Biotecnologa en Salud Humana

Ricardo Fujita, Ph.D.

Centro de Gentica y Biologa Molecular

Biotecnologa
Uso de seres vivos para obtener productos, desde hace miles de aos Bebidas fermentadas, panadera, quesos Agricultura: papa, maz, algodn, transgnicos Ganadera y mejoramiento animal: vacunos, gallinas, perros, transgnicos, etc. Salud: antibiticos, vacunas, protenas recombinantes, terapia gnica

Algunos avances tecnolgicos en biotecnologa

Mendel: Genotipo => fenotipo-1866 Desarrollo microbiologa-virologa -Pasteur, Koch, 1870 Cultivo de clulas in vitro - 1920 Descubrimiento estructura del DNA 1953 DNA recombinante => bancos genmicos, expresin-1970 Secuenciacin: estudio base a base-1970 Clulas madres-clonacin celular

Algunos aspectos de biotecnologa y salud

Anlisis y caracterizacin de material gentico y su funcin: Mapeo e identificacin de genes individuales Genoma, conjunto del material gentico Transcriptoma, estudio de la expresin Proteoma, estudio de la expresin y produccin de protenas Metaboloma, expresin conjunta y coordinada de genes y protenas Ingeniera Gentica (manipulacin gentica): Protenas recombinantes Terapia gnica Clulas Troncales (Stem cells) Regeneracin de tejidos Organognesis

DNA recombinante
DNA recombinante: DNA compuesto por segmentos de 2 especies diferentes: vector e inserto Vector: segmento con propiedad de replicacin (copia), seleccin (antibitico) y de ser funcional dentro de un organismo. Ejm plsmido Inserto: segmento que queremos reproducir y/o expresar. Ejm. un segmento de genoma, gen, cDNA, etc. Hospedero: organismo que sirve para que el vector e inserto sean funcionales. Ejm bacteria E. coli, levadura Saccharomyces cerevisae Clon molecular: DNA recombinante multiplicado millones de veces

Porqu clonar DNA recombinante?

Una sola molcula de DNA es invisible millones de copias para anlisis y manipulacin Se puede guardar durante aos Se puede tener un gen o segmentos, promotores, reguladores, etc. Ingeniera gentica Mutacin dirigida

Vectores y tamaos usados para DNA recombinante

vector plsmido fago csmido YAC yeast artificial chromosome BAC bacterial artificial chromoso me

origen

plsmido virus Plsmido + Cromosoma Cromoso bacterio fago de levadura ma de fago bacteria
9 - 20 kb 35 - 50 kb 100 kb - 2 Mb 100-200 kb

tamao 100 b inserto 10 kb

b= base; kb= kilobase (1,000 b); Mb = megabase (1000,000 bases)

Enzimas de restriccin
Tijeras moleculares de DNA (endonucleasas) Originalmente corta virus Cortan en sitios (secuencias) especficos

Plsmido
Hospedero

Existen en la naturaleza: codifican toxinas o dan resistencia a antibiticos

Construccin de DNA recombinante

Clonacin molecular animal, DNA genmico humano,

planta, patgenos

1) E. de restriccin corta DNA sin importar origen: plsmido (vector) y humano (inserto)

Plsmido

DNA ligasa (goma molecular)

Molcula recombinante

DNA humano

Vector (plsmido)

Transformacin (introduccin) en E.coli

Cada clula multiplica un plsmido cientos de veces y a su vez ella se divide y forma colonias de individuos idnticos (clones)

Diferentes bacterias formarn diferentes clones (coleccin de diferentes bacterias recombinantes: bancos o libreras)

DNA clonado
DNA recombinante (plsmido ms segmento humano) introducido a bacteria E. Coli Tamao mximo de inserto e plsmido: 10,000 bases (10 kb) Sembrado en placas de agar y nutrientes con antibitico (12 horas a 37C)

Cada colonia, millones de clones de 1 individuo duplicado cada 20 minutos

Complejidad del genoma y banco genmico

Genoma completo (23 pares de cromosomas) alrededor de mil libros3,200 millones de letras, 1 milln de pginas.
1 cromosoma promedio, equivalente a 30 libros grandes (30,000 pginas, 100 milllones de letras, 700 genes). Demasiado grande Necesidad de DNA recombinante: Banco genmico: Genoma en separatas. Permite anlisis detallado de regin de inters. Facilita identificacin de genes y marcadores.

