Conservacin de germoplasma

El hombre ha dependido bsicamente de los vegetales como fuente de energa. Las tcnicas modernas de produccin de variedades mejoradas, altamente homogneas, han provocado la reduccin de la variabilidad gentica de las especies cultivadas, ocasionando una verdadera erosin gentica. Cuando se habla de preservacin de germoplasma hay que subrayar que el objetivo es conservar, con la mayor integridad posible, la variabilidad gentica de las poblaciones seleccionadas.

Mtodos empleados para la conservacin de germoplasma

Depende de la naturaleza del material vegetal, y est definida por la duracin de su ciclo de vida, el modo de reproduccin y el tamao de sus individuos Se han intentado diversas alternativas de conservacin, que van desde el tradicional banco de semillas hasta el mantenimiento de reas de reserva.

 Sin embargo, en muchos casos el mantenimiento no es posible y en otros resulta sumamente costoso, siendo muy elevados los riesgos de prdidas por manipulacin o desastres naturales. Los mtodos de conservacin de germoplasma pueden dividirse en mtodos in situ y mtodos ex situ.

Mtodos in situ
Se basan en la conservacin de las plantas en sus hbitat natural e incluyen la conservacin en parques nacionales y en reservas ecolgicas, lo cual requiere de un considerable espacio fsico e implica altos costos, asociados a la necesidad de mano de obra especializada, control permanente de enfermedades y malezas, a la par que las plantas estn expuestas a las inclemencias del clima y de los incendios

Mtodos ex situ
se basan en el mantenimiento del material biolgico en bancos de semillas, bancos de cultivo in vitro, colecciones de plantas (en campo, viveros o jardines botnicos). Los bancos de semillas constituyen uno de los mtodos ms convenientes para la conservacin de germoplasma ex situ Permiten almacenar una gran variabilidad gentica en forma econmica y prctica.

 Para la conservacin de semillas el International Plant Genetic Resouces Institute (IPGRI) recomienda su desecacin hasta un 3-7% de humedad y su almacenamiento a bajas temperaturas (18C). Este protocolo de conservacin es, en general, el ms recomendado para la mayora de las especies que se propagan por semillas y cuyas semillas resisten la desecacin sin que ello implique prdida de viabilidad.

 A las semillas que presentan estas caractersticas se las denominan semillas ortodoxas, como por ejemplo las semillas de arroz, trigo, avena, tabaco, tomate y lechuga.

 No es aplicable porque la especie se propaga, en la prctica, vegetativamente, (como papa, caa de azcar, pltanos y bananos), o bien porque sus semillas pierden rpidamente la viabilidad cuando son sometidas a procesos de desecacin. A estas semillas se las denominan semillas recalcitrantes. Las semillas de numerosas especies que viven en zonas tropicales o subtropicales se incluyen en esta categora, como por ejemplo las de coco, cacao, frutales tropicales y diversas palmeras.

Otro mtodo de conservacin de germoplasma ex situ, es mediante el cultivo in vitro de tejidos. Mantenimiento in vitro del germoplasma de diversas especies. implican el cultivo, bajo condiciones de asepsia, de rganos o fragmentos de rganos (meristemas, semillas, embriones somticos, embriones cigticos, hojas, tallos, races, yemas, polen, anteras, callos o protoplastos), en un medio de cultivo artificial definido, bajo condiciones ambientales controladas.

Cultivo in vitro
Utilizada para mantener colecciones en crecimiento mnimo. Reducir la temperatura, reducir las condiciones de luminosidad, modificar el medio de cultivo, adicionar al mismo inhibidores osmticos o retardantes del crecimiento, deshidratadores de tejido o modificar la fase gaseosa del recipiente de cultivo. Se basan en reducir el metabolismo celular y con ello reducir el crecimiento y el nmero de subcultivos durante meses hasta un ao, sin que ello afecte la viabilidad de los cultivos.

La crioconservacin consta de seis pasos:

Seleccin del material a crioconservar Deshidratacin Aclimatacin Almacenamiento Descongelamiento y rehidratacin Tests de viabilidad

Seleccin del material a crioconservar

Cuando se realiza la seleccin del material a crioconservar se debe tener la absoluta seguridad de que a partir del mismo se obtendrn plantas completas. El explante seleccionado depender del objetivo de conservacin y est estrechamente relacionado con el tipo de propagacin de la especie. Por ejemplo, en el caso de la mandioca, especie que se propaga Principalmente por va asexual (mediante estacas), se conserva su germoplasma in vitro mediante el cultivo de microestacas y tambin de meristemas, con lo cual paralelamente a la conservacin se consigue el saneamiento de los cultivares.

