MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS

- Tema 1: Inocuidad de alimentos - Tema 2: Enfermedades patgenas de origen alimentario - Tema 3: Rastreo Alimentario - Tema 4: Proteccin de Sistemas Alimentarios

- Tema 5: Programas de Microbiologa de Alimentos

Winrock International Farmer-to-Farmer Program Presentation Farmer-toat FUSADES, El Salvador (June 27-July1 2005) FUSADES, 27By Steven Pao, Ph.D. Virginia State University

Programas Microbiolgicos de Alimentos - Programa de rutina de microbiologa de alimentos - Detectando y confirmando microorganismos en alimentos - Programa de Investigacin de Microbiologa de alimentos - Investigacin de Actividades Microbiolgicas en Sistemas de Alimentos

Cmo estudiar microorganismos en alimentos?



Grupos selectos de microorganismos

Microorganismos totales, mohos y levaduras, u otros grupos especficos de organismos La industria de alimentos en EUA condujo 144 millones de exmenes microbianos en 1999
(Weschler. 2001. Food Quality. 8/4:43-44) Mohos y levaduras 15.7%

Microbios totales 37.2%

Patgenos 16.3%

Coliformes/E. coli 30.8%

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Seleccionando mtodos de deteccin

Deteccin cualitativa (presencia/ausencia) Deteccin cuantitativa (recuento de microbios)
Sustrato cromognico (X-Gal)

(-)

(+)

Substrato fluorescente (MUG)

(-)

(+)
http://www.aicompanies.com/SB I_products/Qcount/qcount.htm

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Seleccionando muestras concentradas

Sensibilidad detectada (10/g, 1/g, 1/25g, etc.) Rango de deteccin (TNTC)

CDC
http://www.biotrace.co.uk/content.ph p?hID=2&nhID=158&pID=44

CDC

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Recuento de problemas detectados

Falso positivo y negativo Competencia, inhibicin, dao y nuboso

Tres placas de agar fueron usados para aislar una bacteria patgena. Los tres platos fueron inoculados con la misma muestra de agua, pero la mezcla de agar se diferencian en su composicin qumica

CDC

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El patrn de distribucin es importante

Al azar vs. no al azar Uniforme vs no uniforme Plan de muestreo y combinaciones

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Usando herramientas de deteccin rpida

 Vista de clulas bajo microscopio

 Recuento de colonias en platos petri

 Otros mtodos

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Detectando ambos E.coli y coliformes (24 a 48 horas)

<0.1 a 1 ml de muestras por examen Conteo cuantitativo (<150 clulas) Colonias azules con gas (E. coli) Colonias rojas y azules con gas (coliformes) http://www.mmm.com/microbiology/home/products/p etrifilm

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Programas Internos QC

Liofilizacin (Congelado-deshidratado) cultivo de clulas de un organismo * Usar (+) o (-) control de organismos en anlisis microbianos.

http://intlbioproducts.com/FrameSet.htm

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Programas Internos QC

* Almacenaje y calidad de medios microbianos * Estabilidad de temperatura en incubadores, baos de agua, etc. * Calibracin de equipo, certificacin y cuidado

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Programas Internos QC

* Protocolo de desperdicios de residuos y autoclaves * Seales de peligros por materiales de alto riesgo * rea de trabajo, validacin y limpieza * Trabajadores calificados, entrenamiento y turnos * Seguridad del laboratorio y material de depsito * Coleccin de datos, aprobaciones y manteniendo registros

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Monitoreando el comportamiento, ambientes y manipulacin de alimentos Crecimiento y tipo de crecimiento Promedio de muerte y sobrevivencia
Curva tpica de crecimiento microbial
Stationary

CFU/g

Log

Decline

Lag Inhibited growth

Time

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Dnde?
Recibo, lavado, encerado, empacado

Planeacin Muestreo Pruebas

Resultado/Interpretacin
  

Qu?
Agua, alimentos, equipo

Cundo?
Tiempo, frecuencia

Quin?
Personal de la compaa, servicio de laboratorio

Registro/Reporte


Cmo?
Cualitativo, cuantitativo

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Planeacin de Proyectos
Encuesta microbial y perfiles Evaluacin del almacenamiento y vida til Desafos y estudios de inoculacin Procesos de evaluacin y validacin Sanidad eficaz Determinacin de tiempo de muerte Desarrollo de mtodos microbiales

