Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Journal of Investigative Dermatology 2011;131:338348

Investigacin y Desarrollo, Beiersdorf AG, Hamburgo, Alemania Laboratorio de Cronobiologa, Charit 'Universita Berln, Alemania

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Variaciones diarias en el medio ambiente

Ciclos de luzoscuridad

Temperatura

Disponibilidad de alimentos

Periodicidad - Evolucin
Ritmo circadiano (cerca da 24 horas) Reloj circadiano

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Ritmo circadiano
Endgenos Persisten en condiciones de laboratorio, aun sin estmulos externos Modificables por seales exgenas Origen: Clulas ms primitivas Proteger la replicacin del ADN de la alta radiacin ultravioleta durante el da Hongo Neurospora

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Reloj maestro
Ncleo supraquiasmtico (NSQ) - Hipotlamo

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Reloj maestro
Ncleo supraquiasmtico (NSQ) - Hipotlamo
Clulas ganglionares con un pigmento melanopsina Tracto retinohipotalmico llevan informacin al NSQ Glndula pineal: hormona melatonina Si no ha sido suprimido por la presencia de luz brillante Melatonina baja durante el da y aumenta durante la noche

Introduccin Reloj maestro

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Relojes perifricos

Zeitgebers
Luz, temperatura, alimentos, frmacos

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Nivel molecular
Clulas autnomas Modelo de retroalimentacin molecular

Introduccin
Nivel molecular

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Factores de transcripcin del reloj circadiano CLOCK: ciclos de produccin del aparato locomotor circadiano kaput BMAL1: cerebro-msculos de hidrocarburos arilo receptor nuclear
translocator (ARNT)-like protena-1

Introduccin
Nivel molecular

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Activa la transcripcin de gen periodo1-3 (Per1-3) y criptocromos 1 y 2 (Cry1 y Cry2)

Introduccin
Nivel molecular

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

24 horas

PER y CRY llevan a la represin de CLOCK/BMAL1 y la inhibicin de su propia transcripcin

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Piel: Barrera entre cuerpo y medio ambiente

Radiacin UV Temperatura
Recuperacin de la barrera Prdida de agua transepidrmica Produccin de sebo pH y temperatura de la piel

Relojes perifricos se han demostrado en piel murina y en fibroblastos de piel humana Los queratinocitos de la epidermis poseen un reloj circadiano autnomo? Cmo este reloj puede regular la fisiologa de la epidermis?

Introduccin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Clulas para estudiar la fisiologa epidrmica controlada por el reloj circadiano Lneas de clulas inmortalizadas
Lnea de clulas epidrmicas de queratinocitos humano adulto bajo calcio temperatura (HaCaT) In vitro: se deriva de piel adulto normal y refleja fielmente el comportamiento de queratinocitos

Materiales y mtodos
Cultivo celular:

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Queratinocitos normales epidrmicos humanos de prepucio neonatal Queratinocitos HaCaT

Prodecimientos:
Inmunohistoqumica

PCR
Bioluminiscencia

Materiales y mtodos

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Bioluminiscencia: produccin de luz de ciertos

organismos vivos

Disearon que los queratinocitos HaCaT presentaran un gen que produce luciferasa + genes del reloj

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional

1 - Genes del reloj maestro: Inmunocitoqumica: anticuerpos CLOCK: ncleo PER1: citoplasma y ncleo Co-tincin del ncleo: DAPI (406-diamidin-20-phenylindol-dihydrochlorid)

Queratinocitos HaCaT

Queratinocitos neonatal primario

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional 2 - Transcripcin rtmica de los genes del reloj HaCaT + lentivirus Luciferasa + fragmento del gen del reloj Bmal1 Los ritmos circadianos se sincronizan con dexametasona y la actividad rtmica luciferasa

Amortiguacin de la oscilacin: desincronizacin progresiva de queratinocitos individuales

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional 2 - Transcripcin rtmica de los genes del reloj

Queratinocitos HaCaT sincronizan con dexametasona - cosecha el ARN total - PCR transcriptasa inversa Se detectaron ritmos circadianos de Rev-Erba y Per3: alta amplitud Per1, 2 o Cry1, 2: menores oscilaciones de amplitud

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional 3 - Modificacin de la dinmica del reloj

Farmacolgico: Interferencia con la fosforilacin de las protenas PER Inhibidores CKI-7 y DMAT El ritmo circadiano se alarga de manera significativa y dependiente de la dosis

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional

Farmacolgico: Interferencia con la degradacin de protenas CRY Interferencia de ARN - Fbxl3 El ritmo circadiano se alarga de manera significativo y sustancial

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional

ARNsh Silenciamiento de Bmal1 resultando en una revocacin completa de la ritmicidad

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Localizacin correcta de la protena del reloj Transcripcin rtmica de genes del reloj
Alteraciones en la dinmica circadiano del reloj (gentica, farmacolgico)

Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional, con propiedades indistinguibles de otros relojes perifricos

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos HaCaT

Temperatura corporal

Sincroniza los relojes perifricos

Conduce la expresin de genes circadianos en fibroblastos humanos

Variaciones de temperatura de 1-2K.