Deshidratacin
La deshidratacin del explante es un paso crucial para el xito de la crio-conservacin, ya que es necesario eliminar toda el agua libre presente en el tejido vegetal, minimizando as posibles daos debidos a congelacin. La deshidratacin del tejido puede realizarse en una cmara a 0C o en cmaras hermticamente cerradas utilizando sustancias higroscpicas como silica gel o glicerol (5 - 20%), o sometiendo al explante a una corriente de aire en un flujo laminar de aire estril.

Aclimatacin

Rapida Lenta

La aclimatacin rpida consiste en colocar el explante directamente en nitrgeno lquido, con o sin la adicin exgena de crioprotectores. La aclimatacin lenta se realiza bajando gradualmente la temperatura (0.1-3C/min.). Este punto debe ser manejado cuidadosamente, pues una deshidratacin excesiva de las clulas puede exponerlas a una alta concentracin interna de solutos. Por esta razn, el material generalmente se congela lentamente, a una velocidad adecuada, hasta alcanzar una temperatura prxima a los -40 C. Luego se lleva directamente a la temperatura del nitrgeno lquido (-196 C).

 A fin de preparar (aclimatar) el explante para enfrentar las bajas temperaturas a las que ser sometido, se utilizan sustancias crioprotectoras como azcares (sacarosa, glucosa), alcoholes (glicerol, etileglicol, manitol y sorbitol), dimetilsulfxido (DMSO) y polivinilpirrolidona (PVP). Tambin pueden utilizarse soluciones de vitrificacin, que son una combinacin de varios crioprotectores tales como el PVS2, que est compuesto por 30% de glicerol, 15% de etilenglicol, 15% de DMSO y 0.04M de sacarosa. Tanto los crioprotectores como las soluciones de vitrificacin actan fundamentalmente como agentes anticongelantes, aumentando la viscosidad del tejido vegetal y reduciendo la permeabilidad de las clulas.

Almacenamiento
De acuerdo al material vegetal que se utilice, se presentan dos grandes sistemas: Sistemas secos: comprenden todos aquellos tejidos vegetales endgenamente resistentes y tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin. Sistemas hidratados: son todos aquellos tejidos vegetales no tolerantes a las bajas temperaturas y a la deshidratacin, por lo cual se requiere de una proteccin exgena. Esta proteccin puede lograrse a travs del uso de crioprotectores o bien porla utilizacin de soluciones de vitrificacin.

Sistemas
Los sistemas secos, por tratarse de tejidos ms resistentes, necesitan de una menor preparacin para el almacenamiento y comprenden aquellas especies que habitan zonas fras y/o templadas. Los sistemas hidratados son ms susceptibles a las bajas temperaturas y estn representados por todas aquellas especies que habitan zonas tropicales y subtropicales, las cuales no estn adaptadas para soportar temperaturas inferiores a 0C.

Descongelamiento y rehidratacin
Cuando se desea recuperar el explante mantenido en nitrgeno lquido se puede realizar un descongelamiento rpido en bao de agua (generalmente 1-2 min. a 30-40 C) o en forma lenta, sometiendo al explante a la temperatura del laboratorio o a una corriente de aire en el flujo laminar de aire estril.

Tests de viabilidad
Los tests de viabilidad nos permiten comprobar las zonas del tejido que han muerto y cules han sobrevivido al fro. La evaluacin de la viabilidad puede llevarse a cabo en forma visual, realizando el re-cultivo y determinando la capacidad de regeneracin, utilizando TTC (cloruro de 2,3,5 Trifenil- Tetrazolio) que colorea el tejido que ha sobrevivido a la crioconservacin o midiendo la conductividad elctrica, que permite estimar el dao producido en las membranas celulares.

Tcnicas de almacenamiento del material a preservar

En la ltima dcada han surgido numerosas tcnicas que combinan el uso de crioprotectores y de soluciones de vitrificacin con tcnicas de deshidratacin y encapsulacin, las cuales bsicamente pueden resumirse en tcnicas de: - Encapsulacin-deshidratacin - Vitrificacin - Encapsulacin-vitrificacin - Desecacin - Precultivo - Precultivo-desecacin - Gotita congelada.