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Planeacin de Proyectos
Contar costos (tiempo, material, revisin de literatura, y personal involucrado) Nivel de informacin (datos brutos, anlisis de datos, interpretacin de datos, publicacin de datos y presentacin, y mantenimiento de datos) Esfuerzos de cooperacin y coordinacin Suministro de equipos Sitio de prueba

Inspeccin Microbial para Evaluaciones de Riesgo

La reduccin de microorganismos en la superficie de ctricos durante el proceso de embalaje
(Pao and Brown. 1998. J. Food Protection. 61:903-6) Organismos Aerbicos? Fruta fresca Organismos Aciduricos? Lavado Mohos y levaduras? (Fecal ) Coliformes? Empacado Salmonella?
MP N/cm2
1 Dump Wash Wax Pack 4
Aerobic Organisms Aciduric Organisms L o g C F U /cm 2

Yeasts & Molds

40 30 20 10 0 Dump

Total Coliforms Fecal Coliforms Salmonellae

Encerado

Wash

Wax

Pack

Muestra de ambientes (para inspeccin)

http://intlbioproducts.com/FrameSet.htm

Tomando Informacin
   

Proceso eficaz Operacin General Conformidad del Producto Rastreo del Producto

USDA Photo

Estudios de desafos microbiales

Estudios con bacterias patgenas selectas sobre naranjas frescas mondadas
(Pao, Brown, and Schneider. 1998. J. Food Science. 63:359-62)

24 oC

8 oC

4 oC

Salmonella spp.

Staphylococcus aureus

E. coli O157:H7

Listeria monocytogenes

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Pruebas de Vida til

La entrega de un producto de mxima calidad, la vida til ser determinada por evaluaciones organolpticas y microbiolgicas. La evaluacin sensorial de un alimento es un mtodo directo para determinar la vida til. Sin embargo, los cambios sensoriales no son siempre detectables hasta que la poblacin microbiana es alta.
Curials 1998; Http://www.foodproductdesign.com/achive/1998/0298QA.html.

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Pruebas de vida til

Seales comunes del final de la vida til de un producto
10 millones de bacterias por gramo 100,000 levaduras por gramo 3-log aumenta en la cuenta total Mohos visibles en el producto Producto o empaque soplado

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Pruebas de vida til

La evaluacin de la duracin de la vida til en el estante debe ser la misma o preferiblemente mas larga que el objetivo de la vida til en el mostrador (60 das en el refrigerador o 6 meses) Para la mayora, el tiempo de vida til anticipada es dividida de 5 a 12 intervalos por muestra colectada y analizada.

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Prueba de vida til

Se debe considerar almacenaje, transporte, exhibidores, bodegas, temperatura, humedad etc. Debe usarse un muestreo apropiado y procedimientos de pruebas. En general, abrir un nuevo empaque para cada prueba.

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Prueba de Vida til

En general, los organismos crecen a temperaturas entre 0-55 C, entre un valor de pH de 2-10, y niveles de actividad de agua de 0.6. Mtodos fsicos, qumicos o sensoriales deben ser usados en estudios de vida til si los microbios no crecen del todo durante el tiempo esperado.

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Prueba de Vida til

Enlatados y alimentos embotellados son usualmente sujetos a pruebas aceleradas de descompocisin (muestras incubadas a elevadas temperaturas o condiciones de abuso de almacenamiento) La vida til de alimentos congelados es usualmente determinada por pruebas fsicas, sensoriales o qumicas.

Examinando las Tecnologas que Emergen para la Seguridad de Alimentos

Comparando nuevos mtodos de mondado para ctricos
(Pao, Petracek, & Brown. US Patent 5,560,951 & 5,817,360; Pao & Petracek. 1998. J. Food Process Engineer. 21:49-58)

Infusion al Vacio

Inyeccion de baja presion

Analizando Riesgos dentro de los Sistemas de Alimentos

Las Diferencias entre la infiltracin de la solucin de tinte y clulas bacterianas en el rea del tallo de las naranjas.
(Pao, Davis, and Parish. 2000. J. Food Protection. 64:310-4) Azul brillante tie la solucin y S. rubislaw la protena verde fluorescente se expresa 25C 25C 4h Microtome sectioning SEM
Campo oscuro Campo brillante
500 m