1 pgina 3000 letras 1 libro grande mil pginas 3 millones letras

Fago normal

Genes de recombinacin e inmunidad

Fago Charon 40 (vector de genmico)

Tamao DNA 40-50 kb

Construccin de una librera en fagos

X 21

14
Empaquetamiento

Infeccin (transformacin)

Fagos Lambda en E. coli

Placas de lisis

Csmidos (cos + plsmido)

Para clonar fragmentos genmicos 45-50 kb en los 80s-90s

Para buscar un gen (aguja en pajar)

Banco con miles de fagos

Rplica en filtro Sonda especfica (un gen a buscar)

Hibridacin

Lavado

autorradiografa

Seleccin de positivos

Clones detectados por la misma sonda: sobrelapantes. Expanden la regin

Expandiendo ms de 50 kb en busca de un gen (ataxia de Friedreich)

Dos clones csmidos obtenidos con sonda DR47 (0.8kb).

0.8 kb en plsmido

Fujita et al., Proc. Natl Acad Sci USA 87: 1796-1800 (1990)

YAC
Yeast artificial chromosome

9K S. cerevisae: 16 cromosomas. 100 kb - 2Mb Largos insertos hasta 2 Mb. Usados en primeros aos de HGP. Inestables (segmentos de cromosomas en mismo clon) 200 K-2Mb inserto

Clonacin de 500 K alrededor de DR47 en bsqueda del gen de la ataxia de Friedreich. Fujita et al., Human Genetics 1992;89:531-538

Csmidos 50K

YACs 500K

Bacterial artificial chromosomes (BACs) usados DNA alpaca (100,000 a 300,000 bases) para clonar (100-300 kb) Fciles de hacer y manipular (extraer, secuenciar) y analizar que YACs, mas estables Usados en los ltimos aos de HGP. Todos los cromosomas humanos cubiertos en BACs

Cromosomas Artificiales de Bacteria (BACs)

Clonacin de cromosoma en diferentes clones a diferentes escalas refinadas

33,000 clones BAC por juego haploide (entre 57X) para cubrir 9598% genoma

BAC plsmido secuencia

Separatas pginas prrafos

Proyecto del Genoma Humano

Objetivo: Conocer nuestro bagaje gentico: Identificar y ubicar (secuenciar) cada uno de las 3,300000,000 de los nucletidos. Mapas genticos y fsicos: posicion y orden de cada gen y referentes (marcadores). Catalogo de todos los genes conocidos y desconocidos (la mayora). Identificar y aislar y caracterizar genes de enfermedades. Genmica => transcriptoma, protema, metaboloma. Modelos: bacterias, levaduras, Arabidopsis, drosfila, ratn.

Genoma Humano
22 pares autosomas + XX/XY 3.2 X 109 pares de bases (bp) haploide < 25,000 genes traducidos, > de 300,000 protenas. Genes segmentados => Splicing alternativo: 1 gen varias protenas segn tejido Solo 1.3% traducido a proteinas Conservacin en secuencias codantes (>>), regulatorias y no codantes (<)

Aplicacin Prctica
Identificacin de genes causales de enfermedades Conocimiento de procesos normales y enfermedades Tests de diagnstico (comparacin de genes normales vs afectados) Prevencin (multifactoriales) Conocimiento de protenas Protenas recombinantes Farmacoterapia molecular Farmacogentica Terapia gnica

Sindrome de Down
La anomala cromosmica ms comn La causa de retardo mental ms comn Deposicin placas amiloides y amasijos neurofibrilares en cortex. Fascies caracterstica Defectos esquelticos y huesos de baja densidad 50 X leucemia infantil Problemas de inmunidad Cataratas Envejecimiento prematuro Genetica 1958: trisomia crom. 21

Genes relevantes a SD en cromosoma 21

APP: b-Amyloid Prot Prec (Alzheimer familiar) SOD Sulfoxide Dismutasa extra numeraria en ratones: >> Oxidacin, envejecimiento prematuro IFNRA1,2,3: Interferon receptor A MX: mixovirus resistence cen Minibrain,SM (single-minded): genes asociados con problemas de desarrollo cerebro y performance intelectual (drosofila, ratn) APP AML1 (RUMX1): acute myeloid leukemia BACE2 SOD1, oncogene IFNRA1,2,3 CRYA1: crystallin a 1, mutaciones producen Minibrain cataratas SM AML1 ETS2:v-ets avian erythroblastosis virus CRYA1 oncogene homolog 2: ratones mutantes, ERG problemas desarrollo craneal ETS2 MX1,MX2 COL: familia de colgenos
COL18A1, 6A1, 6A2