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos HaCaT

Los ritmos circadianos de Q-HaCaT se sincronizaron con dexametasona bioluminiscencia Bmal1 a y c -- ciclos de temperatura de 24 horas (calentamiento 12 horas 37C y fro 12 horas 33C b -- temperatura constante 37C b y c -- las clulas fueron sincronizadas 8,5 horas de diferencia

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos HaCaT

Bmal1: adopt una relacin estable con el ciclo de la temperatura y mayor amplitud (solo Dex)
Cuando la Temp fue constante las oscilaciones persistieron similares a los ciclos anteriores

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos HaCaT

Comprobar b.- HaCaT Dex 0 y - 8,5 horas + temperatura constante c.- Ciclos de temperatura 24h: sincronizacin gradual con la temperatura

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Los ciclos de temperatura puede arrastrar los relojes circadiano en los queratinocitos

La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos HaCaT

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

3.- Arrastre de la temperatura aumenta la expresin circadiana de genes del reloj

Queratinocitos HaCaT:
Ciclos de temperatura por 2 das y 1 da de temperatura constante Cosecha el ARN total cada 4 horas - PCR transcriptasa inversa

Resultados
Genes del reloj

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Las amplitudes de los ritmos arrastrados por la temperatura fueron sustancialmente mayores Persistieron luego con temperatura constante Diferencias por el ritmo de expresin de acuerdo al ritmo circadiano (CRY - BMAL1)

Resultados
Genes de salida
Controlados por el reloj

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Significativa expresin circadiana de factores de transcripcin Dbp: objetivo directo del reloj circadiano. Insig2a: gen implicado en la homeostasis del colesterol Actina c-Myc: oncogen (ritmos solo con temperatura constante) Gen receptor LDL y HMGCR: homeostasis del colesterol (ritmos solo con los ciclos de temperatura)

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

4.- Queratinocitos primarios de prepucio neonatal

Limitaciones clulas inmortalizadas Interrumpe el control del ciclo celular Limitada capacidad de diferenciacin Ciclos de temperatura Per2, Per3, Ap-Erba, Insig2a: similar HaCaT

Resultados

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Este reloj se comporta de forma muy similar al reloj HaCaT Queratinocitos epidrmicos primarios poseen un reloj circadiano perifrico
Algunos genes del reloj identificadas en HaCaT pueden ser validados en queratinocitos primarios

Analizar la expresin de genes para identificar los procesos fisiolgicos que son controlados por el sistema circadiano

Discusin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Queratinocitos HaCaT como un nuevo sistema modelo para estudiar el control circadiano de la fisiologa epidrmica

Abren la puerta del estudio de la relacin molecular entre el reloj circadiano y la fisiologa de la epidermis

Temperatura acta como potente Zeitgeber del reloj

Las limitaciones de los modelos in vitro para el estudio de los ritmos circadianos puede por lo menos superar los ciclos trmicos. Herramienta viable: resultados al comparar con queratinocitos primarios

Discusin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Posible papel de los genes controlados por el reloj en la fisiologa epidrmica Colesterol: Insig2a, HMGCR, gen receptor de LDL Esencial para diferenciacin / proliferacin de queratinocitos Formacin de la capa crnea Se libera a partir de queratinocitos cornificados para formar la barrera de lpidos epidrmica

Discusin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Posible papel de los genes controlados por el reloj en la fisiologa epidrmica Oncogn c-Myc : Induce la proliferacin de clulas madre epidrmicas Estimula la diferenciacin terminal de queratinocitos

Dbp: Involucra a la familia del citocromo P450 Metabolismo Vit D en los queratinocitos

Conclusin

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Modelo para el estudio los ritmos circadianos en los queratinocitos epidrmicos, que facilitara la investigacin en la regulacin circadiana de la fisiologa epidrmica

Reloj circadiano de la epidermis, podra dar lugar a la administracin de frmacos optimizados y sofisticados para el tratamiento de enfermedades de la piel