Penetracin del tinte

GFP clulas

Perforacin de places

Requerimientos establecidos para programas de HACCP

6 5 4 3

(60 oC)

Escherichia coli (log CFU/cm 2)

2 1 0 6 5 4 3 2 1 0 6 0 5 4 3 2 1 0 0 1 2 3 4 5

Alcanza 5-log reduccin de Escherichia coli inoculada sobre la superficie de naranjas (Pao & Davis.
1999. J. Food Protection. 62:756-60)

(70 oC)

 rea de cicatriz del tallo o Superficie completa  Superficie sin la cicatriz del tallo

(80 oC)

Superficie de la cascara  Albedo  Pulpa  Centro



Time (min)

Fig. 1. Tiempo de Muerte trmica de Salmonella en brote de Soya (50g/tratamiento)

FIG. 1. Thermal Death Time for Salmonella in Soybean Sprouts (50g/treatment)

8 7 6 5 4 3 2 1
0 5

E. coli (Log cfu/g)

70C 80C R2 = 0.9575 R = 0.9438 R2 = 0.9257 R2 = 0.8493 10 15 20 25 30

2

90C 100C

Time (second)

Fig. 3. Prueba de Resistencia Trmica de Organismos en brotes de Soya (50g/tratamiento)

FIG. 3. Thermal Resistance of Test Organisms in Soybean Sprouts (50g/treatment)

1

Log D -value (second)

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 70 75 80 85 90 95 100
R = 0.9567
2

R = 0.9962

Salmonella spp. Escherichia coli

Temperature (C)

Evaluacin de Tratamientos Antimicrobiales

Efectos de limpieza de la cera en la superficie de naranjas (Pao, Davis, Kelsey, Petreacek. 1999. J.
Food Science. 64:359-62) Reduccin de E. coli sumergiendo la fruta en cera por 2 minutos.

Natural

5 L o g C F U /c m 2 4 3 2 1
pH

25C 50C 60C 8 10 11

Shellac

Desarrollo de Mtodos Rpidos de Deteccin

Ensayos fluorescentes para deteccin rpida de Escherichia coli en jugo de frutas cidas (Pao, Davis, Friedrich, & Parish. 2001. Applied & Environmental Microbiology. In review)
Sustrato cromogenico (X-Gal) Jugo de Uvas fresco (pH 3.0) con E. coli 10 ml Bolsa E*Colite con NaHCO3 solucin (100 ml) 48 h; 35 oC Sustrato fluorogenico (MUG) Fluorescence (%)
100 80 60 40 20 0 0 0.05 0.1 0.25 0.5 Sodium Bicarbonate (%) 1

(-)

(+)

Prueba de Spectrofluorometrica

(-)

(+)

Evaluacin de Equipo de Procesamiento

Transferencia natural y artificial de microbios inoculados de jugo de frutas durante la extraccin. (Pao & Davis. 2000.
Lebensm.-Wiss.u.-Technol. 34:113-7)

Total organisms Aciduric organisms Lactobacillus plantarum Escherichia coli

0 2

Low end

High end

10

12

Transfer (%)

Trabajando con Suministradores de Qumicos

Eficacia de limpieza alcalina para la descontaminacin de frutas (Pao, Davis,
and Kelsey. 2000. J. Food Protection. 63:961-4) A. B. C. D. Agua Limpieza cida (pH 2.0) Limpieza alcalina (pH 10.8) SOPP o limpieza alcalina (pH 11.8) Inoculacin

Reduction (Log CFU/cm2)

5 4 3 2 1
2.1 1.9 2.3 3.5

Lavadora

Secador de Cera A B C D

Trabajando con Servicio de Laboratorio

Comparacin de fijacin, tolerancia al calor, y resistencia de alcali de cultivo de bacterias patgenas y no patgenas en naranjas
(Pao & Davis. 2001. J. Rapid Methods & Automation in Microbiology. In press) 10 potenciales reemplazos fueron comparados



Sumergir Inoculacin 15min; 21oC Escurrir 45min; 25oC

En contra deSalmonella spp. & E. coli O157:H7 SR-value, D-value, y resistencia al alkali E. coli ATCC 11229 L. fermentum ATCC 538 L. plantarum ATCC 14917

Reemplazos de estudios termales de sanidad

Reemplazos de sanidad por estudios de alcalinidad - E. coli ATCC 25922

L. fermentum ATCC 538

Prueba microbiolgica