Encapsulacin-Deshidratacin
Se basa en la metodologa aplicada a las semillas sintticas, en la cual un explante es recubierto por una matriz de alginato de sodio y polimerizado en una solucin de cloruro de calcio, formando un gel de alginato de calcio alrededor del explante. Una vez encapsulados, los explantes son pretratados, generalmente con sacarosa (que acta como crioprotector. En especies tolerantes al fro la exposicin de las plantas madres a bajas temperaturas durante varias semanas, previo a la criopreservacin, incrementa la supervivencia.

 La deshidratacin puede llevarse a cabo sometiendo las cpsulas de alginato (conteniendo a los explantes) a una corriente de aire en el flujo laminar o exponindolas en cmaras hermticamente cerradas con silica gel. Las cpsulas, as deshidratadas, pueden sumergirse directamente en nitrgeno lquido o bien pueden ser llevadas a un descenso lento de temperatura.

Vitrificacin
Esta tcnica involucra el pretratamiento de las muestras con soluciones de vitrificacin, como el PVS2 o bien otra, compuesta por 40% de etilenglicol, 15% de sorbitol y 6% de albmina srica bovina. Luego de la exposicin a las soluciones de vitrificacin (generalmente a una temperatura de 0C, a fin de disminuir los riesgos de fitotoxicidad), las muestras pueden ser sumergidas directamente en nitrgeno lquido o a travs de un descenso lento de la temperatura. El tiempo de exposicin a la solucin debe estar relacionado con el tamao del explante y la misma debe ser removida rpidamente luego del descongelado.

- Encapsulacin-Vitrificacin
Las muestras son encapsuladas en alginato de calcio y sometidas a vitrificacin durante el enfriamiento. La supervivencia del material vegetal cuando se utiliza esta tcnica es un 30% mejor que cuando se usa la de encapsulacin-deshidratacin. Esto puede explicarse debido a que las cpsulas de alginato de calcio reducen la toxicidad de las soluciones de vitrificacin.

Desecacin
Proceso muy simple que slo requiere la deshidratacin del material vegetal, la cual es crucial para el xito de la crioconservacin. Esta tcnica consiste en someter al explante a una corriente de aire en un flujo laminar o en cmaras hermticamente cerradas, que contienen silica gel, luego de lo cual se realiza un enfriado rpido sumergiendo el material directamente en nitrgeno lquido.

Precultivo
La tcnica del precultivo involucra la incorporacin de crioprotectores (durante distintos tiempos que dependen del explante) antes del congelamiento. Como ejemplos pueden citarse la adicin de altas dosis de sacarosa para la crioconservacin de meristemas de Musa spp.; la utilizacin de polietilenglicol (PEG) y dimetilsulfxido (DMSO) en el caso de embriones cigticos de Triticum aestivum y Phaseolus vulgaris; la utilizacin de sacarosa y DMSO o glicerol en semillas, embriones cigticos, polen y anteras de Oryza spp., y la utilizacin de cido abscsico para la conservacin de lneas celulares y de callos de Oryza sativa.

Precultivo-Desecacin
Es una combinacin de dos de las tcnicas descriptas anteriormente. Las muestras son tratadas con crioprotectores, parcialmente desecadas y luego sometidas a enfriamiento rpido o lento. Generalmente en el precultivo se emplean azcares como sacarosa o glucosa. La duracin del tratamiento es variable, desde horas, como en el caso de la conservacin de embriones maduros de Cocos nucifera, donde el cultivo dura 11-20 hs., hasta das, como en el caso de embriones somticos de Elaeis guineensis, que dura 7 das.

Gotita congelada
Esta tcnica ha sido aplicada con xito en pices de Solanum tuberosum. Consiste em pretratar el material con DMSO por 2-3 hs. en medio lquido y formar una microgota (2.5ml), la cual se suspende sobre papel de aluminio y luego se sumerge directamente en nitrgeno lquido. Este procedimiento es una adaptacin de la tcnica clsica desarrollada para meristemas de mandioca. Esta tcnica ha sido satisfactoriamente aplicada en 150 variedades de Solanum tuberosum, con un porcentaje de supervivencia del 40%.