21p 21q11.2 21q21

21q22

Exn intrn Banco de cDNA (expresin) solo genes mRNAs expresados en 1) diferentes tejidos 2) diferente expresin del mismo tejido Ejm. 1) Banco de cerebro, msculo, piel, rin

Ejem. 2) Comparacin entre msculo embrionario, fetal, adulto. Pulmn nivel del mar y a 4,000 msnm

Construccin de una librera de cDNA

Esquema de un vector de expresin procariota (E. coli) para protena recombinante

Protena recombinante

Algunas protenas recombinantes en salud humana

Insulina Interfern Alfa Factores VIII, IX de coagulacin Activador tisular del plasmingeno Hormona del crecimiento HGH Vacunas (anticuerpos y antgenos) Antitrombticos (proteasas, lipasas)

Animales transgnicos
Animales con genes o secuencias de DNA exgeno (Ejm. ratones con insulina humana). Modelos animales: comportamiento de un gen in vivo Animales lecheros: bioreactores, facilidad de extraccin. Mas difcil que bacterias pero expresin mas correcta: splicing, glicosilacin, pptido seal, etc.

Expresin de genes en leche

Produccin contnua Cambios bioqumicos de protenas correcta

Biorreactores de protenas humanas (para modificaciones qumicas que no ocurren en bacterias)

Cabra transgnica con TPA humano (tissue plasminogen activator) en leche

Toro transgnico con lactoferrina humana

Genes introducidos en plantas

Resistencia a plagas (virus, insectos) Resistencia a herbicidas (glifosato) Mejora de propiedades (sabor, vitaminas) Resistencia a estrs ambiental (sequa, heladas) Nuevos colores de flores (rosa azul) Pharming-biofarmacias (lactoferrina, anticuerpos, interleuquinas, etc.)

Falacias sobre plantas transgnicas

Alimentos transgnicos pasan ms pruebas que cualquier alimento para salir al mercado Cncer: Transgnicos NO producen cncer. No evidencia cientfica, ms bin lo contrario (maz Bt: no aflatoxina). Alergias: hasta ahora no existe un producto transgnico comercial que produzca reaccin. Antibiticos de plsmido: no producen resistencia. Nuevos vectores sin resistencia a antibiticos.

GOLDEN RICE
Arroz fuente de alimento para mayor parte de pases pobres de Asia y frica Falta Vitam. A: Ceguera y problemas corneales hasta 40% poblacin Vitamina A en cscara y partes verdes ; pero no en grano Golden rice: arroz transgnico cn Vit A en granos, meta dosis diaria de Vit A en un plato: conseguida (150ug/100g arroz) Profesores Peter Beyer (U. Freiburg, Alemania) e Ingo Portrykus (Inst Tec. Fed Suiza), con compaa Syngenta (patentado), donacin a pases en desarrollo.

Terapia gnica
Modificar o activar la expresin de un gen endgeno mediante la introduccin de una versin modificada in vitro
Ataca causa primaria vs. sntomas Especificidad en celula o tejido blanco Localizado vs. sistmico Rangos de duracin ms largos Varias estrategias dependiendo de enfermedad

Estrategia de reemplazo de gen mutante

Introduccin de gen normal en celulas mutantes

Incorporacin de gen por crossing over

Celulas con funcin normal

Leber congenital amaurosis, terapia gnica experimental abril 2008, recuperacin de ceguera total a caminata en laberinto-movimiento de mano.

Terapia Gnica

Trends in biotechnology, March 2000 (18): 119-128

Terapia por RNA de interferencia (RNAi) Premio Nobel Medicina 2006

Derivado de terapia gnica, RNA doble inactiva expresin de gen anormal

La Promesa de las clulas madre (Stem cells)

Bsqueda de frmacos y tests de toxicidad

Estudios del control de genes y desarrollo

Clulas cultivadas troncales multiplicadas in vitro Clulas para regenerar tejidos

mdula sea

neuronas

msculos

pncreas

Clulas madre
Clula madre: se reproduce y da lugar a diferentes tipos celulares in vitro Diferencia con clulas embrionarias: provienen del mismo paciente (evita rechazo). Corrientemente usado en linfomas y leucemias con clulas de mdula sea o cordn umbilical. Para reemplazar clulas anormales degenerativas (Alzheimer, Parkinson, diabetes), proliferativas (tumores, cncer), accidentes (tetraplgicos) o intoxicaciones. Organognesis: formacin de rgano o parte de funcin a partir de clulas madre. Todava en experimentacin en mayora de pases. China turismo mdico en clulas madre. Per: INCOR infartos OK, compaas? (a probar)