujo del disolvente.

La columna

El equipo HPCL utiliza columnas de acero o de plstico de una longitud de 5 a 30 cm y un dimetro interior de 1 a 5 mm. Las columnas son caras y se degradan con facilidad por el polvo, o las partculas de partculas de la muestra o del disolvente. Las partculas finas y solutos que se adsorben con fuerza quedan retenidos en la precolumna, que hay que reemplazar peridicamente.

Al aumentar la temperatura se acortan los tiempos de retencin y mejora la resolucin porque aumenta la velocidad de difusin de los solutos.

Aumentando la temperatura se puede degradar la fase estacionaria y reducir la vida de la columna.

Debe controlarse la temperatura porque si no se fluctua con la temperatura ambiente Usando un horno se mejora la reproducibilidad de los tiempos de retencin y la precisin del anlisis cuantitativo.

La fase estacionaria

El soporte ms comn en la HPLC son partculas micro porosas esfricas de slice muy puras, que son permeables al disolvente. La slice, por lo normal, se disuelve en agua a un pH superior a 8, por lo que no puede utilizarse por encima de ese pH. Algunas calidades de slice son estables a un pH de 9 o 10.

La slice pura se puede utilizar como fase estacionaria en cromatografa de adsorcin. Concretamente en la cromatografa de reparto liquido-liquido, que se lleva a cabo con fase estacionaria enlazada covalentemente a la slice, mediante reacciones tales como:

Proceso de Elucin
En la cromatografa de absorcin el disolvente compite con las molculas del soluto por ocupar los sitios activos de la fase estacionaria.

La Elusin se describe como el desplazamiento de un soluto de la fase estacionaria por el disolvente.

La serie eluotropica es la ordenacin de los disolventes segn su capacitad relativa para desplazar solutos de un determinado absorbente.

La fuerza eluyente () es una medida de energa de adsorcin del disolvente, supuesto el valor cero para el pentano en relacin con slice pura. Cuanto ms polar es el disolvente, mayor es su fuerza eluyente respecto a la slice, en cromatografa de adsorcin.

Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, tanto ms rpidamente se eluirn los solutos de la columna.

Tabla 25.1 Serie eluotrpica y longitudes de onda de corte en el ultravioleta de los disolventes, en cromatografa de adsorcin sobre slice.

La cromatografa de adsorcin sobre slice pura es un ejemplo: Cromatografa de fase normal, que se caracteriza por una fase estacionaria polar y un eluyente menos polar. La cromatografa de fase inversa, que es la ms utilizada, se caracteriza porque la fase estacionaria es no polar o dbilmente polar y el disolvente es ms polar.

Las molculas del disolvente y las molculas del soluto compiten entre s por reaccionar con los puntos activos de la fase estacionaria. Cuanto mayor es la fuerza eluyente del disolvente, ms fcilmente se desplaza al soluto.

Elucin isocrtica y gradiente

La elucin isocrtica se lleva a cabo con un nico disolvente (o una mezcla de disolventes de composicin fija). Si un disolvente no permite una elucin suficientemente rpida de todos los componentes, se puede usar una elucin de gradiente. En ese caso, se van aadiendo cantidades crecientes del disolvente B al disolvente A, produciendo as un gradiente continuo. En una separacin de fase inversa, la fuerza eluyente disminuye a medida que el disolvente se hace mas polar. Es habitual llamar disolvente A al componente acuoso, y disolvente B al orgnico.

SELECCIN DEL MODO DE SEPARACION

Existen varios modos de separar los componentes de una mezcla dada Si la masa molecular del analito es menor que 2000, hay que usar la parte superior de la figura; si la masa molecular es mayor que 2000, la parte inferior.

Si los solutos se disuelven solo en los disolventes no polares o dbilmente polares, el rbol de decisin sugiere que se pruebe la cromatografa de fase inversa. La eleccin puede ser de fase enlazada con grupos octadecilo (C18), octilo, butilo, etilo, metilo, fenilo y ciano.
Si las masa moleculares de los solutos son 2000 son solubles en disolventes orgnicos y su dimetro molecular es 30 nm, la figura 25.12 indica que se intente la Cromatografa de exclusin molecular. Si la masa molecular de los solutos es 2000 y son solubles en agua, pero no son inicos, y tienen dimetros 30 nm, el rbol de decisin nos dice que hay que usar cromatografa de fase inversa o cromatografa de interaccin hidrfoba.

Si las masa moleculares de los solutos son 2000 son solubles en disolventes orgnicos y su dimetro molecular es 30 nm, Si la masa molecular de los solutos es 2000 y son solubles en agua, pero no son inicos, y tienen dimetros 30 nm, el rbol de decisin nos dice que hay que usar cromatografa de fase inversa o cromatografa de interaccin hidrfoba.

La cromatografa de interaccin hidrfoba est basada en la interaccin de una fase estacionaria con la regin hidrfoba de un soluto como por ejemplo de una protena. Las sustancias hidrfobas repelen el agua; el agua no las moja.

Notas sobre disolventes

En HPCL se necesitan disolventes muy puros y caros, de calidad HPCL, para evitar que se degraden por impurezas las columnas, que son caras, y para minimizar el ruido del fondo de las seales del detector debido a los contaminantes. Se pone un filtro en la salida del depsito del disolvente, para impedir el paso de partculas micromtricas.

Est recomendado lavar la columna analtica peridicamente, parar prolongar su vida. Los disolventes se deben purgar previamente, burbujeando He a travs de ellos, o aplicando vacio, para eliminare el aire disuelto. Las burbujas de aire crean dificultades en las bombas, en las columnas y en los detectores.el oxigeno disuelto absorbe radiacin UV en el intervalo de longitudes de onda de 200 a 250 nm, interfiriendo en la deteccin en el UV. Cuando se trabaja con elucin en gradiente en separaciones de fase inversa, despus de cada anlisis se debe pasar por la columna un volumen de disolvente igual a 10-20 volmenes de columna vaca, para acondicionar la fase estacionaria con el disolvente antes del siguiente anlisis.

INYECCION Y DETECCION EN HPLC

Consideremos el instrumental necesario para inyectar la muestra y el disolvente dentro de la columna, y para detectar los compuestos a medida que salen de ella. La deteccin por espectrometra de masas, que es muy potente e importante,

Bombas y vlvulas de inyeccin

La calidad de una bomba en HPLC se mide atendiendo a si produce un flujo constante y reproductible. Un caudal fluctuante da origen a ruido en el detector, que no se deja ver bien las seales dbiles. El proceso de formacin de gradiente se controla electrnicamente, y se puede programar con una precisin del 0.1% en volumen.

Fercho

La bomba se haya conectada a un reservorio de disolventes y tiene como principal funcin suministrar la presin adecuada, para que el eluyente atraviese la columna con un flujo constante. Existen diferentes tipos de bombas que emplean diversas mecnicas. Cuando la elucin se realiza con un nico solvente es conocida como isocrtica.

Algunos son capaces de preparar sistemas de elucin partiendo de varios solventes.

Detectores espectrofotomtricos

Un detector ideal, de cualquier tipo que sea, debe ser sensible a pequeas concentraciones del analito, dar una respuesta lineal y no ensanchar los picos del cromatograma. No debe ser sensible a variaciones de temperatura y de la composicin del disolvente. Para evitar que se ensanchen los picos, el volumen del detector debe ser menor que el 20% del volumen de la banda cromatografica. Las burbujas producen ruido, para impedir que se formen se debe aplicar al detector una contrapresin.

Los detectores de ultravioleta estn indicados por elucin en gradiente, y para disolventes que no absorben a la longitud de onda de trabajo. Los detectores de fluorescencia excitan el eluato con un laser, y miden la fluorescencia que se origina. Estos responden solo a analitos que presenten fluorescencia. Para aumentar la utilidad de los detectores de fluorescencia y los electroqumicos, se pueden enlazar covalentemente al analito grupos fluorescentes o electroactivos. Este proceso de derivatizacin se puede llevar a cabo en la muestra antes de hacer la cromatografa, o aadiendo los reactivos al eluato entre la columna y el detector (llamada derivatizacion postcolumna).

Tipos de detectores
Detector de ultravioleta Es el mas utilizado

DETECTOR DE NDICE DE REFRACCION

Un detector de ndice de refraccin responde a casi cualquier soluto, pero su lmite de deteccin es 1000 veces peor que el de un detector de ultravioleta. Los detectores de ndice de refraccin no sirven en elucin en gradiente, porque es imposible ajustar exactamente la muestra y al referencia mientras varia la composicin del disolvente.

La principal ventaja de este detector es que es casi universal, y responde a todos los solutos, incluso aquellos que absorben poco en el ultravioleta.

Palabras clave y antecedentes:

La altura de plato. El nombre est tomado de la teora de destilacin, en la que la separacin se lleva a cabo en pasos discretos llamados platos. La altura de plato tambin se llama la altura equivalente a un plato terico. En cromatografa no existen platos fsicos, de manera que se debe considerar la altura de plato como un trmino que relaciona la anchura de una banda con la distancia que ha recorrido a travs de la columna. Cuanto ms pequea es la altura de plato, ms estrecha es la banda. La capacidad de una columna para separar componentes de una mezcla mejora al disminuir la altura de plato. Las alturas de plato en cromatografa de gases valen entre 0.1 y 1 mm, en cromatografa de lquidos de alta eficiencia (HPLC) valen aproximadamente 10 m, y en electroforesis capilar, menos de 1 m.

Cuestionario
1.

Que ocurre al disminuir el tamao de la partcula? Aumenta el numero de platos, la presin y disminuye el tiempo optimo de elucin. Qu se utiliza para prevenir la degradacin de la columna en el HPLC? Con una precolumna Qu es la fuerza eluyente? Es una medida de energa de adsorcin del disolvente Que es una serie eluotrpica? Es la ordenacin de los disolventes segn su capacidad relativa para desplazar solutos de un determinado absorbente

2.

3.

4.

5.

Cul es la diferencia entre la cromatografa de fase normal y la de fase inversa? La de fase normal utiliza una fase estacionaria polar, cuanto mas polar es el disolvente mas fuerza eluyente tiene. En la de fase inmersa utiliza una fase estacionaria no polar, cuanto menos polar es el disolvente mas fuerza eluyente tiene. Por qu el agua tiene menor poder eluyente en separaciones de fase inmersa y mayor fuerza eluyente en separaciones de fase normal? Por que es polar. Qu es un intervalo lineal? Es el intervalo de concentracin del analito dentro de la cual la respuesta del detector es proporcional a la concentracin. Qu es un intervalo dinmico? Es un intervalo dentro de la cual el detector responde de la manera que sea a la concentracin del analto.

6.

7.

8.

9.

Qu es el limite de deteccin? Es la concentracin del analito que da una relacin seal/ruido definida. Cul es el detector mas utilizado? El detector ultravioleta Mencione algunos detectores: Detectores espectrofotomtricos, Detector de ndice de refraccin, Detector de luz previa evaporizacin y Detector electroqumico.

10.

11.